Рекомбинантная плазмидная днк рр1, определяющая синтез гибридного белка, обладающего антигенными свойствами вируса иммунодефицита человека 1, способ ее конструирования и штамм бактерий еsснеriснiа coli - продуцент гибридного белка, обладающего антигенными свойствами вируса иммунодефицита человека 1

 

Использование: генетическая инженерия и биотехнология. Сущность изобретения: в вектор pVR290 встраивают Hincll-EcoRI фрагмент области pol генома ВИЧ1, кодирующего обратную транскриптазу и часть эндонуклеазы-интегразы, выделенного из плазмиды рВНЮ, содержащей ДНК-копию вирусного генома. Плазмида определяет устойчивость к ампициллину, неконьюгативна. Использование данного изобретения позволяет получать с 1 л клеточной суспензии 45-65 мг гибридного белка , содержащего специфическую последовательность полипептида, кодируемого pol областью генома ВИЧ1.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

„„5U ÄÄ 1816797 А1

Isi)s С 12 N 15/48, 1/21

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР)

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ, ",. - щ. ..„.

1 2 (21) 4872376/13 ЩЕГО АНТИГЕННЫМИ СВОЙСТВАМИ (22) 25.07.90 . ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА (46) 23.05.93. Бюл. М 19 1 (71) Институт вирусологии им. Д.И.Иванов- (57) Использование: генетическая инженеского рия и биотехнология. Сущность изобрете-. (72) М.M.Ãaðaåâ, А.Ф.Бобков и С.В.Шуленин ния: в вектор pVR290 встраивают (56) Papovlc et, al., Science, 1984, 224, 497 — Hincll-EcoRI фрагмент области pol генома . 500. ВИЧ1, кодирующего обратную транскрипPatner et. а!. йасиГе, vol. 313, 1985, рр. тазу и часть эндонуклеазы-интегразы, выде277 — 284.. ленного из плазмиды рВН10, содержащей (54) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК-копию вирусного генома. Плазмида

ДНК pPI, ОПРЕДЕЛЯЮЩАЯ СИНТЕЗ ГИБ- определяет устойчивость к ампициллину, . РИДНОГО БЕЛКА, ОБЛАДАЮЩЕГО АНТИ- неконьюгативна. Использование данного

ГЕННЫМИ СВОЙСТВАМИ ВИРУСА изобретения позволяет получать с 1 л клеИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА 1, CllO- точной суспензии 45 — 65 мг гибридного белСОБ ЕЕ КОНСТРУИРОВАНИЯ И ШТАММ - ка, содержащего специфическую

БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI-ПРОДУ- последовательность полипептида, кодируеЦЕНТ ГИБРИДНОГО БЕЛКА, ОБЛАДАЮ- його pol областью генома ВИЧ1.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой штамм Е,соИ, содержащий рекомбинантную плазмидную

ДНК с фрагментами области ро).генома

ВИЧ1, определяющую синтез гибридного белка, обладающего антигенными свойствами ВИЧ1.

Описание плазмиды

Целью изобретения является получение рекомбинатной плазмидной ДН К, обеспечивающей высокий уровень продукции гибридного белка, обладающего антигенными. свойствами ВИЧ1, способной наследоваться в штаммах бактерий Е,coll и создание таким образом штамма-продуцента этого белка, К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ вЂ” название — рР1 00 — размер — 7,3 т.п.н. ю ° — состоит из Hindi l — Е,coR 1-фрагмента О, плазмиды рВ Н10 размером 2,1 т.п.н „содержащего последовательность области ВИЧ1;

HindllI фрагмента плазмиды puR 290 размером 5,2 т.п.н. с геном бета-гелактозидаза, областью ori и геном устойчивости к ампициллину; и Е,coRI — Hindlll ill олигонуклеотидаадаптора размером 12 нуклеотидов. asst — уникальные сайты рестрикции BamHI, SalGl, Pstl плазмида определяет устойчивость клеток Е.coll НВ101 к ампициллину и синтез

1816797 в них гибридного белка, содержащего антигенные детерминанты области pol ВИЧ1, — плазмида неконьюгативна, Описание штамма Е,coli НВ101/рР1

Морфологические признаки. 5

Клетки прямые, палочковидной формы

1,2х1.,6х2,0 мкт, подвижные с перитрихиальными жгутиками, грамотрицательные, неспорообразующие.

