Рекомбинантная плазмидная днк @ nk 34, кодирующая синтез микроцина

 

СОЮЭ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ (21) 4950912/13 (22) 28.06.91 (4Q 23,04.93, Бюл, N 15 (71) Институт молекулярной генетики

АН СССР (72) Н. Е, Курепина, Й, А. Хмель и

А, 3. Метлицкая (73) Институт молекулярной генетики РАН (56) Biochem biophys Res. Commun, 1976. К

69, р. 7 — 14.

J. Вассег., 1985, V. 163, р. 275 — 281. (54) РЕКОМБИНАНТНАЯ! ПЛАЗМИДНАЯ

ДНКpNK34, КОДИРУЮЩАЯ СИНТЕЗ МИКРОЦИНА (57) Использование: в ветеринарии и медицинедля профилактики кишечных заболеваний и коррекций микрофлоры

Изобретение относится к области генетической инженерии и биотехнологии и может быть использовано в ветеринарии и медицине для конструирования штаммов бактерий, применяемых для профилактики кишечных заболеваний и коррекции микрофлоры пищеварительного тракта сельскохозяйственных животных и человека, а также в микробиологическом производстве антибактериальных препаратов.

Целью изобретения. является получение новой плазмиды, определяющей синтез микроцина широкого спектра действия.

Цель достигается тем, что получена новая рекомбинантнэя плазмидэ pNK 34, Кодирующая синтез микроцина, размером. Ж 1811538 АЗ

s С 12 N 15/30, 15/03, 15/41 пищеварительного тракта сельскохозяйственных животных и человека. а также в микробиологическом производстве антибактериальных препаратов, Сущность изобретения: получена рекомбинантная плазмидная ДНК pNK 34, кодирующая синтез микроцина (размер 17,8 т.п.н.). Плазмида содержит: — плазмидную ДНК вектора

pBR 325 размером 5,3 т.н,п, (гид(олизованную по BamHI и Sph1 сайтам), — Sa и ЗА—

Sph1 — фрагменты плазмиды р1 размером

12,5 т,п.н„— уникальные сайты ректрикции;

Sph1, BamHI, SaIGI. Плазмида определяет: устойчивость клеток Е, соП к эмпициллину (1 00 мкг/мл), синтез в них микроцинэ, устойчивость к продуцируемому ею микроцину,. 3 неконъюгативна, стабильна (сохраняется в

100 Д клеток при 100 генерациях). 1 табл.

17,8 т.п.н, содержащая -Sphl —. BamHI— фрагмент ДНК вектора pBR 325 размером {.Л

5,3 т.п.н. — Sau ЗА — Sphl — фрагмент плаз- (Д миды р1 размером 12,5 т,п.н., включающий QQ гены синтеза микроцина и иммунитет к нему; уникальные сайты: Sphl, BamHI, SaIGt; генетические маркеры; ген Ыа, обеспечива- 6д ющий синтез Р -лактазы, ген(ы), кодирующий синтез микроцина, ген, определяющий иммунитет к микроцину, неконъюгативна; стабильна в 100 Д клеток при 100 генерациях.

Пример 1, Конструирование рекомбинантной плазмиды pNK 34.

Плэзмиду р1, выделенную из природного штамма Entегоbacter sp, подвергают час1811538 тичному гидролизу рестриктазой ЗааЗА путем инкубации 10, мкг ДНК плазмиды с 20 ед. фермента в общем объеме смеси 100 мкл, содержащей 25 mM калий-фосфатного буфера рН 7,0, 50 mM NaCI, 15 mM MgClz, 6 5

mM 2-меркаптоэтанола, 0,02 % тритона

Х100 в течение 1 мин при 37ОC. Полученную смесь обрабатывают фенолом, ДНК из водной фазы осаждают добавлением 10 мкл.

