Штамм бактерий bacillus роlyмyха - продуцент @ -амилазы

 

Использование: биотехнология, штамм может быть использован для производства ферментных препаратов, используемых для получения мальтоэных продуктов для медицинских целей, детского и диетического питания , а также для применения в пищевой промышленности, в частности в пивоварении , кондитерской промышленности, крахмалопаточной промышленности. Сущность изобретения: штамм Bacillus polymyxa ВКПМ В-5690 выделен из природных источников и представляет продуцент со стойками морфологическими признаками. На средах с крахмалом продуцирует/ -амилазу на уровне 10-200 ед/мл. Технологические преимущества штамма заключаются в том, что наряду с синтезом / -амилазы штамм способен к синтезу на средах с крахмалом экзополисахарида - полимиксана, обладающего стабилизирующим действием по отношению к /3-амилазе. В комплексе сопутствующих ферментов отсутствуют а-амилаза и нейтральная протеаза. что обеспечивает высокое качество мальтозных сиропов. Препараты /б-амилазы, полученные на основе предлагаемого продуцента, могут широко использоваться при гидролизе крахмалсодержащего сырья с целью получения мальтозных продуктов, 1 ил., 2 табл. ё

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)з С 12 N 9/26, 1/20

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

6 (21) 4952058/13 . (22) 28.06.91 (46) 30.03.93. Бюл, hh 12 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт биотехнологии (72) Н.Б.Филиппова, И.И.Майко, P.È.Ãâoçpw, О.П.Кожемякина, Ю,А,Белогорцев и А.М.Лужков (73) Научно-исследовательский институт биотехнологии (56) Рашат P.Ê. Выделение, очистка и свойства Р-амилаэы В. polymyxa 3. Автореферат канд. дис. М.: МТИПП, 1984.

Авторское свидетельство СССР

N. 1613491, кл. С 12 N 9/26, 1988. (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ ВАС111 US

P0LYMYXA — ПРОДУЦЕ НТ Р-АМИЛАЗ Ы (57) Использование: биотехнология; штамм может быть использован для производства ферментных препаратов, используемых для получения мальтоэных продуктов для меди цинских целей, детского и диетического питания, а также для применения в пищевой

Изобретение относится к биотехнологии и представляет новый штамм бактерий, который может быть использован для производства ферментных препаратов, используемых для получения мальтозных продуктов для медицинских целей, детского и диетического питания, а также для применения в пищевой промышленности, в частности в пивоварении; кондитерской промышленности, крахмалопаточной промышленности.

Целью изобретения является новый штамм бактерий, обладающий способностью к биосинтезу Р-амилазы на уровне прототипа на средах, содержащих недефи(ы) Я2, 1806193 АЗ промышленности. в частности в пивоварении, кондитерской промышленности, крахмалопаточной промышленности. Сущность изобретения: штамм Вас!Поэ potymyxa

ВКПМ В-5690 выделен из природных источников и представляет продуцент со стойками морфологическими признаками. На средах с крахмалом продуцирует ф-амилазу на уровне 10 — 200 ед/мл. Технологические преимущества штамма заключаются в том, что наряду с синтезом Р-амилазы штамм способен к синтезу на средах с крахмалом экзополисахарида — полимиксана, обладающего стабилизирующим действием по отношению к Р-амилазе. В комплексе сопутствующих ферментов отсутствуют а-амилаза и нейтральная протеаза, что обеспечивает высокое качество мальтозных сиропов.

Препараты Р-амилазы, полученные на основе предлагаемого продуцента, могут широко использоваться при гидролизе крахмалсодержащего сырья с целью получения мальтозных продуктов, 1 ил., 2 табл, цитные и дешевые компоненты, в комплексе ферментов которого отсутствуют а-амилаза и протеаза, что позволяет повысить качество мальтоэных сиропов.

Это достигается тем, что новый штамм бактерий (хранится во Всесоюзной коллекции микроорганизмов — Гч В-5690) В.

polymyxa F-12, выделенный из природных источников (почва), предлагается как продуцент Р-амилазы, Преимуа ество предлагаемого штамма

В. polymyxa F-12 заключается в том, что предлагаемый продуцент, обладая высокой способностью к биосинтезу ф-амилазы (на уровне прототипа), на средах, содержащих

1806193 недефицитные и дешевые компоненты, не содержит в комплексе ферментов а-амилазу и протеазу, что обеспечивает высокое качество мальтоэных сиропов, полученных при использовании препаратов Р-амилаэы предлагаемого продуцента. Кроме того, продуцент синтезирует в процессе культивирования экэополисахарид, обеспечивающий снижение потерь при выделении ферментных препаратов.