Культуральные признаки. 10

Клетки хорошо растут на простых питательных средах. При росте на мясо-пептонном агаре, L-агаре-колонии гладкие, круглые, прижатые, блестящие, серые, край ровный, мутные. При росте на жидких средах мясо-пептонном бульоне, L-бульоне образуют ровную интенсивную муть.

Физико-биохимические признаки.

Клетки растут в пределах 4 — 45 С при оптимуме рН 6,8-7,5. В качестве источника 20 углерода используют глюкозу, фруктозу, Не усваивают ацетат. Нитраты восстанавливают до нитритов. Желатину не разжижают.

Индол не образуют. Уреазная активность не обнаруживается. 25

° Устойчивость к антибиотикам.

Клетки устойчивы к ампициллину за счет наличия плазмиды рР1, Пример 1. Конструирование плазмиР1 - . 30

Hindi l-Å.со81 фрагмент области pol генома ВИЧ1, кодирующий обратную транскриптазу и часть эндонуклеазы-интегразы, выделяют из плазмиды рВН10, содержащий

ДНК-копию вирусного генома и встраивают 35 в вектор рис 19 bio сайтам для этих рестриктаз. Для этого 10 мкг ДНК плаэмиды рВН10 инкубируют с 20д. Hindll и 30д.Е,coR1 в буфере, содержащем 100 мМ NaCI, 10 mM

MgCIz, 10 mM трис-HCI рН7.5, 1 mM ДТТ в 40 течение 2 ч при 37 С, Далее выделяют нужный фрагмент ДНК методом электроэлюции из 1 агарозного геля, 2 мкг вектора риС19 инкубируют с 5 ед. Hindll и 5 ед., Е.сой! в тех же условиях, 45

Соединение. смеси фрагментов ДНК плазмиды риС19 (0,5 мкг) и Hindll — Е.coRI фрагмента ВИЧ1 из плазмиды рВН10 проводят с помощью ДНК-дигазы фага Т4 (30000 единиц/мл) из расчета 1 мкл фермен- 50 та на.5 мкг ДНК(инкубацию ведут в течение

10 ч при 12ОС).

Полученный препарат используют для трансформации клеток Е.coli НВ101. Трансформацию проводят следующим образом: 55

0,1 мл суспензии клеток Е.соИ НВ101 вносят в 20 мл питательного L-бульона и выращивают до титра Зх10 клеток/мл. Клетки собирают центрифугированием (5000 g, 10 мин, ООС), ресуспендируют в 10 мл 75 mM раствора СаО2 и выдерживают 30 мин при 0 С

Клетки повторно центрифугируют (5000, 10 мин, 4 С), затем ресуспендируют в 1 мл 75

mM CaClz (О С) и 100 мкл такой суспензии используют для трансформации, Смесь соединенных фрагментов ДНК инкубируют с компонентными клетками (обработанными

CaCI) в течение 1 ч при 0 С и 3 минуты при

42 С. После двенадцатикратного разбавления L-бульоном трансформированные клетки подращивают 1,5 ч и высевают на агаризованную среду L-бульона с ампициллином (30 мкгlмл). Плазмидную ДНК, выделенную из ампициллин-устойчивыx колоний, выросших через 36 ч при 37 С, анализируют с помощью электрофореза, Отбирают клоны, молекулярный вес которых больше чем у исходного вектора риС19, Полученную плазмиду обозначают pRT3.

Клетки бактерий Е.coli НВ101, содержащие плазмидную ДНК pRT3, выращивают в

200 мл бульона до титра 1х10 клеток/мл.

