Способ иммобилизации фрагментов нуклеиновых кислот на полимерной подложке

 

Использование: биотехнология, молекулярная биология, медицина. Сущность изобретения: способ обеспечивает возможность иммобилизации на полимерную подложку коротких (до 20 нуклеотидных звеньев) фрагментов нуклеиновых кислот при сохранении ими способности образовывать прочные комплементарные комплексы, В качестве полимерной подложки используют полимер , содержащий карбоксильные группы, которые активируют, превращением в хлорангидрид карбоновой кислоты. Во фрагмент нуклеиновой кислоты вводят аминоспейсер и процесс иммобилизации ведут в присутствии третичного амина. СО

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (st)s С 12 N 11

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ (21) 4922414/13 (22) 28,03.91 (46) 07,04.93, Бюл. N. 13 (71) Новосибирский институт биоорганической химии СО АН СССР и Институт биоорганической химии им.М;М.Шемякина (72) Т.С.Годовикова, Т,Н.Орлова, Н.Ю.Щеголь, В.Ф.Куликова, Т.И.Венер, В,В.Сабуров, Б.В,Мчедлишвили и В.П.Зубов (73) Новосибирский институт биоорганиче-. ской химии CO РАН, Институт биоорганической химии им. М,M,Øåìÿêèíà PAH (56) 1. Фругмарц Л.А. и др. Изв.Сиб,отд, АН

СССР; сер,хим, наук, вып.1, с.81 — 87.

2, Alwine J-С. Kemp D.J „Stark О.R. Proc, Natl. Acad, Sci. USA. 1977, 74, 5350 — 5354.

Изобретение относится к биотехнологии, молекулярной биологии и медицине.

Оно может быть использовано в сэндвичгибридизационном анализе при выявлении определенных нуклеотидных последовательностей, для выделения индивидуальных нуклеиновых кислот и выявления точечных мутаций, Сэндвич-гибридизация — наиболее перспективный метод для анализа PHK и ДНК в неочищенных препаратах, в особенности разнородного клинического материала, содержащего белки, полисахариды и другие примеси, способные ингибировать сорбцию нуклеиновых кислот, Метод основан на использовании двух отдельных фрагментов нуклеиновых кислот, один из которых свя„„5U„„1808014 А3 (54) СПОСОБ ИММОБИЛИЗАЦИИ ФРАГМЕНТОВ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ НА

ПОЛИМЕРНОЙ ПОДЛОЖКЕ (57) Использование: биотехнология, молекулярная биология, медицина. Сущность изобретения: способ обеспечивает возможность иммобилизации на полимерную подложку коротких (до 20 нуклеотидных звеньев) фрагментов нуклеиновых кислот при сохранении ими способности образовывать прочные комплементарные комплексы, В качестве полимерной подложки используют полимер, содержащий карбоксильные группы, которые активируют. превращением в хло- . рангидрид карбоновой кислоты. Во фрагмент нуклеиновой кислоты вводят аминоспейсер и процесс иммобилизации ведут в присутствии третичного амина, и зан с твердой фазой, а другой, находящийся в растворе, несет репортерную группу. В качестве твердой фазы часто используют С полимерные подложки, на которые иммоби- ОО лизуют длинный фрагмент нуклеиновой кис- Ql лоты. Однако полинуклеотиды обладают а двумя существенными недостатками по ф сравнению с короткими олигонуклеотидами; медленная кинетика реассоциации нуклеиновых кислот, что увеличивает время проведения гибридизационного анализа; 4 отсутствие способности выявлять последовательности, отличающиеся точечными нуклеотидными заменами.

Использование в гибридизационном анализе иммобилизованных на полимерные подложки коротких олигонуклеотидов иск1808014 лючается, так как отсутствуют методы присоединения их к подложке.

Для ковалентного присоединения полинуклеотидов известны следующие способы; фотоиммобилизация и взаимодействие с активированными электрофильными группировками, а именно с диазосоединениями.

Метод фотоиммобилизации основан на взаимодействии с иммобилизуемыми молекулами высокореакционно-способных час- 10 тиц — нитренов, которые образуются в ходе облучения арилазидов полимерной подложки ультрафиолетовым светом. Однако под действием ультрафиолетового света, а также в результате реакции с нитренами, происходит модификация гетероциклических оснований. Известно, что изменения в структуре даже одного основания приводят к утрате олигонуклеотидами способности образовывать прочные комплементарные 20 комплексы. Таким образом, фотоиммобилизация не может быть использована для присоединения к полимерным подложкам коротких олигонуклеотидов.