Na-ацетата (рН 8,0) в 200 мкл этанола, ДН К "0 растворяют в 100 мкл буфера, содержащего

10 вМ трис-HCI (p H 8,0), 2 mM Мц С! г, 20 mM

NaCl, 100 мкг/мл альбумина, 0,02% тритона . X100, инкубируют в течение 1 часа при 37ОС с 30 ед. рестриктазы Sph I. Полученную 15 смесь фракционируют электрофорезом в

0,7% геле легкоплавкой агарозы. Фрагмент;

ДНК размером 12 — 14 т.п.н. элюируют путем расплавления полосы геля при 65 С, экстракция агарозы фенолом и осаждения 20 этанолом. Осадок ДНК растворяют в 1 0 мкл воды.

5 мкг ДН К плазмиды pBR 325 обрабатывают 10 ед. рестриктазы Sphl в общем объеме смеси 50 MKll (cocTGB описан, выше) в 25 течение 1 часа при 37 С. После обработки фенолом и переосаждения ДНК этанолом смесь растворяют в 50 мкл буфера, содержащего 6 mM трис-Н С! рН 7,9. 6 mM Mg Clz, 150

mM 0;02, тритона Х100, и инкубируют с 10 30 ед, рестриктазы BamHI 1 час при 37 C.

Фрагмент ДНК размером 5,3 т.п.н. элюируют после фракциоиирования электрофорезом в 0,7% геле легкоплавкой агарозы, ДНК растворяит в 10 мкл воды,, 35

3 мкл раствора ДНК линеаризомной плазмиды pBR 325 сливают с 10 мкл раствора фрагмента плазмиды р1, содержащего гены синтеза микроцина, добавляют 1,5 мкл буфера (0,5 M трис-НС1 рН 7,9, 0,1 M MgClg, 40

0,1 M DTT, 1 mM АТР) и 1 мкл липазы и инкубируют 3 часа при 16 С,,Плазмиду передают методом трансформации в клети штамма Е. coli Т6!.и Е. coli

М17, Для этого в полученной лигазной сме-. 45 си добавляют 100 мкл компетентных клеток соответствующего штамма, инкубируют 30 мин при 4 С, затем 2 мин при 42 С; добав- ляют 1 мл (= бульона и инкубируют 1 час при

37ОС; 200 мкл суспензии клеток высевают на 50 чашки с агаризованной L-средой, содержащей 100 мкг! мл ампициллина и ин кубируют при 37 С в течение ночи.

Пример 2. Построение физической карты ппазмиды pNK 34.

1 — 5 мкг ДНК плазмиды подвергают гидролизу соответствующей рестриктазой в условиях, рекомендованных заводом-изготовителем, По окончании гидролиза смесь фрагментов ДНК обрабатывают фенолом (рН 7,0) и осаждают этанолом. Для последующего гидролиза ДНК растворяют в буфере, рекомендованном для соответствующей рестриктазы, Смесь фрагментов ДНК фракционируют в 0,7% агарозном геле в трис-боратном буфере при напряженности электрического поля 2 — 3 в/см.

Пример 3. Проверка способности штаммов Е. coli (pNK 34) синтезировать минкроцин, Колонии штамма выращиваю уколами . на среде следующего состава (г/л Н20): йа2НРОз — 7,5, КНгРО4 — 1,5; (NH4)zS04 2, MqS04 — 2, обогащенной дрожжевым экстрактом (0Ifco, 0,3%),â течение 1 — 2 суток при 37 С, Затем клетки убивают парами хлороформа, накладывают целлофан и сверху засевают индикаторный штамм Е. сой В в.

3,0 мл 0,7% агара (1 — 2 . 10 клеток из. экспоненциальной фазы. роста культуры).

Вокруг колоний, синтезирующих микроцин, наблюдаются зоны задержки роста индика- . торного штамма через 12 —, 18 ч инкубации при 37оС

Достигнутый положительный эффект иллюстрируется данными таблицы.

Диаметр зон, образуемых вокруг коло- . ний штаммов Е. coli TGI и М17, содержащих плазмиду pNK 34, бйл в 2-2,5 раза больше, чем диаметр зон::вокруг колоний, содержащих плазмиду,р74 (табл.).

Увеличение диаметра зоны - задержки. раста в 2.—.2,5 раза свидетельствует об увеличении уровня синтеза микроцина.

