Штамм бактерий rнizовiuм меlilотi для производства удобрения под пажитник

 

Использование: микробиологическая промышленность, производство микробиологических средств повышения урожайности бобовых культур. Сущность изобретения: штамм бактерий Rhizobium meiiloti выделен из клубеньков пажитника, депонирован в коллекции ВНИИСХМ под № 2502. При культивировании штамма на жидкой среде, содержащей гороховый отвар, сахар, сернокислый аммоний, однозамещенный и двузамещенный фосфорнокислым калий, сернокислый аммоний, сернокислый магний , углекислый кальций, в течение 18-36 ч при аэрации получают культуральнуго жидкость с титром 6-9 млрд/мл. Полученную культуральную жидкость вводят в герметично закрытый торф из расчета 0,3-0,5 млрд/г, культуру подращивают, выдерживая инокулированный торф при 15-20°С в течение 3-5 сут, полученный таким образом препарат повышает урожай зеленой массы пажитника в среднем на 21,7 ц/га или на 60,9%, зерна на 5,1 ц/га (64,5%) по сравнению с известным штаммом 425 а. 6 табл. пзц

СОЮЗ COHETCKVIX

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГOCilATEHT СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ

К ПАТЕНТУ (21) 4928428/13 (22) 17,04,91 (46) 30.03,93. Бюл. ¹ 12 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии (72) А.T,HoýèêoBà, В.Л.Князева, А.П,Кожемяков, Н.M.Лазарева, Н.А.Проворов. и Н,Г.Орищенко (73) Всесоюзный научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии (56) Авторское свидетельство СССР

¹ 549454, кл. С 05 F 11/08, 1975.

Авторское свидетельство СССР

¹ 881095, кл. С 05 F 11/08, 1980.

Авторское свидетельство СССР № 1036718, кл. С 05 F 11/08, 1982. (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ RHIZOBiUM

MELlL0Tl ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА УДОБРЕНИЯ ПОД ПАЖИТНИК (57) Использование: микробиологическая промышленность, производство микробиоИзобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и биотехнологии, в частности к микробиологическим средствам повышения урожайности бобовых культур.

Цель изобретения — получение нового штамма Rhizobium meliioti с высокой эффективностью азотфиксации в симбиозе с пажитником, что позволяет получить более высокий по сравнению с известными штаммами урожай зерна и зеленой массы пажитника и увеличить содержание в нем белка, а также удовлетворяющего технологическим

„„ !Ц„„18О6124 АЗ

tsiis С 05 F 11/08, С 12 N 1/20 логических средств повышения урожайно. сти бобовых культур. Сущность изобретения: штамм бактерий Rhizobium meiiloti выделен из клубеньков пажитника, депонирован в коллекции ВНИИСХМ под ¹ 2502.

При культивировaíèè штамма на жидкой среде, содержащей гороховый отвар, сахар, сернокислый аммоний, однозамещенный и двузамещенный фосфорнокислый калий, сернокислый аммоний, сернокислый магний, углекислый кальций, в течение 18-36 ч при аэрации получают культуральную жидкость с титром 6-9 млрд/мл. Полученную культуральную жидкость вводят B герметично закрытый торф из расчета 0,3-0,5 млрд/г, культуру подращивают, выдерживая инокулированный торф при 15-20 С в течение 3-5 сут, и о луч ен ны и таким образом препарат повышает урожай зеленой массы пажитника в среднем на 21,7 ц/га или на 60,9%, зерна на 5,1 ц/Ia (64,5%) по сравнению с известным штаммом 425 а.

6 табл.

Я и треоованиям п ром ы шле нного и роизводства.

Я.

В качестве такого штамма предлагается штамм RhIzobium meliioti 2502.

Бактерия штамма R.meliloti 2502 выделены из клубеньков пажитника сенного сортообразца из ВИР, произраставшего в

Курской области на выщелоченном черноземе. Идентифицированы по определителю

Берги, Штамм R,meliloti 2502 депонирован и хранится во Всесоюзной коллекции клу1806124 беньковых бактерий ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии под N 2502,, Морфолого-культуральные признаки штамма R,meltloti 2502.

Вегетативные клетки на косом бобовом агаре при 28"С и рН 6,8-7,0 в 2-суточной культуре имеют форму коротких палочек с зернистой протоплазмой и закругленными концами, 1,2-1,8х0,6-0,7 мкм, грамотрицательные, до 24 часов подвижные, затем по мере старения — к 48 часам — утрачивают подвижность, перитрихи, Быстрорастущая кул ьту ра.

