Питательная среда для диагностики бруцеллеза

 

Использование: ветеринарная и медицинская микробиология, бактериологическая диагностика бруцеллеза. Сущность изобретения заключается в том, что в питательную среду в качестве белковой основы (источника аминного, общего азота) вводится ферментативный гидролизат из отходов производства мясокомбината - плацентарно-эмбрионально-маточных тканей от коров и свиней как в отдельности, так и в виде их смеси при следующем соотношении ингредиентов , мае. %: гидролизат плацентарноэмбрионально-маточных тканей (с сухим остатком 9-10%) 1.2-1,6; натрий хлористый 0,4-0,6; глюкоза медицинская 0,9-1,1; глицерин 2,75-3,25; агар-агар 1,75-2,25; вода дистиллированная остальное. 4 табл,

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (st)s С 12 N 1/20

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

1 (21) 4934591/13 (22) 05.05.91 (46) 30.03.93. Бюл. М 12 (71) Всесоюзный научно-исследовательский ветеринарный институт (72) H.Ê.Màìëååàà„Ì.Ï.Toðáèíà и Г.А.Белозерова (73) Всероссийский научно-исследователь. ский ветеринарный институт (56) Лабораторные исследования в ветеринарии. Справочник. М„ Агропромиэдат, 1986, с. 60-85. (54) ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ БРУЦЕЛЛЕЗА

Изобретение относится к ветеринарной и медицинской микробиологии и может быт использовано для бактериологической диагностики бруцеллеза человека и животных, Целью изобретения является улучшение ростовых свойств питательной среды для бруцелл, удешевление состава среды и расширение сырьевой базы для приготовления основы питательной среды.

Это достигается путем применения в качестве основы питательной среды ферментативного гидролизата из плацентарноэмбрионально-маточных тканей (отходов производства. мясокомбинатов) от убойного крупного рогатого скота и свиней или смеси гидролизатов этих тканей, которые составляют в общем объеме убойного скота мясокомбинатов от 80 до 907. В питательную среду для выращивания бруцелл в качестве,, Я2„, 1806186 АЗ (57) Использование: ветеринарная и медицинская микробиология, бактериологическая диагностика бруцеллеза. Сущность изобретения заключается в том, что в питательную среду в качестве белковой основы (источника аминного, общего азота) вводится ферментативный гидролизат из отходов производства мясокомбината — плацентарно-эмбрионально-маточных тканей от коров и свиней как в отдельности, так и в виде их смеси при следующем соотношении ингредиентов, мас, : гидролиэат плацентарноэмбрионально-маточных тканей (с сухим остатком 9 — 10 ) 1.2-1,6; натрий хлористый

0,4-0.6; глюкоза медицинская 0,9-1,1; глицерин 2.75-3,25; агар-агар 1,75-2,25; вода дистиллированная остальное. 4 табл. белковой основы вводится ГПЭМ вЂ” гидролиэат из плацентарно-эмбрионально-маточных тканей стельных коров и свиней (в отдельности или вместе взятых в равном объеме) при следующем оптимальном соотношении ингредиентов, мас. ;

Гидролизат плацентарно-эмбриональноматочный (сухой остаток

9 — 10 ) 1,4

Натрий хлористый, хч 0,5

Глюкоза медицинская 1,0

Глицерин 3,0

Агар-агар 2,0

Вода дистиллированная Остальное

Среду кипятят 5 — 10 мин, фильтруют, разливают в пробирки, колбы, стерилизуют, рН готовой среды составляет 7,2 — 7,3.

Предлагаемый гидролизат, являясь продуктом глубокого расщепления белков, со1806186 держит широкий спектр аминокислот, играющих важную роль в метаболизме 6руцелл, являющихся .аминогетеротрофными микроорганизмами. Кроме. того, указанный гидролиэат является источником стимулятора 5 роста бактерий за счет содержания в своем составе биологически активных веществ плацентарной ткани.