Таким образам, полученная рекомбинантная плазмида рйК34 определяет повышенный уроввнь синтеза микроцина по сравнению с плазмидой р74. Эта плазмида может быть использована для конструирования штаммов, применяемых для борьбы с кишечными заболеваниями человека и сельскохозяйственных животных; антагонисти-: ческое действие этих штаммов будет усилено благодаря повышению уровня синтеза микроцина. Кроме того, штамм, несу- . щий плазмиду pNK 34, может быть использован как новый продуцент антибио; тического вещества с антибактерйальным действием широкого спектра — микроцина, г ..

Формула йзобретения

Рекомбинантная.плазмидная ДНК pNK

34; кодирующая синтез микроцина, разме poM 17,8 г.п,н., содержащая -Sph — BamHIфрагмент ДНК вектора pBR 325 размером

5,3 т,п.н„Sau 3А — Sphl-фрагмент плазмиды р1 размером 12,5 т.п.н., включающий гены синтеза микроцина и иммунитет к нему; уни1811538

Составитель И.Хмель Техред M,Ìîðråéòàë

Корректор В,Петраш

Редактор

Заказ 1463 - . Тираж . . Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 кальные сайты: Sphl, BamHI, SaIGI; генетические маркеры; ген Ыа, обеспечивающий синтез Р-лактамазы, ген, кодирующий синтез микроцина, ген, определяющий иммунитет к микроцину, неконъюгативна, стабильна в 100 клеток и ри 100 генерациях,

Рекомбинантная плазмидная днк @ nk 34, кодирующая синтез микроцина Рекомбинантная плазмидная днк @ nk 34, кодирующая синтез микроцина Рекомбинантная плазмидная днк @ nk 34, кодирующая синтез микроцина 

 

Похожие патенты:

Изобретение относится к медицинской и ветеринарной микробиологии и может быть использовано для профилактики кишечных заболеваний и коррекции микрофлоры пищеварительного тракта сельскохозяйственных животных и человека

Изобретение относится к медицинской биотехнологии, в частности к получению бактериальных пирогенов, используемых в лечебной практике для стимуляции естественных защитных сил

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к новому полипептиду, усиливающему продукцию внеклеточных энзимов, фрагменту ДНК, который кодирует этот полипептид, рекомбинантной плазмидной ДНК, которая содержит данный фрагмент ДНК, и штамму, трансформированному рекомбинантной плазмидной ДНК

Изобретение относится к генной инженерии, в частности к получению проинсулина Lyspro человека, и может быть использовано для создания лекарственных препаратов нового поколения для лечения инсулинозависимого сахарного диабета

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу получения иммуногенного рекомбинантного экстраклеточного фрагмента коннексина-43

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к способу определения целостности ДНК в бактериях, и может быть использовано в микробиологических исследованиях

Изобретение относится к медицинской и ветеринарной микробиологии, касается получения новой плазмиды и нового штамма, обладающего антибактериальной активностью, и может найти применение для профилактики кишечных заболеваний и коррекции микрофлоры пищеварительного тракта сельскохозяйственных животных и человека

Изобретение относится к области биохимии

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способам получения ферментных препаратов. Изобретение касается термостабильной двухдоменной лакказы бактерии Streptomyces griseoflavus Ac-993 со щелочным оптимумом активности, последовательности ДНК, кодирующей данный фермент, и способа получения фермента, включающий клонирование в клетках бактерии Escherichia coli гена фермента, продукцию фермента в клетках Escherichia coli, внесение ионов меди в среду для культивирования рекомбинантного штамма для образования активного фермента, получение ферментного препарата методами металлхелатной хроматографии и гельфильтрации. Изобретение позволяет расширить ассортимент ферментов, таких как лакказа. 3 н.п. ф-лы,3 ил.

Изобретение относится к биотехнологии и молекулярной биологии

Изобретение относится к генетической инженерии и биотехнологии и представляет собой рекомбинантный штамм Е.coli НВ 101 рМК 16 и рекомбинантную плазмиду рМК 16, определяющую деградацию гербицида 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты данного штамма
Наверх