Образование специализированных клеток. При старении культуры на бобовом агаре с рН 6,8-7,0 и при t 28 С в возрасте 3-х суток и более образуются бактероиды ветвистой формы.

Характеристика колоний на плотной среде, 1, Гороховый агар, г/л: горох — 100,0; сахароза — 20,0; агар — 20,0; рН среды 6,8, При 28 С штрих 3-суточной культуры обильный, беловатый, слизистый; слабо-выпуклый, стекающий, блестящий. Колонии появляются на 3 сутки; на 5 сутки имеют размер 1-1,5 мм, однотипные, круглые, слабо-выпуклые, с ровными краями, слизистые, $-формы, беловатые.

2. Люпиновый агар, г/л: К2НРОд — 0,5;

КНзРОа — 0,5; М9$0дх7НгΠ— 0,2; NaCl — 0,2;

CaS04 — 0;1; (NH<)zMo04 — следы; маннит—

20,0; люпиновая мука — 10,0; агар — 20,0. рН среды 6,8-7,0, При 28 С штрих 3-х суточной культуры обильный, беловатый, слизистый, слабовыпуклый, сильно-стекающий, блестящий. При 28 С колонии появляются на 3-и сутки, на 5-е сутки имеют размер 2-3 мм, однотипные, круглые, выпуклые, с ровными краями, слизистые, S-формы, беловатые, 3. Маннитно-дрожжевой агар (МДА), г/л: маннит — 10,0; K2HP04 — 0,5;

MgSO

При 28 С штрих 3-суточной культуры обильный, беловатый, слизистый, слабо-выпуклый, сильно-стекающий, блестящий. При

28 С колонии появляются через 3-е суток; на 5 сутки имеют размер l-1,5 мм, однотипные, круглые, выпуклые, с ровными краями, слизистые, S-формы, беловатые.

Рост в жидкой среде, Молоко с лакмусом при 28 С не пептонизирует, на вторые сутки слабо подщелачивает; интенсивность подщелачивания с возрастом не меняется. На поверхности лакмусового молока через 3-е суток образуется слизистая прозрачная зона, которая достигает максимальных размеров — 5 мм— через 15 суток.

Физиолого-биохимические свойства.

Симбионт. Макросимбионт — бобовое растение пажитник.

Отношение к; а) кислороду — аэроб, б) Т : максимальная 40 С; минимальная

10 С; оптимальная — 26-30 С, в) рН: максимальйая 7,5; минимальная

5,5; оптимальная 6,8-7,0.

Источники углерода

9 е глюкоза Ак (-) галактоза Ак (-) сахароза Ак (-) 15 лактоза Ак (-) маннит Ак (-) сорбит Ак (-) рамноза Ак (-) ксилоза Ак (-) 20 мальтоза . Ак (-) декстрин Ак (-) клетчатка крахмал

Жидкая среда Нориса, Т - 28 С, Источники азота йайОз + (NH<)gSOq + тироэин +

30 МПА +

Фиксирует азот из воздуха в симбиозе с пажитником, Другие характерные физиологические особенности, 35 Желатину не разжижает, Штамм не патогенен. См. "Каталог культур Всесоюзной коллекции непатогенных микроорганизмов", М,, "Наука", 1976, с. 87.

Штамм 2502 хранится на люпиновом агаре указанного выше состава, рН 6,8-7,0, при 4-5 С и пересевается 1 раз в 6 месяцев, Условия проведения вегетационных и полевых опытов.

Стерильный микровегетационный опыт

45 проводят в стеклянных цилиндрах обьемом

800-900 см с 50 r вермикулита. В цилиндры з, добавляют l10 мл среды Красильникова-Кореняко следующего состава (г/л): К НРО4—

1,О; MgSO

KJ — 0,5; NaBr — 0,5; Zn$04x7HzO — 0,3;

А!2($0 )зх18Н20 — 0,3; Mn$04 — 0,2; Cu$04—

0,2. Стерилизация в автоклаве, Семена па55 житника сорта Нахичеванская шамбала стерилизуют концентрированной серной кислотой в течение 4-х минут, промывают стерильной водой и раскладывают на увлажненные стерильной водой бумажные фильтры в чашках Петри для прорастания. Через

1806124

10

35

45

55 двое суток проращивания в асептических условиях раскладывают в цилиндры по 2 проростка, Опыты ставят в 10-ти кратной повторности. Клубеньковые бактерии для инокуляции растений выращивают на косом гороховом агаре в пробирках в течение 3-х суток при 28 С и смывают стерильным раствором микроэлементов по 1 мл, Через двое суток после посева семян в каждый цилиндр с растениями вносят по 10 мл инокулюма, имеющего концентрацию