Пример 1, Гидролизат плацентарноэмбрионально-маточный готовят следую- "0 щим образом: ткани плаценты, матки, мягких тканей эмбриона, полученные на . мясокомбинате после убоя животных (не позднее 2 — 3 часов) подвергают фермента тивному гидролизу, к 1 кг измельченной на мясорубке ткани добавляют 1,5 л кипящей воды, перемешивают, подщелачивают 20 раствором щелочи (едкий натр) до рН 8,0, подогревают до 70 С. В отстуженную до 40—

45 С смесь добавляют 150 г фарша подже- 20 лудочной железы или 20 г панкреатина с активностью 45 ЕД, добавляют 22,5 мл хлороформа, емкость герметично закрывают и ведут гидролиз при периодическом перемешивании 4 — 5 суток при T=43 С, поддер- 25 живая рН смеси на уровне 7,4-7,6, По окончании гидролиза гидролизат переливают в емкость из нержавеющей стали, кипятят 15 мин. при рН 5.0, отстаивают, фильтруют, стерилизуют, подвергают лио- 30 фильному высушиванию. В гидролизате определяют общий и аминный азот, уровень пептидов, Готовый продукт должен соответствовать биохимическим показателям, отражен- 35 ным в табл. 1, из которой. видно, что гидролизаты из плацентарно-эмбрионально-маточных тканей коров и свиней мало отличаются друг от друга, а по величинам общего и аминного азота превосходят про- 40 тотип — гидролизат кильки.

Пример 2. Для изучения ростовых свойств питательной среды для бруцелл на основе гидролизата плацентарно-эмбрионально-маточного проводились опыты по 45 титрации компонентов питательной среды в зависимости от роста микроорганизмов— известных вирулентных тест-штаммов бруцелл (3 вида рода"бруцелл, 7 биотипов), пол- ученных из ГИСК им. Тарасевича, типичных 50 по морфологическим, культурально-биохимическим и серологическим свойствам: бруцелла абортус 544; бруцелла суис 1330; бруцелла мелитензис 25; (референтные штаммы) и бруцелла абортус штаммы 271- 55

2803; 276-720; 275-138; 280 — 381-К-4 (полевые штаммы).

Для приготовления микробных взвесей суточные культуры тест-штаммов смывали

0,9 раствором хлористого натрия, доводили взвесь до содержания 1 млрд/мл микробных клеток по оптическому стандарту мутности, затем серийными десятикратными разведениями доводили до содержания 1 тыс. (10 ) и 100 (10 ) микробных клеток в 1 мл взвеси. Иэ разведения 10 и 10 взвеси каждого штамма культуры бруцелл высевали по 0,1 мл на чашки Петри с предлагаемой и известными средами. Учет результатов проводили через 72-96-144 часов инкубации посевов при 37 С.

Результаты указанных исследований при разном соотношении компонентов питательной среды на основе ГПЭМ представлены в табл. 2, из которой следует, что при испытании 7 известных вирулентных штаммов бруцелл установлены граничные концентрации компонентов по составу предложенной среды. При этом по наибольшему количеству выросших колоний эа оптимальную концентрацию компонентов состава питательной среды авторами принято, мас. :

Гйдролизат плацентарно-эмбриональноматочный (сухой остаток

9 — 10 " ) 1,4

Натрий хлористый, х,ч, 0,5

Глюкоза медицинская 1,0

Глицерин 3,0

Агар-агар 2,0

Вода дистиллированная Остальное

Граничные с ним минимальные концентрации составляют, мас. :

Гидролизат плацентарно-эмбриональноматочный (сухой остаток

9 — 10 0 ) 1,2

Натрий хлористый, х.ч, 0,4

Глюкоза медицинская 0,9 . Глицерин 2,75

Агар-агар 1,75

Вода дистиллированная Остальное

Граничные с ним максимальные концентрации составляют, мас. :

Гидролизат плацентарно-эмбриональноматочный (сухой остаток

9-10 о ) 1,6

Натрий хлористый, х.ч. 0,6

Глюкоза медицинская 1,1

Глицерин 3,25

Агар-агар 2,25

Вода дистиллированная Остальное

Предложенная питательная среда на основе гидролиэата плацентарно-эмбрионально-маточного по оптимальных концентрациях компонентов по своим ростовым свойствам не уступает составам питательных сред по прототипу.