Клетки осаждают центрифугированием (5000 g, 5 мин, 4 С) и ресуспендируют в 35 мл раствора, содержащего 8 (сахарозы, 0 5 тритона Х100, 50 mM ЭДТА рН 8,0 и 10

mM трис-Н Cl рН 8,0. Далее добавляют 2,5 мл свежеприготовленного раствора лизоцима с концентрацией 10 мгlмл, быстро перемешивают и нагревают на кипящей водяной бане в течение 3 мин, Полученный лизат центрифугируют (20000 g, 30 мин, 4 С) и

ДНК из супернатанта осаждают равным объемом изоп ропанола. Образовавшийся осадок собирают центрифугированием (12000 д, 20 мин, 2 С) и ресуспендируют в 5 мл 10 mM трис-HCI, рН 8,0 буфера. Окончательную очистку плазмидной ДНК проводят методом равновесного центрифугирования в градиенте плотности CsCI с бромистым этидием (1 мкг/мл), Для получения плазмиды рР1 фрагмент

Hindlll — Е.coRI плазмиды pRT3 переклонируют в вектор puR290 по сайту Hindlll. С этой целью 10 мкг ДНК плазмиды инкубируют с 30 ед. эндонуклеазы Е.coRI в буфере, содержащем 100 мМ NaCI, 10 mM MgMlz, 10

mM трис-HCI рН 7,5, 1 mM ДТТ, в течение 1 ч при 37 С. Затем добавляют 1/10 объема

3М ацетата Na и осаждают ДНК 2,5 объемами этилового спирта на ценрифуге (10000 g, 10 мин, 4 С). Осадок высушивают и растворяют в буфере 10 мМ трис-HCI рН 8,0 и 5 мМ

ЭДТА. Полученный препарат лигируют с 50 мМ адаптора Е.coRI-Hindlll с помощью

ДНК-лигазы фага Т4 (30000 единиц/мл), из расчета 1 мкл фермента на 5 мкг ДНК (инкубацию вели в течение 10 ч при 12 С), Затем добавляют 40 ед, рестриктазы Hindlli и инкубируют в буфере, содержащем 50 mM

1816797

15

40 т,п.н, и содержащая

55 дующей нуклеотидной и аминокислотной трис-НС!. рН 8,0, 50 mM CaCI, 10 mM MgClz, 1 mM ДТТ, Реакцию проводят 1 ч при 37 С, Далее выделяют нужный фрагмент ДНК методом электроэлюции из 1% агарозного геля, 5 мкг ДНК вектора puR290 инкубируют с

10 ед. рестриктазы Hlndlll в буфере, содержащем 50 mM трис-H CI, рН 8, 0,50 mM NaCI, 10 mM МдС!, 1 mM ДТТ, Реакцию проводят

1 ч при 37 град.С.

Соединение смеси фрагментов ДНК плазмиды puR290 (0,5 мкг) и Hindill фрагмента из плазмиды pRT3 проводят с помощью ДНК-лигазы фага Т4 (30000 ед./мл) из расчета 1 мкл фермента на 5 мкг ДНК (инкубацию проводят в течение 10 ч при

12ОC), Полученную смесь используют для трансформации как описано ранее. Плазмидную ДНК, выделенную из ампициллин устойчивых колоний, выросших через 36 ч при 37 С, анализируют с помощью электрофореза. Отбирают клоны, молекулярный вес которых был больше, чем у исходного вектора puR290.

Для окончательного выбора нужной плазмиды проводят анализ способности выбранных плазмид синтезировать гибридные белки молекулярной массы 160 кД, содержащие вирусспецифические последовательности области pol.

Пример 2. Анализ уровня синтеза гибридного белка, обладающего антигенными свойствами Е.coli НВ101/рР1.

Анализ белков в лизатах клеток Е:coli

НВ101, содержащих гибридную плазмиду рР1 проводят следующим образом.

2 мл суспензии клеток Е.со!! НВ101, содержащих плазмиду рР1, выросших в течение ночи из отдельной колонии до концентрации 2х10 клеток/мл в L-бульоне, содержащем 30 мкг/мл ампициллина, осаждают центрифугированием (12000 g, 1 мин) и ресуспендируют в 200 мкл буфера, содер-. жащего 50 mM трис-PCI pH 7,8, 2,5% додецилсульфата натрия, 10%o глицерина. 0,7% 4 меркаптоэтанола и 0,1% бромфенолового синего. Полученные препараты кипятят 5 минут на водяной бане и 20 мкл анализируют методом электрофореза. В лизатах бактерий, содержащих плазмиду р Р1, обнаружен дополнительный белок с молекулярной массой 160 кД. Антигенную активность белка молекулярной массой 160 кД демонстрируют с помощью метода иммуноблотинга, Полученный гибридный белок обладает антигенной активностью ВИЧ1, . Уровень синтеза гибридного белка составляет не менее 5% от тотального клеточного белка.

