Сырье для получения молибдокофактора

 

Использование: изобретение может быть использовано в научных исследованиях для установления структуры и свойств молибдокофактора (Мо-со), а также молибдоферментов (Мо-ферментов) (нитратредуктаза, ксантиндегидрогеназа, альдегидоксидаза, формиатдегидрогеназа и ряда других ферментов), активным центром которых является Мо-со. Последний может также быть использован при диагностике и лечении наследственных заболева- ,ний, связанных с отсутствием в печени больных Mo-ферментов. Сущность изобретения: предлагается в качестве сырья для получения молибдокофактора использовать семена гороха, которые содержат молибдокофактор как в свободной, так и в связанной с белком форме. 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

s С 12 P 9/00, C 12 N 9/00

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

C) ()ь

l О (21) 4923160/13 . (22) 29,03,91 (46) 30.03.93. Бюл. ¹ 12 (71) Институт биохимии им. А,Н.Баха (72) А.А,Швецов. Н.П.Львов и А.В.Амелин (73) А.А.Швецов, Н.П.Львов и А,В.Амелин (56) Burgmayer S.J.N.. Stlefel ЕЛ. — J.Chem.

Educ, 1985, ч,62, р. 943-953. Johnson J.L., Rajagopalan K,V. — Proc, Nat. Acad.Scl. USA, 1982, р.6856-6860.

Львов Н.П., Кильдибеков Н.А, и др. ДАН

СССР, 1983, т.272, с.1264-1268.

Rajagopalan,K.V., Johnson !Л ., На!пИпе

В.Е. — Fed, Proc, 1982, v.41, р.2608-2612, Авторское свидетельство СССР

¹ 1520097, кл. С 12 N 11/00, 1987. (54) C6IPbE ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МОЛИБДОКОФАКТОРА

Изобретение относится к биохимии, а именно к получению молибдокофактора.

Молибдокофактор (Мо-со) представляет собой 6-замещенный птерин в тетрагидроформе, связанный с молибденом и, возможно, с пептидом. Может быть использован в научных исследованиях для установления структуры и свойств Мо-со. а также молиб- . доферментов (Мо-ферментов) (нитратредуктаза, ксантиноксидаза, ксантиндегидрогенаэа, альдегидоксидаза, формиатдегидрогеназа и ряда других ферментов), активным центром которых является Мо-со, Последний может также быть использован при диагностике и лечении ряда неврологических и урологических заболеваний, связанных с недостатком и нарушениями биосинтеза Мо-со.

Наиболее распространенным является выделение Мо-со из животных и раститель„„>Д.1 „„1806197 АЗ (57)Использование: изобретение может быть использовано в научных исследованиях для установления структуры и свойств молибдокофактора (Mo-co), а также молибдоферментов (Мо-ферментов) (нитратредуктаза, ксантиндегидрогеназа, альдегидоксидаза, формиатдегидрогеназа и ряда других ферментов), активным центром которых является Мо-со. Последний может также быть использован при диагностике и лечении наследственных заболева,ний, связанных с отсутствием в печени больных Мо-ферментов. Сущность изобретения: предлагается в качестве сырья для получения молибдокофактора использовать семена гороха, которые содержат молибдокофактор как в свободной, так и в связанной с белком форме, 1 табл. ных тканей, клеток микроорганизмов, которые содер>кат Мо-ферменты. При этом для получения кофактора необходимо сначала выделить и очистить Мо-фермент, а затем из фермента выделить кофактор. Известно также использование зерна пшеницы в качестве сырья для получения Мо-со. Со.держание Мо-со в семенах пшеницы, определенное по восстановлению активности дефектной по Мо-со нитратредуктазы мутанта гриба Neurospora crassa nit-1 соответствует 17,2 нмолей NOz — образованных за

1 минуту на 1 г воздушно сухой массы семян, При использовании зерна пшеницы в качестве источника для получения Мо-со необходима стадия отделения отрубей от зндосперма, что усложняет процесс получения кофактора. Кроме того в зерне пшеницы

Mo-co обнаружен только в форме, связанной с белком, что также требует дополни1806197

Содержание молибдокофактора в семенах гороха и пшеницы тельной стадии при выделении, а именно применения денатурирующих агентов, тепловой или кислотной обработки исходного препарата.

Цель изобретения — увеличение выхода

Мо-со и упрощение процесса его получения, Сущность изобретения заключается в том, что в качестве сырья для получения

Мо-со используют семена гороха, содержание Мо-сов которых в среднем в 10 раз, адля "0 отдельных генотипов семян гороха в 20-30 раз выше, чем в зерне пшеницы. Кроме того, в семенах гороха Мо-со присутствует как в связанной с белком, так и в свободной форме, при этом содержание свободного Мо-со у ря- 15 да генотипов (таблица) превышает количество кофактора в связанной форме.

