Способ получения биологически активной фракции из спермы животных

 

Изобретение относится к биотехнологии , а именно, к способам получения биологически активных средств из сырья животного происхождения. Цель изобретения -устранение иммуногенных свойств целевого продукта, .получаемого из спермы. Способ включает следующие операции: термическая обработка спермы, получение растворимой фракции, разделение на высоко-и низкомолекулярные составляющие, стерилизация и концентрйрование до получения целевого продукта. Новым в способе является использование в качеств сырья не только нативной, но и криоконсёрвированной спермы, которую инкубируют при температуре 80-00РС в течение 0,5-1 ч при перемешивании , отстаивание 5-15 ч при 15-25°С, разделение на высокои низкомолекуляр-; ные составляющие путем диализа или колоночной хроматографии, причем в качестве целевого продукта стерилизуют соответственно диализат или низкомолекулярную составляющую . ел с

СОЮЗ СОВЕТСКИХ .

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (11) (51)5 А 61 К 35/52

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН

К ПАТЕНТУ (21) 4825851/14 (22) 14.05.90 (46) 15.05.93. Бюл. гв 18 (71) Инженерный центр "Биотрон" Института биоорганической.химии и нефтехимии AH

УССР и Институт биоорганической химии и нефтехимии АН УССР (72) А.П.Иванов, В.Н.Мельник и К.Ç.Мацько (76) Инженерный центр "Биотрон" Институт . та биоорганической химии и нефтехимии АН

Украины (56) 3 ая вка Е П В М 8103653, кл. А 61 К 35/52, 1981. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОЙ ФРАКЦИИ ИЗ СПЕРМЫ

ЖИВОТНЫХ (57) Изобретение относится к биотехнологии, а именно, к способам получения биологически активных средств из сырья

Изобретение .относится к биотехнологии, а именно к способам получения биологически активных средств из сырья животного происхождения.

Целью изобретения является повышение качества целевого продукта за счет устранения иммуногенных свойств средства, получаемого из спермы, путем удаления вы. сокомолекулярной составляющей, Для достижения цели в способе облучения биологически активного средства.из спермы, которую сначала подвергают термической обработке, затем получают растворимую фракцию, которую. разделив на высокомолекулярную и низкомолекулярную фазу, стерилизуют и концентрируют до получения целевого продукта, предложено в ка. честве сырья использовать как нативную, так и криоконсервированную сперму, котоживотного происхождения. Цель изобретения — устранение иммуногенных свойств целевого продукта, получаемого из спермы, Способ включает следующие операции: термическая обработка спермы, получение растворимой фракции, разделение на высоко- и низкомолекулярные составляющие, стерилизация и концентрирование до получения целевого продукта. Новым в способе является использование в качеств сырья не только нативной, ко и крмоконсервированной спермы, которую инкубируют при температуре 80-90ОС в течение 0,5-1 ч пои перемешивании, отстаивание 5-15 ч при 15 — 25 С, разделение на высоко- и йизкомолекулярные составляющие путем диализа или колоночной хроматографии, причем в качестве целевого продукта стерилизуют cooTBBTcTвен но диализат или низкомола куля рную составляющую. рую сначала инкубируют при температуре

S0-90 С в течение 0,5-1 часа при перемешивании и отстаивают в течение 5-15 часов при температуре 15-25 C, а растворимую фракцию разделяют методом диализа или колоночной хроматографии, причем в качестве целевого продукта стерилизуют соответственно диализат или низкомолекулярную фракцию.

Изобретение иллюстрируется примерами конкретного выполнения способа (примеры 1-5) и испытаний нового биологически активного средства (пример 6).

Пример 1. 50 мл нативной спермы, полученной от быков-производителей, вносят в стеклянный стакан, снабженный мешалкой, и инкубируют в течение 30 мин. при температуре 80 С. Скорость перемешивания. 120 об/мин, После окончания нагрева

1816214 смесь выдерживают при температуре 25 С в течение 5 часов при периодическом перемешивании. Образовавшийся осадок удаляют центрифугированием при 5000 об/мин.

Полученную растворимую фракцию помещают в целлофановый мешок (гидратцеллюлоэные мембраны для гемодиализа

"Диацелл" TY 6-06-475-80 производства Балаковского ПО "Химволокно"), Диализ проводят против дистиллированной воды, в соотношении 1;1 при температуре +4 Ñ, в. течение 24 часов. Диализат, содер>кащий вещества с молекулярной массой не более 1 кДа, стерилизуют ультрафиолетовым облучением и лиофильно. высушивают.

Пример 2. 250 мл спермодоз(50 мл); разбавленной в защитной среде спермы, вносят в стеклянный стакан, снабженный мешалкой, и размора>кивают при комнатной температуре. Размороженныф спермодозы инкубируют при перемешивании со скоростью 120 об/мин. в течение 60 мин. при температуре 90 С. После прекращения нагрева смесь выдерживают при температуре 15ОС при периодическом слабом перемешивании . в течение 15 часов.