Наиболее близким к заявляемому явля40 оснований, несомненно, отразится на способности коротких фрагментов нуклеиновых кислот к образованию прочных комплементарных комплексов. Таким образом, этот метод не может быть использован для присоединения к полимерным полож45 кам коротких олигонуклеотидов, Целью изобретения является обеспечение возможности иммобилизации на полимерные подложки коротких (до 20 нуклеотидных звеньев) олигонуклеотидов 50 при сохранении ими способности образовывать прочные комплементарные комплексы.

Указанная цель достигается предлагае55 мым способом иммобилизации фрагментов

НК, включающим активацию группировок полимерной подложки и их взаимодействие с фрагментами НК, при этом по 5-кондевоI му фосфату фрагментов предварительно вводят аминоспейсер, в качестве подложки ется способ иммобилизации, основанный на взаимодействии нуклеиновых кислот с активированной электрофильной группировкой полимерной подложки, а именно с диазобензилоксиметилцеллюлозой. Взаи- 30 модействие арилдиаэониевой соли подложки с нуклеиновыми кислотами ведут в боратном буфере рН 8,0. При этом происходит взаимодействие экзоциклических аминогрупп нуклеиновой кислоты с. диазогруппой 35 подложки и образуются соответствующие диазоаминосоединения, Вовлечение в реакцию важных для образования водородных связей аминогрупп гетероциклических используют материал, содержащий карбоксильные группы, которые активируют превращением в хлорангидрид карбоновой кислоты с помощью пентанхлорида фосфора, а процесс их взаимодействия с фрагментами НК ведут в присутствии третичного амина, Способ включает присоединение к олигонуклеотиду пол иметилен пол иамина путем взаимодействия одной из алифатических аминогрупп с 5-фосфо-4-N,N-диметиламино1 пиридиниевым производным олигонуклеоти- да; активацию с помощью пентахлорида фосфора карбоксильной группы полимерной подложки с образованием соответствующего хлорангидрида карбоновой кислоты; взаимодействие аминогруппы полиметиленполиаминового спейсера олигонуклеотида с активированной электрофильной группой полимерной подложки в присутствии третичного амина, необходимого для депротонирования аминогруппы спейсера.

Пример 1. Иммобилизация на лавсан

pdACCTCTCCACCTTCATT, 2 . 10 молей (2,9 оптических единиц при длине волны 260 нм (OE26Q) 17-звенного олигонуклеотида переводят в цетавлоновую соль триметилцетиламмоний бромидом. Соль нуклеотида растворяют в .50 мл диметилформамида, добавляют 25 мкл диметилформамида с

3 10 молями (3.66 мг) 4-N,N-диметиламинолиридина, 12,5 мкл диметилформамида с

15 10 молей (3,93 мг) трифенилфосфина и 12,5 мкл диметилформамида с 1,5 10 молей (3,3 . .мг) 2,2 -дипиридилдисульфида.

Реакционную смесь выдерживают 10 мин при комнатной температуре, Полученное активное производное олигонуклеотида осаждают 1 мл 2 Я,-ного раствора перхлората лития в ацетона. Осадок отделяют центрифугированием, промывают ацетоном, эфиром, сушат. К сухому остатку добавляют

30 мкл водного раствора, содержащего

3 10 молей (5 мкл) 1,10-диамино-4,7-диа-5 эадекана, Выдерживают 60 мин при комнатной температуре, осаждают 1 мл 2 ф-ного раствора перхлората лития в ацетоне, осадок отделяют центрифугированием, промывают ацетоном, эфиром, сушат.

Полоску лавсана (15хб мм) инкубируют при комнатной температуре в насыщенном пентахлоридом фосфора растворе толуола (3 мл) в течение 5 ч, отмывают толуолом до нейтральной среды (по 2 мл). Промывают

N,N-диметилформамидом (2х1 мл) и переносят в раствор N,N-диметилформамида (400 мкл) с цетавлоновой солью полученного, как описано выше, фосфамида олигонуклеотида (2 10 молей; 0,29 ОЕ). Добавляют 5 мкл

1808014 третичного амина. Реакцию ведут при комнатной температуре в течение 12 ч, Полоску промывают 1 мл N,N-диметилформамида и опускают в 2 -ный раствор перхлората лития в ацетоне. Через 15 мин полоску промывают водой (5х2 мл) в течение 60 мин, раствором 0,5 м NaCI; 0,1 M Трис-НО pH 7,5;

0,05 Твин-20 (2х5 мл), затем водой (2х5).