10 клеток в 1 мл, Растения выращивают в фитотроне при 22-24"С до стадии цветения (45 суток), Вегетационные опыты проводят в сосудах с 6 кг дерново-подзолистой почвы с внесением солей по прописи Прянишникова; но без азота, r/êã почвы: KCI — 0,15; MgSO4—

0,06; СаНРО4 — 0,172; MnS04 — 0,003; барная кислота — 0,003; (М Н ) МоΠ— 0,001. Повторность опыта 4-х кратная. Используется районированный сорт пажитника Нахичеванская шамбала. Для инокуляции семян пажитника чистую культуру бактерий выра° щивают на скошенном гороховом агаре указанного выше состава в течение 3-х суток.

Культуру в пробирках с титром 3-5 млрд смывают водопроводной водой, затем суспензию наносят на семена пажитника, разложенные в лунки, сделанные в почве каждого сосуда, В сосуд вносят 10 клеток.

Полевые опыты проводят в районах, рекомендованных:для возделывания пажитника, на почвах, типичных для этих районов.

Используется агротехника выращивания пажитника, принятая в каждом конкретном районе, Доза препарата 200 г на гектарную норму семян, B опытах используется районированный сорт пажитника Нахичеванская шамбала либо сортообразец из коллекции ВИЛР. Повторность опытов 4-х кратная. В полевых опытах семена па>китника обрабатывают торфяным препаратом ризоторфином, изготовленным на опытных штаммах.

Способ внесения препарата: 200 г ризоторфина разводят s 1 л водопроводной воды и, не давая суспензии отстаиваться, наносят ее на гектарную норму семян. 3атем семена тщательно перемешивают до равномерного распределения препарата, Обработанные ризоторфином семена высе. вают в тот же день во влажную почву. Площадь опытных делянок 2-10 м .

Примеры конкретного использования штамма.

Эффективность симбиотической азотфиксации у штамма 2502 в сравнении с известными штаммами 425а и 282 определена, в вегетационных и полевых опытах по величине урожая сухой зеленой массы и зерна пажитника и накоплению в них азота или белка.

Пример 1. Данные, полученные в стерильном вегетационном опыте, поставленном по описанной выше методике, приведены в табл.1.

Из табл,1 видно, что симбиоз клубеньковых бактерий донника штамма 282 с пажитником был неэффективным, образованные ими мелкие, белые клубеньки не снабжали растения дополнительным азотом, в результате чего продуктивность пажитника в этом варианте не увеличивалась, Наиболее эффективным симбионтом пажитника являются бактерии штамма 2502, при инокуляции которыми урожай зеленой массы растений был на 59 выше, чем при использовании штамма 425а.

Пример 2. Аналогичные результаты, полученные в вегетационном опыте, также поставленном по описанной выше методике, приведены в табл,2.

Данные табл.2 подтверждают, что клубеньковые бактерии тригонеллы штамма

2502 обеспечивают наиболее высокую эффективность азотфиксации в симбиозе с пажитником, в результате чего урожай зеленой массы растений, инокулированных этим штаммом, на 44,4 выше, чем у растений, бактерлзованных штаммом 425а, Содержание общего азота у растений, инокулированных штаммом 2502, также выше. В итоге общее накопление азота растениями этого варианта более чем в 2 раза выше, чем при использовании штамма 425а, Продуктивность пажитника, бактеризованного штаммом 282, была на уровне неинокулированных растений.

Приведенные материалы свидетельствуют î достаточно высоком уровне специ фичности пажитника к микросимбионтам из вида R.melilotl. Наиболее эффективный симбиоз выявлен при инокуляции пажитника штаммом 2502, выделенным из клубеньков это о жэ вида бобовых растений, Значительно меньшая продуктивность наблюдается у растений, инокулированных штаммом 425а, выделенного из клубеньков люцерны; симбиоз пажитника со штаммом 282, выделенным из клубеньков донника, неэффективен.

Ввиду этого в дальнейшие опыты штамм 282 не включался, Пример 3. Эффективность штамма

2502 определена в полевых опытах по конкурсному испытанию штаммов клубеньковых бактерий в научных учреждениях

Географической сети опытов с азотфиксиру- ющими микроорганизмами в 1983-1988 r.r.