Пример. 5 r семян каждого генотипа измельчают до состояния муки. Затем навеску муки 0,5 r экстрагируют в 2,5 мл 50 мМ 20 калий-фосфатного буфера, рН 7;4 с добавками Na-ЭДТА (1 мМ) и восстановленного глутатиона (3 мМ). Экстракцию проводят в течение 60 минут при перемешивании на . магнитной мешалке при температуре 5ОС.

После этого экстракт центрифугируют при

13000 х д в течение 40 минут. Супернатант используют для определения содержания свободного и связанного Мо-со.

Процедура определения связанного 30

Мо-со включает следующие две стадии: 1— освобождение кофактора от белка, 2 — комплиментация освобожденного Мо-со апонитратредуктазой экстракта мутанта и!т-1 гриба Neurospora crassa, дефектной по Мо- 35 со и определение активности вновь образовавшейся in vitro нитратредуктазы. Для освобождения Мо-со экстракты подвергают тепловому шоку (прогревание на водяной бане 70 С в течение 90 секунд). Прогрева- 40 ние проводят в смеси, содержащей в объеме

60мкл 50 мМ калий-фосфатного буфера, рН

7,4 с добавками — 1 мМ Na-ЭДТА и 3 мМ восстановленного глутатиона. При определении содержания свободного Мо-со для 45 комплиментации используют экстракт без прогревания.

Комплиментацию Мо-со с экстрактом мутанта гриба Neurospora сгазза и!И проводят следующим образом: к 60 мкл экстракта добавляют 120 мкл смеси, состоящей из экстракта Neurospora crassa nit-1 (80 мкл), раствора NADP H - 2х10 М (20 мкл), раствора Иа2Мо04 0,1 М (20 мкл) и оставляют на 20 часов при 5 Ñ. Активность вновь образовавшейся !и vitro нитратредуктазы определяют добавлением к комплиментационной смеси 100 мкл раствора FAD (10 М) и 100 мкл раствора йайОз (0,1 M) и инкубируют 40 минут на водяной бане (20 С). Для остановки реакции и удаления избытка

NADPH пробы кипятят на водяной бане в течение 15 минут, Затем смесь охлаждают до комнатной температуры и добавляют реагенты для определения нитритов: 0,5 мл раствора сульфаниловой кислоты (6 г кислоты в 1 л 20 соляной кислоты) и 0,5 мл раствора N-1-нафтилэтилендиамина солянокислого (1,23 г в 1 л дистиллированной воды). Спустя 15 минут, необходимо для развития окраски, количество образовавшихся нитридов определяют спектрофотометрически при длине волны 548 нм. Содержание

Мо-со выражают в нмолях нитридов, образовавшихся за 1 минуту в.расчете на 1 r воздушно-сухой массы семян. Аналитическая повторность всех анализов трехкратная, биологическая — двухкратная.

Мутант гриба Neurospora crassa пй-1 выращивают на среде Фриза. Результаты определений представлены в таблице, Таким образом семена гороха содержат в среднем в 10 раз, а отдельные генотипы в

20-30 раз больше Мо-со, чем семена пшеницы, при этом многие сорта гороха содержат

Мо-со преимущественно в свободной форме, что значительно упрощает процесс выделения. Выход целевого продукта при использовании в качестве сырья для его получения семян гороха значительно возрастает, а себестоимость снижается.

Формула изобретения

: Применение семян гороха в качестве сырья для получения молибдокофактора.

1806197

Продолжение таблицы

Общее содержание молибдокофактора

Со е жение молиб око акта а*

Генотип гороха сободный связанный

Пшени а

17,2

0.0

17,2

* Примечание: единица измерения молибдокофактора — нмоли нитрита, образовавшегося за 1 мин в расчете на 1 г воздушно-сухой массы семян

Составитель А, Швецов

Техред М.Моргентал

Редактор 3, Ходакова

Корректор Л, Филь

Заказ 966 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Аист

Малиновка

85-233

86-14

85-237

Таловец

85-171

Туркус

Труженик

Орловчанин

ППС-2-1507

Флагман

Смарагд

Норд

Л-261-84

Тим

24,9

295,9

70,5

46,9

17,8

11,2

51,0

23,2

24,9

14,1

9,5

22,4

45,2

17,4

30,2

16,6 .

27,1

104,1

2,6

199,2

89,5

25,9

33,7

85,4

129,8

80,0

14,4 н. опр.

19,0

59,9

53,4

28,2

52,0

400,1

73,1

246,1

107,3

37,1

84,7

108,6

154,7

94,1

23,9

64,2

77,3

83,6

44,8