Хранят при -4 С, Количество присоединенного к лавсану олигонуклеотида оценива:от, используя Р-меченный образец, Радиоактивность на лавсане детектируют просчетом в жидкостном сцинтилляционном счетчике. Табл.1 иллюстрирует воспроизводимость способа иммобилизации олигонуклеотида на полимерную подложку, Для определения равномерности иммобилизации олигонуклеотида на поверхность лавсана модифицированный лавсан разрезают на одинаковые полоски . Радиоактивность на полосках детектируется просчетом в жидкостном сцинтилляционном счетчике, Табл.2 иллюстрирует равномерность иммобилизации олигонуклеотида на поверхности полимерной подложки.

Аффинность полученных материалов. определяют по способности связывать комилементарный (34-звенный) и некомплементарный (17-звенный) олигонуклеотиды, меченные Р.

Взоаствор 1 М NaCI, 0,05 М Трис-HCI pH

7,5 с Р-меченными 34-звенным олигонуклеотидом (1,2 10 молей) или с 17-звенным

-1г олигонуклеотидом, аналогом иммобилизованному на лавсан, (1,4 10 молей) вносят

-12 полоски модифицированного лавсана, Инкубируют при комнатной температуре в течение 1 ч. Отмывают по 25 мин раствором

0,5 М NaCI, 0,1 М Трис-HCI рН 7,5, 0,05

Твин-20 (Зх1 мл). Связавшуюся радиоактивность просчитывают в жидкостном сцинтилляционном счетчике Rackbeta (LKB, Швеция), Комплементарный олигонуклеотид

GGCACCCAGAACTAATGAATGAAGGTGGA

GAGGT связывается с модифицированным лавсаном, а некомплементарный АССТСТСCACCTTCATT не связывается. Сорбционная емкость. аффинной полимерной подложки представлена в табл.3.

Способность образовывать иммобилизованными олигонуклеотидами прочные. комплементарные комплексы оценивают через сравнение температуры, при которой происходит денатурация комплекса, образованногоо олигонуклеотидом, иммобилизованным на поверхность полимерной подложки (pdACCTCTCCACCTTCATT) и комплементарным олигонуклеотидом (66CAССCAGAACTAATGAATGAAGGAGAG

GT) с температурой плавления дуплекса, образованного данными олигонуклеотидами, в растворе, Кривые плавления комплементарных комплексов олигонуклеотидов записывают с помощью установки для исследования термической денатурации в ультрамикромасштабе на базе спектрофотометра "Обь4" (НИБХ СО АН СССР) при концентрации компонентов 1,4 10 М в 0,6 М NaCI, 0,01

М Трис-HCI рН 7,99, 0,01 М MgCI2.

Термическую денатурацию на лавсановой полоске исследуют, используя зг

P-меченный 34-звенный олигонукле= отид, Аффинную лавсановую полоску (0,5х0,5 см).инкубируют в 0,1 мл раствора 1 М NaCI 0,05 М Трис-HCI рН 7,5; содержащем 2 10 молей P-GGCACCCAGAA

CTAATGAATGAAGGAGAGGT в течение 1 ч при комнатной температуре (25 С). Полоску отмывают по 25 мин раствором 0,5 М NaCI, 0,1 М Трис-HCI рН 7,5, 0,05 Твин-20, переносят в раствор с 0,6 M NaCI, 0,01 M TpucHCI рН 7,99, 0,01 M М9С!2, Раствор равномерно нагревают в термостате от 25 до 750C. Через каждые 5" С отбирают супернатант и просчитывают в жидкостном сцинтилляционном счетчике Rackbeta (LKB, Швеция). Температура плавления дуплекса, образованного в растворе, 51,2"С. Температура денатурации дуплекса, образованного с олигонуклеотидом, иммобилизованном на лавсане 5l С.

Пример ы 2, 3. Иммобилизация на лавсан pdACCTCTCCACCTTCATT.

Условия иммобилизации аналогичны условиям, приведенным в примере 1, и отличаются тем, что использован лавсан размером 0.9 см (пример 2) и 0,3 см (при40 мер 3). Результаты по иммобилизации и характеристики аффинных подложек представлены в табл.1,2 и 3.

Пример ы 4 и 5, Иммобилизация нэ KM-целлюлозу олигонуклеотида

45 pdACCTCTCCACCTTTCATT, Условия иммобилизации аналогичны условиям, приведенным в примере 1, и отличаются тем, что использована вместо лавсана

КМ-целлюлоза размером 0,9 см в примере 4 и 0 3 см в примере 5. Результаты по иммобиг лизации и характеристики аффинной подложки представлены в таблицах 1, 2 и 3.