1806186

Пример 3. Проводились специальные исследования по изучению ростовых свойств питательных сред для вирулентных штаммов бруцелл при использовании в качестве основы среды гидролизата плацентарно-эмбрионал ьно-маточного из тканей коров (б), свиней (в) в отдельности и смеси указанных гидролизатов в равном соотношении (1:1, г). Результаты опытов представлены в табл. 3, из которой видно, что по своим ростовым свойствам среды, по предлагаемому изобретению на основе исследованных гидролизатов(б, в, r) практически не отличались друг от друга, по количеству выросших колоний были близки к среде по прототипу, агару Д, однако превосходили его по ускоренному росту колоний бруцелл (на 1-2 суток) и большим размером колоний. Морфологические, тинкториальные и дифференцирующие свойства бруцелл, выращенных на средах по прототипу и предлагаемому изобретению, оставались неизменными.

Пример 4. По определению диагностической эффективности оптимального состава в сравнении с прототипом исследовался патологический материал от крупного рогатого скота (к.р.с.), экспериментально зараженного бруцеллезом, и материал из неблагополучных хозяйств от поголовья крупного рогатого скота, реагирующего положительно на бруцеллез по PA и РСК (колхоз "Ередви" Цхинвальского района Юго-Осетинской АО), Эффективность питательных сред определялась по количеству выделенных культур бруцелла абортус в процентах к количеству исследованных проб (лимфатические узлы: паховые, подчелюстные, заглоточные, шейные, околоушные, тазовые, предлопаточные, коленной складки, портальный. бронхиальные, парааортальные; яичники, костный мозг, печень, селезенка), Результаты отражены в табл. 4, из которой видно, что по эффективности предложенная питательная среда на основе

ГПЭМ превосходит среду по прототипу на

7,0-10,7% %.

Технико-экономическая эффективность данного предложения заключается в следующем: 1) на питательной среде по изобретению в сравнении с прототипом ускоряется на 1 — 2 суток рост культур бруцелл; 2) повышается диагностическая эффективность по

5 количеству выделенных колоний возбудителя бруцеллеза из патологического материала (на 7,0 — 10,7 %%); 3) расширяется сырьевая база непищевого белка для изготовления питательной основы сред с ис10 пользованием отходов производства мясокомбинатов, годовой объем которых только на одном мясокомбинате (r, Казань) составляет 50-60 тонн; 4) в значительно меньшей стоимости сырья — плацентар15 но-эмбрионально-маточного материала (в 3-7-9 раз) в сравнении с общепринятыми в микробиологической практике источниками белка (рыба — печень — мясо) и экономии дефицитных пищевых мясоры20 бопродуктов, Все сказанное обусловливает возможность промышленного изготовления для нужд бактериологических. лабораторий основы питательной среды для выделения

25 бруцелл в лиофилизированном состоянии, Формула изобретения

Питательная среда для диагностики

30 бруцеллеза, содержащая питательную основу. агар-агар, натрий хлористый, глюкозу, глицерин и дистиллированную воду, о тл и ч а ю щ а я с я тем, что, с целью ускорения диагностики за счет повышения

35 ростовых свойств среды, в качестве пита. тельной основы она содержит ферментативный гидролизат плацентарно-эмбрионально-маточных тканей коров и/или свиней при следующем соотношении компо40 нентов, мас, %:

Гидролизат плацентарно-эмбриональноматочных тканей коров и/или свиней 1,2-1,6

45 Натрий хлористый 0,4 — 0,6

Глюкоза 0,9-1,1

Глицерин 2,75-3,25

Агар-агар 1,75 — 2,25

Вода дистиллированная Остальное

1806186

Таблица 1 твбпицв2

Количество колоний, еыросаих при nocese 100 иикробмчх клеток

Коипоиентм питатель>ьтй среди, нас.г (Г про» пион

»«««»»»»»«

Полезна ютви>е> бруцелл

Натрий

КПОРНСтцй

МаМе

Вода днстилАНРО» ввннвл Глюкоза

Глице- Дпвррнн агар .