Штамм имеет следующие характеристики.

Морфологические признаки; спороносные, подвижные короткие тонкие прямые или слегка изогнутые палочки. размером

0,6+0.8 х 3-4 мкм. Одиночные или соединенные попарно. Споры овальные, расположены терминально.

Культуральные признаки: растет на твердых и жидких питательных средах. На синтетических средах рост слабый, На картофельном агаре плоские, кремовые, слизистые колонии. К 24 часам роста— в виде легкого налета, к 48 часам — колонии хорошо развитые, слизистые.

На косяках(среда, содержащая 27ь соевой муки, 5$ крахмала, 2 (, агара) — колонии плоские, кремовые, слизистые. хорошо развитые.

На сусло-агаре-(8 -Hoì) рост затруднен.

На жидкой среде — 2 соевой муки, 5 крахмала, 0,3 К НРО4 растет во всем объеме среды (при перемешивании), спорообразование начинается с 40-48 часов.

Физиологические признаки: аэроб, температурные границы роста 20-40 С, оптимальная температура роста 32-37 С; растет в диапазоне рН 5,5-9,0, оптимальное значение рН вЂ” 6,0-7,5, Крахмал разжижает, клетчатку не разлагает. Ассимилирует: глюкозу, мальтозу, рафинозу, арабиноэу, ксилозу, маннит, сахароэу. Не ассимилирует: дульцит. Мопоко коагулирует, желатину разжижает слабо.

Нитраты разлагает до нитритов, индол и

Н $ не образует. На средах, содержащих

3-10 крахмала, способен к биосинтезу

P-амилазы на уровне 10-200 ед/мл в зависимости от состава сред и условий культивирования. На средах с высоким содержанием крахмала (3-10 ) способен к образованию экзополисахарида (полимиксана). а-амилаза отсутствует, глюкоамилаэа отсутствует, нейтральная протеаза отсутствует, поллуланаэа отсутствует. Активность гидролитических ферментов определяли следующими методами:

1. Активность Р -амилазы — по Бернфельду (Метпобз in Enzymol., 1955, 1, N. 4, р.

149 — 150); рН 7,0, Т-30 С, продолжительность 20 мин, 2. а-амилаэная активность — ГОСТ

20264 4-74

3. Протеолитическая активность—

ГО СТ 20264.4-74, 4. Глюкоамилаэная активность—

ГО СТ 20264.4-74.

5. Пуллуланазная активность — пат. Англии М 1466009, опубл. 2.03.77 г.

Для уточнения природы фермента испольэовали .методику построения "голубой кривой" (Biotechnol. I ett., 1988, 10. N 2, 143—

147). Голубая кривая В. polymyxa F-12 — аналогична голубой кривой для В. polymyxa 3 и растительной Р -амилазы (sweet potato фирмы "Sowa"), Пример 1. Штамм В. polymyxa F-12 выращивали на среде состава, : 5 — крахмала, 1,5 — соевой муки, 0,3 — К2НРО4 в ферментере объемом 10 л, Количество посевного материала 20 по объему. Культивирование осуществляли при 37 С, числе оборотов мешалки 4000 o6/мин, воздух подавали в соотношении 151, Активность Рамилазы к 30 часам составила 48 ед/мл.

Актйвность а-амилазы и нейтральной протеаэы отсутствовала. Выход экзополисахарида 9 мгlмл, В контроле (Bacillus subtilis

2011, выращенном при аналогичных условиях на аналогичной среде) активность Рамилазы 50 ед/мл, активность а-амилаэы

0,2 ед/мл, активность нейтральной протеаэы 0,2 ед/мл.

Пример 2. Штамм В. polymyxa F-12 выращивали на качалочных колбах объемом 750 мл с 50 мл среды при температуре

37 С в течение 48 часов при 220 об/мин.

Состав среды, : 5 — кукурузного крахмала, 2 — соевой муки, 0,3 — КэНРО, начальное значение рН среды — 7,0, Посевным материалом служила 48-часовая культура бактерий, выращенная на картофельном вгаре, Количество посевного материала — 4 по объему. Активность Р -амилазы в культуральной жидкости — 200 ед/мл, активность а-амилаэы и нейтральной протеазы — отсутствует.