Примеры конкретных полевых опытов, где

1806124 сравнивается штамм 2502 с известным штаммом 425а, приведены в табл,3.

Как показывают данные табл,3, штамм

2502 обеспечивает высокую прибавку урожая зерна и зеленой массы пажитника, а 5 штамм-прототип 425а в этих условиях неэффективен, Сводные материалы по результатам испытаний эффективности штамма 2502 в сравнении с известным штаммом 425а в по- 10 левых опытах представлены. в табл.4.

Данные табл.4 показывают, что предлагаемый штамм 2502 отличается от известного штамма 425а более высокой и стабильной эффективностью. Средняя прибавка урожая 15 зерна и зеленой массы пажитника от инокуляции предлагаемым штаммом составляет

5,1 ц/га и 21,7 ц/га соответственно, что на

4,3 ц/га (53,4%) и 15,9 ц/га (45,1%) соответственно превышает урожай, полученный 20 при использовании штамма 425 а, который лишь в одном из шести опытов(М 5) обеспечил достоверное повышение урожая, Высокая эффективность симбиоза пажитника с бактериями штамма 2502 обеспе- 25 чивает также улучшение качества урожая за счет более интенсивного накопления в нем белка, содержание которого в зеленой массе растений в этом варианте на 4,19% и в зерне на 5,06% выше, чем при применении 30 штамма 425а (табл, N 5).

Пример 4. Клубеньковые бактерии тригонеллы штамма 2502 обладают хорошей технологичностью и по основным технологическим параметрам не уступают 35 бактериям штамма 425а, т.е, интенсивно размножаются на жидких регламентных средах, дают высокие титры в торфяном препарате (ризоторфине), Об этом свидетельствуют данные табл.6. 40

Технология приготовления препарата на основе штамма R,meiiloti 2502, Посевную культуру выращивают на качалке в колбах или 5-ти литровых бутылях в течение 2-х суток на среде следу|ощего со- 45 става (мас.%): гороховый отвар — 10,0; сахар (пищевой) — 1,0; (ИН )2$04 — 0,05; KHgPO<—

0,05; К2Н РО х3 Н20 — 0,05; IM9 S04x7Hz 0—

0,02; СаСОз — 0,1; вода водопроводная — до

100,0; рН после стерилизации (0,1 ати, 30 50 мин) 6,8-7,0. Титр клеток 8-11 млрд/мл. Посевную культуру используют для приготовления жидкой рабочей культуры. Ее готовят в 5-ти литровых бутылях или ферментаторах на среде следующего состава 55 (мас.%): кукурузный экстракт — 1.0; меласса—

2,0; (NHp)ISO< — О, 1; К HYPO< — 0,02 5;

К2НРО4хЗН20 — 0,025; MgSOax7H20 — 0,02;

СаСОз — 0,1; вода водопроводная — до 100;О. рН после стерилизации 6,8-7,0.

Бутыли и ферментаторы засевают Iloсевной культурой клубеньковых бактерий в количестве 5%, Бутыли встряхивают на качалке в течение 40-48 часов. В ферментаторах бактерии выращивают 18-36 часов при аэрации 0,7-1,5 об/мин под избыточным давлением 0,3-0,5 атм при температуре

28-30 С, Титр 6-9 млрд/мл. После микробиологического контроля культуральную жид- . кость из бутылей или ферментаторов— инокулюм — используют для смешивания с торфом.

Подготовка торфа.

Размолотый низинный торф, нейтрализованный мелом до рН 6,8-7,0, с влажностью 30-40% в полиэтиленовых пакетах по

200-400 r стерилизуют гамма-облучением при дозе 2,5 Мрад, Стерильный торф s пакетах инокулируют иньекцией смеси: культуральная жидкость+ меласса (6%) из расчета исходного титра бактерий в торфе 0;3-0,5 млрд/г торфа и влажности 45-60%, Затем пакеты загружают в специальные смесители, при вращении которых перемешивается их содержимое, Культуру в торфе подращи- ва оТ, выдер>кивая пакеты при температуре

15-20 С 3-5 суток.

Ризоторфин хранят при температуре 3о

8 С в темном сухом помещении отдельно от ядохимикатов, Характеристика готового продукта.

Ризоторфин на предлагаемом штамме представляет собой по внешнему виду увлажненную сыпучую массу темного цвета, без запаха, не растворимую в воде. Влажность готового препарата 50-55%. Ризоторфин содержит 3-6 млрд клубеньковых бактерий в 1 г торфа. Срок годности препарата 6 месяцев со дня изготовления. Расход. препарата 200 r на гектарную норму семян.