Пример 6. Иммобилизация на лавсан

pdAATCCACAATGGTTCCCCA, Условия иммобилизации аналогичны условиям, приведенным в примере 1, и отличаются тем, что фосфамид олигонуклеотида дополнительно очищают обращенно-фазовой ВЭЖХ, Используют колонку (14,6х250

1808014

Таблица1

Удельная радиоактивность имп/минмоль х 10

Размер полоски полимер н.ой подложки, см

Счет радиоактивности проб по Черенкову, имп/мин

Полимерная подложка

Пример моль/

/см х10" г/см q 10 66486, 37794

8300

622280

4,5

2,9

0,9

7,14

6,37

7,49

1,40

1,25

1,47

Лавсан

KM-целлюлоза

О;9

0,3

967

249

71220

7,14

5,6

1,4

l,1

2832

2,4

Лавсан

504

144

240

2,9

41388

4570

900

Лавсан .

300

Таблица2 нм) со смолой Lichrosorb RP 18 (10 мкм) и градиент концентрации ацетонитрила от О. до 40 в 0,05 M LICIO4, Результаты по иммобилизации представлены в табл.1 и 2.

Пример 7. Иммобилизация на лавсан 5

pdTTGTAACCTT.

Условия иммобилизации аналогичны условиям, приведенным в примере 1, и отличаются тем, что фосфамид олигонуклеотида дополнительно очищают обращенно-фазо- 10 вой ВЭЖХ. Используют колонку.(4,6х250 нм) со смолой Lichrosorb RP — 18(1 0 мкм) и градиент концентрации ацетонитрила от О до 20 в 0,05 M LICI04, Аффинную емкость и спо- . собность к комплексообразованию оце- 15 нивают, используя комплементарный (28-з вен н ый) ол и гонуклеотид — Рз

pd СCTGGG CAGGTTGGTATCAAGGTTACAA.

Результаты по иммобилизации и характеристики аффинной подложки представлены в 20 табл,1, 2 и 3, Таким образом, предлагаемый способ позволяет присоединять к полимерным подложкам фрагменты нуклеиновых кислот с сохранением ими способности образовы- 25 вать прочные комплементарные комплексы, Полученным подложкам свойственна высокая аффинная емкость (до 10 молей/см );

Этих двух факторов достаточно, чтобы обеспечить возможность использования аффинных полимерных подложек в сандвич-гибридизационном анализе, также при выделении индивидуальных нуклеиновых кислот, Ф о р мул а и за б р е те н и я

Способ иммобилизации фрагментов нуклеиновых кислот нэ полимерной подложке, включающий активацию групп полимерной подложки и их взаимодействие с фрагментами нуклеиновых кислот, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью обеспечения возможности иммобилизации на полимерной подложке коротких, до 20 нуклеотидных звеньев, фрагментов и сохранения ими способности образовывать прочные комплементарные комплексы, в качестве подложки используют полимерную подложку, содержащую карбоксильные группы, активацию проводят с помощью пентахлорида фосфора до превращения кэрбоксильных групп в хлорангидрид кэрбоновой кислоты, перед иммобилизацией во фрагменты нуклеиновой кислоты вводят аминоспейсер, а процесс иммобилизации ведут в присутствии третичного амина, Содержание нуклеотидного мате иэла

1808014

Продолжение табл, 2

¹ полоски

П ример, полимерная подложка

Размер полоски, см мин моль kK

КМ-целлюлоза

14

0,35

0,35

О, 5

228

249

231

71220

0,91

1.0

0,92

17

18

0,25 . 0,25

0,25

307

328

277

220

504

504

504

Лавсан

0,25

0,25

0,25

27

28

4448

4830

300

4570

Лавсан

Таблица3

Составитель T. Годовикова

Редактор Техред M.Mîðãåíòàë Корректор .М.Самборская

Заказ 1395 Тираж Подписное

ВНИЙПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

8

11

12 „

21

22

23

24

0,25

0,25

0,25

0,25

0,16

0,16

0,16

0,25

0,25

0,30

0,30

0,30

0,30

240

Счет радиоактивности проб по Черенкову, имп/мин

3258

3017

2507

2237

2289

366

407

341

320 297

4016

Удельная радиоактивность, имп х х 10 о

1036500

504

504

504

504

504

504

650

Содержание нуклеотидного материала, моль/см х х10

1,26

1,17

1,18

1,35

1,51

1,35

1,38

288

284

268

253

236

260