Выход экзополисахарида — 17 мг/мл, В контроле (B. subtills 2011), выращенной на такой же среде в аналогичных условиях

180 ед/мл, а-амилаза 0,5 ед/мл, нейтральная протеаэв — 0,3 ед/мл, fl р и м е р 3. Препарат Р-амилазы В, polymyxa F-12 получали осаждением этиловым спиртом в соотношении 1:4 г ри рН 8,4, Т 2-15 С. Контролем служили препараты

В, subtills 2011, полученные спиртоосажде1806193

15

25

35

Таблица 1

Общие потери по активности при выделении препаратов, Выход, г/л

Активность

Название продуцента и способ выделения препарата

Р-амилаэы нейтральной и отеазы а-амилазы в КЖ в КЖ в КЖ в препа ате в препа ате в препа ате ед/г ед/г ед/мл ед/г ед/мл ед/мл

1210

B, po l ym yxa F-12, спиртоосажденный

В.cubtil is 2011, спи тоосаж енный

25

0,2

0.2

1441

6,0

5,4

51 нием в соотношении 1:4. Результаты представлены в табл. 1.

Препараты Р-амилазы, полученные из культуральной жидкости В. polymyxa F-12 с содержанием полисахарида 5 — 17 мг/мл имеют белый цвет, легко отсушиваются, имеют рыхлую консистенцию в сыром виде, .

Препараты, полученные из КЖ В.зоЬтВз

2011 имеют бежевый цвет, мажущуюся консистенцию, трудно отсушиваются, что приводит к увеличению потерь по активности.

Оптимум действия препаратов Р-амилазы В. polymyxa F-12: рН 6,0 — 7,0; Т опт

55 — 60 С, Работает в диапазоне рН 4,5 — 9,0.

Оптимум действия препаратов В.

subtitis 2011: рН 7,0 — 7,5; Т опт 55-63 С. работает в диапазоне рН 5,0 — 8,5.

Пример 4. Спиртоосаждение препараты Р-амилазы использовали для гидролиза нативного кукурузного крахмала из расчета 1 ед/г. Температура гидролиза

50 С, рН 7,0; 35% раствор кукурузного крах-. мала предварительно разжижали препаратом а-амилазы (Амилосубтилин Г-10Х) из расчета 1 ед/г, Разжиженный субстрат имеет следующие характеристики: ДŠ— 14,5%, мальтотриоза — 8,38%, мальтоза — 2,8%, глюкоза — 0,12%.

На чертеже изображено изменение декстрозного эквивалента в процессе осахаривания кукурузного крахмала препаратами р -амилазы.

Качественный и количественный состав мальтозных сиропов, оцененный методом высокоэффективной жидкостной хроматографии представлен в табл. 2.

Оптимальная продолжительность гидролиза для препарата В. polymyxa F-12 составляет 12-18 часов, для препаратов В.

subtills 2011 60-72 часа, обьясняется высокой специфичностью фермента Р -амилазы

В. polymyxa F-12 к кукурузному крахмалу.

Отсутствие в комплексе ферментов В

polymyxa 1 — 12 а-амилазы определяет низкое содержание глюкозы, отсутствие нейтральной протеаэы обеспечивает показатель цветности в 5 раэ меньший, чем при испольэовании препаратов В, subtilis 2011.

Предлагаемый новый штамм В

polymyxa F-12 по сравнению с прототипом обладает преимуществами, заключающимися в том, что наряду с синтезом Р-амилаэы на уровне прототипа на средах с крахмалом названный продуцент не синтезирует Р -амилазу и нейтральную протеазу, что обеспечивает высокое качество получаемых мальтозных продуктов при переработке нативного крахмала: низкое содержание глюкозы — следы против 2-8% при использовании прототипа, высокое содержание мальтозы — 36-50% и высокий декстрозный эквивалент 31-45%, против 18 — 35% мальтозы и 28 — 38% ДЕ для прототипа, Использование препаратов В, polymyxa 1-12 позволяет сократить время гидролиза с 6072 часов для прототипа до 12 — 18 часов. Способность предлагаемого продуцента синтезировать экзополисахарид на средах с крахмалом одновременно с,0-амилазой, в отличие от прототипа обеспечивает снижение потерь по активности при выделении препаратов с 51% до 37-41%;

Новый штамм В. polymyxa 1 — 12 представляет продуцент со стойкими морфологическими признаками. Препараты ф-амилазы В. polymyxa F-12, полученные из культуральной жидкости с активностью 10200 ед/мл могут иметь активность на уровне

250-25000 ед/г в зависимости от способа очистки, Формула изобретения

Штамм бактерий Вас!Поз polymyxa

ВКПМ В 5690 — продуцент,В-амилазы, 1806193

Таблица 2

Качественный и количественный состав гидролизатов при продолжительности гидролиза 12 ч .

50 H 70

ЙРОООВЯОильн0с7б, и.

Составитель Н. Филиппова

Техред М.Моргентал Корректор М. Самборская Редактор

3аказ 965 T9lp3)K Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101