Изобретение позволяет получать с 1 л клеточной суспензии 45 — 65 мг белка, обладающего антигенными свойствами ВИЧ1, При этом 1726 аминокислотных остатков (ак) гибридного белка представлены; 1021 ак— бета-галактозидаза, 8 ак, кодируемых полилинкерной последовательностью векторной плазмиды puR290, 7 ак, кодируемых полилинкерной последовательностью вектора ри С19, 687 ак, кодируемых фрагментом гена pol ВИЧ1, 3 ак олигонуклеотида-адаптора и 2 ак, кодируемых полилинкером

puR290.

Пример 3. Демонстрация возможности использования целевого продукта для создания диагностикума на ВИЧ1.

Препараты белков, приготовленные по методике, изложенной в примере 2, разделяют методом электрофореза в ПААГ и анализируют методом иммуноблотинга с помощью сыворотки пациента, инфицированного ВИЧ1. В препарате белков, полученных из клеток, содержащих гибридную плазмиду рР1, выявляют дополнительные полосы белков, специфически реагирующие с антителами к ВИЧ1. В препарате, использовавшемся в качестве контроля, приготовленном из клеток, содержащих исходный вектор puR290,. также полосы не идентифицируют.

Таким образом, плазмида рР1 детерминирует в клетках Е.со!! синтез белков, обладающих антигенными свойствами белков

ВИЧ1, поэтому данную плазмиду и штаммпродуцент можно использовать для создания диагностикумов на выявление антител к

ВИЧ1.

Формула изобретения

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК рР 1, определяющая синтез гибридного белка, обладающего антигенными свойствами иммунодефицита человека I размером 7,3 — Hindi! — Е.coRI — фрагмент плазмиды рВН10 размером 2,1 т.п,н.; — HindIl — Hind1II — фрагмент плазмиды

puR290 размером 5,2 т.п.к.; — уникальные сайты рестрикции BamHI, SalGI, PstI; — генетические маркеры — bla-ген устойчивости к ампициллину; — гены; — Iac Z-pol-ген, обеспечивающий синтез гибридного белка, размером 1726 ак со слепоследовательностью бета-галактозидаза полилинкерная область puR290 l-полилинкер Мет... Tpa Цис

Арг Гли Сер Вал Асп Лей Глн Про Сер Лей

Гис Ала

1816797

Составитель Н.Кузенкова

Техред М.Моргентал Корректор М. Максиминишец

Редактор

Заказ 1708 Тираж, Подписное.

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул, Гагарина, 101

АТГ...ТГГ ТГТ ЦГГ ГГА ТЦЦ ГТЦ ГАЦ Цтг

1 1О20

ЦАГ ЦЦА АГЦ ТТГ ЦАТ ГЦЦ

1030 риС19 -последовательность pol -линкер последовательность puR290 .

Цис Арг Сер Тре Глу Иле Глу Фен Гли

Иле Глн Ала Тир Арг 1ТЦ АГГТЦГ АЦТ ЦАГ А Т...Г А ТТТ ГГА

1039 1726

ATT ЦАА ГЦТ TAT ЦГА ТГА

2, Способ конструирования рекомбинантной плаэмидной ДНК pPI, определяющей синтез гибридного белка. обладающего антигенными свойствами вируса иммуноде. фицита человека 1, заключающийся в том, что Hindll-E.coRI фрагмент плазмиды рВН10 размером 2,1 т,п.н, клонируют в вектор риС19, гидролизованный рестриктазами Hindll и Е.coRI. полученную гибридную плаэмиду после обработки ферментом

5 Е.coRI ëèãèðóþò с синтетическим адаптором

Е.coRI Hindll.i, далее обрабатывают рестриктазой Hindlll u Hindi ll фрагмент клонируют в вектор puR290, обработанный рестриктазой Hindlll штамм бактерий

10 Escherichia coll трансформируют полученными рекомбинантными ДНК с последующим отбором клонов, содержащих целевую плазмиду, 15 3. Штамм бактерий Escherlchla coll

ГКВИ рР1 — продуцент гибридного белка,. обладающего антигенными свойствами вируса иммунодефицита человека 1.