Рефе рентные отан>ь> боуцелл

271-2803

276-720 275-138

280-881К-4 бруцалла нелттен зис,вт25

Бруцелла абортус

544

Бруцелла суис, 1330

612

5884

1,8 0,3 0,8

tã 04 09

l,4 015 l >0

116 0,6 1,1

1,8 0,7 1,2

Остальное

613 7

6727

60«36

«l l

П1

«11»

56>5 питательное среда ло прототипу - агар Д питатвльнак среда. Леча>к>чноцпептоно"глскоэо-глнцериноаий агар

Конт»

РОЛЬ

72>5 . 67+4 56ьб 70>7

6427

4924 бга5

S7>4

«и«

52а3 64т8.

65+5

69 - 6

50>3

5984,4

Таблица3

tecT - италии бруцвпл

Характеристика колоний

Нвксимвльний рост колоний сутки

Рвзиер,колоний,нн, на

5-е сутки разнноквння

Форме колоний

KoJl ep еиросаих колоний лрн посеве 100 и.клеток а в tf в б в r

B а б

6427 6915 6617 6835 4-5 2-3 2-3 2 3

2»3 Ьгб 3-4

1-2 Э-Ь 4-5

3-4 4-5

4-5 В-Форма 0-Форне Б-Форне В-ФО1и>в

72ь5 7618 7788 7727 4-5 2-3 2-3 2-3

«Н» и

3-4

° 1

H бр 4 73т7 7466

7387 4-5 2-3 2-3 2»3

4-5

«il»

11»

566 6НЬ 596 61>6 45 23 23 23

ttoneeHe ета>а>и

1-2 4-5 3-4

3-4

«11»

70 7

7126 70 5 7327 4-5 2-3

4-5

2-3 . 1,5-2 3-4 3 Ь

>l I>

«I I»

2-3

«1 >«

49 4 5623 53(4 5635 4-5 2-3 2-3 2-3 1-2 3-4 4 5

)>-5

«Il»

3-4

1-1, 5 3-4 3-4

6285 6767 68!6 бб"4 4-5 2-3: 2-3 .2-3

« I I

«11»

«11»

1 а « контроль « агар Д нз гидролизата кильки б - агар нв основе гидролизата из плвцентарн>-эмбрионально-маток>в>х тканей коров (ГПЭИ коров) в - """ -"" свиней (fITTH свиней) г - "- -"- на основе снеси гидролизатов Гпэп коров н свиней (I>1) ббовиачвиин

Гндроли" зат ллв» цеитарно» еНВрНоН» иат.(сук. ест.9-11}8) от коров

Реаврент>а>е атвиии

t. Бруцеллв вбортус>

544

2 Бруцеллв суис, 1330

3 Бруцепле иелитензис вт.25

1 Бруцепла абортус, 271-2808

2 Бр)>цапле абортус, 276-720

3 Бруцелла абортус, 276-138

4 бруцелла абортус, 280-381 К-4

2 5

2> 75

3,0

3,25

3,5

1,5

1,75

2,0

2>25

2,5

5ь+3

61+8

65+4

58и 3

71сб

7627

68-5

6215

59-4

67+4.

738 7

64 6

6027

50 3

6224

6024

5313

65) 4, 7!26

6723

6336

4513

51и)

56+3

47г4

4123

1806186

Таблица4 выделения

Эффективность предложенной сеы, Выделено культур Бр. абортус

Кол-во исследуемых животных

Патоматериал от исследуемых животных

Материал от крупного рогатого скота, экспериментально зара-. женных бруцеллезом — на питательной среде по изобретению — на питательной среде по прототипу

Материал от крупного рогатого скота из неблагополучного по бруцеллезу хозяйству — на питательной среде по изобретению — на питательной среде по прототип

52,7 .

158

10,7

300

42,0

300

126

29,0

100

7,0

100

22

Составитель H. Мамлева

Техред М,Моргентал Корректор М. Керецман

Редактор

Производственно-издательский комбинат "Патент", r Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 965 Тираж Подписное

ВНИЙПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5