Стабилизатор иммобилизованных сериновых протеиназ

 

Использование: биотехнология, в частности касается средств стабилизации ферментов , ферментных комплексов и полиферментных систем. Сущность изобретения: применение активированного углеродно-волокнистого материала в качестве стабилизатора иммобилизованных на том же материале сериновых протеиназ. 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (н>з С 12 N 11/14

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4825998/13 (22) 17.04.90 (46) 30,05,93, Бюл. Q 20 (71) Институт биохимии им. A.В.Палладина (72) И.Н. Бородинская, И. Ф,Мишунин и Е.В.Ерецкая (56) Reddy СЯ., George А., Reddy С.R. immobilization of trypsin on poly/alglnlc acid-gglycldyl methacrylate-co-hydrony ethyl

methacrylate//Àngåw, makromol. Chem,—

1986. — 144. р. 183-192.

Reddy СЯ., Reddy С.R, Raghunath L., Joseph R.Т. Immobilization of trypsln on

alglnlc acid — poly(glycldyl rnethacrylate) graft

copolynar//Blotechnol. and Bloeng. — 1986.—

28, N . 4. —.р. 609-612.

Reddy СЯ., George А., Reddy С.R. immobilization of trypsln on poly (alginlc acid-gglycldyl methacrylate-co-methyl methacrylate)/Angew. makromd. СЬев. — 1987.—

149. — р. 101-110.

Изобретение относится к биотехноло.гии, в частности к средствам стабилизации ферментов, ферментных комплексов и полиферментных систем.

Цель изобретения — повышение стабильности и пролонгирование активности иммобилиэованных ферментов. их комплексов и полиферментных систем.

Для достижения укаэанной цели предложено применение активированного углеродно-волокнистого материала в качестве стабилизатора иммобилиэованных на том же материале сериновых протеи наз.

Выявление стабилизирующих свойств исследуемого материала является неочевидным решением. Впервые было отмечено и доказано существенное повышение ста„„Я2„„1818345 А I (54) СТАБИЛИЗАТОР ИММОБИЛИЗОВАННЫХ СЕРИНОВЫХ ПРОТЕИНАЗ (57) Использование: биотехнология, в частности касается средств стабилизации ферментов, ферментных комплексов и полиферментных систем, Сущность изобретения: применение активированного углеродно-волокнистого материала в качестве стабилизатора иммобилизованных на том же материале сериновых протеиназ, 1 табл. бильности и увеличение сроков хранения ферментов, иммобилиэованных на активированном углеродно-волокнистом материале, при воздействии различных инактивирующих факторов: повышение температуры, лиофилизация, действие ингибиторов (соевого ингибитора трипсина, мочевины), стерилизация у-облучением и водяным паром. Следует также отметить, что к достоинствам нового средства относится возможность стабилизации не только отдельных протеиназ, но и ферментных комплексов и полиферментных систем, Для доказательства новых свойств предложенного материала используют образцы активированного волокнистого углеродного материала двух марок: материал

1818345

АУВМ с объемом пор 1,0 см /г, удельной поверхностью 1800 м /г; материал УВА с объемом поо 0,8 см /r, удельной поверхностью 1700 м /г.

Новые свойства предложенного материала иллюстрируются примерами конкретного применения и исследованиями, доказывающими новый положительный результат, который заключается в сохранении активности после обработки известными инактивирующими средствами.

Пример 1, Иммобилизация трипсина на АУВМ.

Полоску АУВМ, площадью 1 см, закрепленную на фиксаторах и предварительно уравновешенную физиологическим раствором, опускают в раствор трипсина.

Объем реакционной смеси 5 мл на 1 см

2 адсорбционного материала, исходная концентрация адсорбата — 100 мкг/мл. Иммобилизацию проводят в течение 150 мин, При определении активности иммобилизованного фермента или иммобилизованных комплексов протеолитических ферментов в качестве субстрата используют протамин сульфат (ПС). Матрицу АУВМ (1 см ) с иммобилизованным ферментом (закрепленным в держателях) погружают в 5 мл 1 -ного раствора ПС, рН 7,6, Субстрат гидролизуют

30 мин при 37 С. Реакцию прекращают, вынимая матрицу с иммобилизованным ферментом из раствора субстрата. Контрольный образец иммобилизованного фермента предварительно обрабатывают 30 -ным раствором трихлоруксусной кислоты в течение 30 мин. В гидролиэате определяют количество свободных. аминокислот. Активность иммобилиэованного фермента определяют по разности в содержании свободных аминокислот при его действии на субстрат в контрольном и опытных образцах.

Пример 1а, Иммобилизацию трипсина и определение активности иммобилизованного трипсина осуществляют по способу, описанному в примере 1, но в качестве стабилизатора используют полоску материала УВА площадью 1 см, Пример 2. Термообработка.

Для определения стабильности иммобилиэованного на АУВМ трипсина матрицу с иммобилизованным трипсином помещают в сушильный шкаф при температурах 20100 С и выдерживают в течение 30 мин.

После термообработки опытные образцы охлаждают и определяют активность иммобилизованного трипсина, После нагревания при 20 — 90 С иммобилизованный трипсин полностью сохраняет свою активность, а при 100 С его активность снижается íà 6

10

15 лице

При аналогичных условиях определяют стабильность нативного трипсина к дейст20 вию соевого ингибитора. При малярном со25

55 от исходной до термоинактивации, При аналогичных условиях нативный трипсин выдерживает нагревание до 30 С, при 40 С— сохраняется 73 исходной активности, при 50 С вЂ” 557ь, при 60 С вЂ” 297, при 65 С он полностью инактивируется.