Образовавшийся творо>кистый осадок уда ляют центрифугированием при 5000 об/мин. Полученную раствориму1о фракцию диализуют, как описано в примере 1, а диализат, содержащий вещества с молекулярной массой не более 1 кДа, облучают ультрафиолетовым светом и лиофильно высушивают, Пример 3. 250 спермодоз (50 мл) разбавленной в защитной среде спермы вносят в стеклянный стакан, снабженный мешалкой, и подвергают размораживанию при комнатной температуре. Размороженные спермодозы инкубируют при перемешивании со скоростью 120 об/мин. в течение 60 мин. при температуре 90 С. После прекращения нагрева, смесь выдерживают при температуре 15 С, при периодическом слабом перемешивании 15 часов. Образовавшийся творожистый осадок удаляют фильтрованием. Фильтрат лиофильно высушивают, растворяют в физиологическом растворе до концентрации 100 мг/мл и наносят на колонку, заполненную сефадексом марки 6-15 (Pharmacia).

Элюцию проводят физиологическим раствором. Высокомолекулярную составляющую, выходящую со свободным объемом колонки, отбрасывают, Низкомолекулярную составляющую (элюат) с молекулярной массой ниже 1 кДа стерилизуют ультрафиолетовым облучением и лиофильно высушивают.

50 метром 3-4 мм гель иэ них удаляют отстаиванием. Лунки до края заполняют соответствующими растворами. В центральную лунку наливают разбавленную антисыворотку, полученную из крови кролей, прошедших иммунизацию диализатом спермы. В периферические лунки — серию разбавлений исходного раствора диализата спермы, Антисыворотку и диализат спермы разбавляют физиологическим растЬором.

Это делается для подбора оптимального соотношения их концентраций. Иммунодиффузию ведут во влажной камере при комнатной температуре в течение 2 дней. По окончании процесса иммунодиффуэии полосы преципитации обнаружены не были как визуально, так и при окрашивании красителями типа Кумасси ярко-голубой бриллиантовый В-250. Полученные данные свидетельствуют об отсутствии иммунного ответа организма на диализат спермы. ПреПример 4, 250 спермодоэ (50 мл) размораживают, инкубируют, отстаивают, фильтруют и концентрируют как указано в примере 3. Колоночную хроматографию осуществляют на молселекте марки 6-10 (Reana), Стерилизацию и лиофильное высушивание целевого продукта осуществляют как указано в примере 3.

Пример 5. 250 спермодоз (50 мл) размораживают, инкубируют, отстаивают, фильтруют и концентрируют как указано в примере 3.

Колоночную хроматографию осуществляют на биогеле марки Р-4 (В!о-Rad), Стерилизацию и лиофильное высушивание целевого продукта осуществляют как указано в примере 3.

Пример 6. Для проверки иммуногенности полученного средства из диализата

20 спермы проводят иммунизацию кролей спермой и диализатом ее с адъювантом

Фрейнда. Инъекции осуществляют внутрикожно во множественных местах с двухнедельным интервалом в течение 2 месяцев.

Забор крови проводят на 8-й день после последней инъекции из ушной артерии или вены. С помощью метода двойной радиальной иммунодйффузии в теле было проведено . тестирование полученных

30 антисывороток. 1,5% ный раствор агара в

0,05 M трис-барбитуратном буфере.(рН 8,0) с 0,15 М NaCI заливают на обезжиренные, строго горизонтальные стекла, до получения слоя толщиной примерно 1,5 мм, В за35 твердевшем теле по шаблону вырезают центральное отверстие — "лунку", а вокруг него еще 6 "лунок", так чтобы расстояния между ними составляли 5 — 10 мм. Лунки вырезают трубочками с острыми краями диа181 б214

Формула изобретения

Способ получения биологически активной фракции из спермы животных, включающий термическую обработку сырья, центрифугирование, фильтрацию надосадочной жидкости с последующей стерилиСоставитель A. Иванов

Техред M.Mîðãåíòàë

Корректор Г. Кос

Редактор

Заказ 1646 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета f10 изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул, Гагарина, 101 имущество нового способа по сравнению с известными аналогами заключается в создании простого способа получения из нативной и криоконсервированной спермы биологически активного средства, которое не вызывает иммунногенных реакций, что экспериментально доказано. зацией и концентрированием целевого продукта, отл и ч а ю щи йс ятем, что, с целью повышения качества целевого продукта за счет устранения иммуногенной активности, 5 в качестве сырья используют дополнительно криоконсервированную сперму, термическую обработку проводят при температуре 80 — 90 Св течение 0,5 — 1 ч при перемешивании, отстаивают при 15 — 25"С в

10 течение 5-15 ч, надосадочную жидкость разделяют на фракции путем диализа или колоночной хроматографии, выделяют фракцию, содержащую целевой продукт. с мол. мас. не более 1000 дальтон.