Таким образом, проведенные исследования показали, что предлагаемый штамм

2502 является высокоэффективным микросимбионтом пажитника, стабильно повышает урожай зеленой массы в среднем на

21,7 ц/га или на 60,9%, и зерна на 5,1 ц/га (64,5%), что на 15,9 ц/га (45,1%) и 4,3 ц/га (53,4%) соответственно превышает.прибавку урожая от штамма 425а. При использовании для инокуляции. штамма 2502 содержание белка в зеленой массе растений увеличивается на 5,12% и в зерне на

5,56%, что на 4,19% и 5,06% соответственно выше, чем от известного штамма. Штамм

2502 обладает хорошими технологическими свойствами.

По решению Межведомственной комиссии Географической сети опытов по селек1806124

Таблица 1

Эффективность симбиотической азотфиксации штаммов 282, 425а и 2502 в симбиозе с пажитником

П р им е ч а н и е . Р— 48%; HCPQ5 — 88 мг/сосуд

Ь .

Таблица 2

Эффективность симбиотической азотфиксации штаммов 282, 425а и 2502 в симбиозе с пажитником в вегетационном опыте

П р и м е ч а н и е, Р— 3,9%;НСРоь — 0,3 г/сосуд ции азотфиксирующих микроорганизмов от

16 января 1990 r штамм В meliloti 2502 рекомендован для использования в промышленности при выпуске нитрагине под пажитник.

Формула изобретения

Штамм бактерий Rhizobium melilotl

ВНИИСХМ % 2502 — для производстваудобрений под пэжитник, 1806124

Таблица 3

Условия проведения полевых опытов и эффективность штаммов клубеньковых бактерий

Rhlzoblum лтеИоб 425а и 2502

Уч еждение, г е и ове ен опыт

Показатели *

Тими язевская СХА . Нахичеванская КЗОС

1987 млрд/r

Серо-коричневая

Год .

Доза препарата на 1 га

Почва

Нахичеванская шамбала

Таблица4

Эффективность нового втанна клубеньковых бактерий тригонеллы 2502 и втаина прототипа 425а в полевых опытах с павитникои

Прибавка уроках от втан на 2502 в сравнении с втаннэн 425 а

Уповай е конт ропе, ц/га

Прибавка трован при использовании втанновСорт па- Вид проиитника дукции

Статистическая обработка, В

РФ НСРез ц/га

4,4 1,3

IRI Учреадение> где проведен опыт цlга 8

425а 2502 425е 2502 цlга 8

1 Тиннрязевс- Сортообкая СХА разец иэ

8HllP

5,3 11,8 69,7

4,4 Sji9

7,6

0,9

Верно

5,0

6,4 2,6

53,В

5,0 0 53,8

2 Нахнчеванс- Нахнчекая КЭОС ванская ванбала

9,3

3 «н» н

4,9,; 21,4 70,0

5,1 16,6 64,5

11,7 5,1 28,4

3,4

4,3

9,6

48,6

53,4

23,Э

6,3 2>1

° I

7,0

8,0

41>2

1,5

0,8

2,1

В среднеи

4,6 6,3

Сор тообразец из

ВНЛР

Нахичеванская ванбала

Зеленая масса

Тинирязевсская CXA

58 113 а

383 124 327 324 8%4

53 0

20,3

5 Нахнчевансскал КЗОС ь3,0

5,8

II»

9,9" 68,9

15,8 60,9

17,8

15,9

20,8

21, 7

6,5 9,2

59,0

45,1

Э0,2

36,6

В среднеи

Сорт пажитника повторность площадь делянки, м2

Внесены минеральные удобрения

Способ возделывания

Вид продукции

Урожай в контроле, ц/га

Прибавка урожая 425а от штаммов, ц/га 2502

Статистическая р% об аботка НСРо5 ц/ra

1984

200 г с титром 4-6

Дерново-подзолистая хорошо окультуренная °

Сортообразец ВИЛР

10

p60Ê6O беэ орошения зерно

7,6

0,9

5,3

4,4

1.3

p90Ê90 c орошением зеленая масса

30,2

3,0

2 0,8

6,5

9,2

14

180б124

13

Таблица 5 ие штаммов Rhizobium meliloti 425а и 2502 на содержание белка в урожае (полевые опыты) истика штаммов R.melilotl 425а и 2502

Составитель А.Новикова

Редактор А.Павловская Техред M. Моргентал Корректор И,Шмакова

Заказ 962 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101