Пример 3. Действие соевого ингибитора трипсина.

Для определения стабильности иммобилизованного на АУВМ трипсина его обрабатывают растворами соевого ингибиторами трипсина.

При ингибировании соевым ингибитором активность иммобилизованного трипсина сохраняется.

Результаты опытов представлены в таботношении нативный трипсин;соевый ингибитор 1:1 сохраняется 11 активности (по отношению к исходной до действия ингибитора); при соотношении 1:1,5 — 5 активности, при действии соевого ингибитора на трипсин в соотношении 1:2 нативный трипсин полностью инактивируется.

П ри м е р4. Лиофильное высушивание.

Образцы иммобилиэованных на АУВМ трипсина, комплекса протеолитических ферментов Acremonium chrysogenum, комплекса протеолитических ферментов

Streptomyces grlseus, полиферментной смеси протеолитических комплексов Acr.

chrysogenum u Str. griseus, а также образцы иммобилизованных на УВА протеолитических комплексов Acr. chrysogenum u Str.

griseus высушивают на установке LZ-9 в течение 3 ч.

4,1. Активность трипсина после лиофилизации не изменяется, Активность лиофильно высушенного трипсина сохраняется в течение 15 мес хранения, 4,2. Активность иммобилиэованного комплекса Acr, chrysogenum после лиофилизации сохраняется полностью, После 12 мес хранения при комнатной температуре активность лиофильно высушенного протеолитического комплекса Acr. chrysogenum составляет 80 от исходной.

4.3. Активность иммобилизованного комплекса Str. grlseus после лиофилизации сохраняется полностью, Активность лиофильно высушенного протеолитичевского комплекса Str. grlseus после 12 мес хранения составляет 85 от исходной, 4,4. Активность иммобилизованной полиферментной смеси протеолитических комплексов Acr. chrysogenum u Str. griseus после лиофилизации сохраняется полно1818345 стью. После 12 мес хранения при комнатной температуре сохраняется 90 активности от исходной.

4,5, Активность иммобилизованных на

УВА протеолитических комплексов Acr, chrysogenum u Str. griseus после лиофилизации сохраняется полностью. После 12 мес хранения при комнатной температуре активность лиофильно высушенного протеолитического комплекса Асг, chrysogenum составляет?5 от исходной. Активность лиофильно высушенного комплекса Str.

griseus после 12 мес хранения составляет

700 от исходной.

Пример 5. Действие мочевины.

Для определения стабильности иммобилизованных на АУВМ комплексов протеолитических ферментов Асг. chrysogenum, Str. grlseus, а также иммобилизованного на

УВА трипсина образцы АУВМ с иммобилизованным комплексом протеолитических ферментов погружают на 60 мин в 5 мл раствора мочевины следующей концентрации: 1М, 2М, ЗМ, 4М, 5М, 6М, а образцы УВА с иммобилизованным трипсином в 5 мл раствора мочевины концентрации; 1М, 2М, ЗМ, 4М, 5М, 6М, 7М, 8М.

5.1. Активность иммобилизованного протеолитического комплекса Acr.

chrysogenum после действия растворов мочевины полностью сохраняется.

5.2. При действии 1М-4М растворов мочевины активность иммобилизованного комплекса Str. griseus сохраняется полно стью; после обработки 5М раствором мочевины понижается на 8 по сравнению с исходной, после обработки 6М раствором— понижается на 14 .

5.3. Активность иммобилизованного на

УВА трипсина после действия растворов полностью сохраняется.

Пример 6, Стерилизация гамма-облучением трипсина, Образцы иммобилизованного на АУВМ трипсина. сначала лиОфильно высушивают (как описано в примере 4), а затем подвергают стерилизации гамма-облучением (доза ионизирующей радиации 2,5 Мрад). Для сравнения также подвергают гамма-облуче- нию образцы нативного трипсина.

Активность иммобилизованного трипсина не изменяется после стерилизации, активность нативного трипсина снижается на

25 .

Пример 7, Стерилизация гамма-облучением полиферментной смеси.

5 Образцы иммобилизованной на АУВМ полиферментной смеси Acr. chrysogenum u

Str. grlseus сначала лиофильно высушивают, затем подвергают стерилизации гаммаоблучением (доза ионизирующей радиации

10 2,5 Мрад). Для сравнения также подвергают стерилизации гамма-облучением образцы нативной полиферментной смеси.

При действии указанной ионизирующей дозы активность полиферментной

15 смеси снижается на 25 . а нативная полиферментная смесь инактивируется.

Через 12 мес хранения активность лиофильно высушенной полиферментной смеси после стерилизации гамма-облучением

20 составляет: а) при 4 С хранения — 90 от исходной после гамма-облучения; б) при 20 С вЂ” 85 от исходной, в) при 50 С вЂ” 55 от исходной, 25 Пример 8. Стерилизация водяным паром полиферментной смеси.

Образцы иммобилизованной на АУВМ полиферментной смеси Acr, chrysogenum v

Str. griseus сначала лиофильно высушивают

30 (как описано в примере 4), затем подвергают стерилизации водяным паром при 180ОС, Для сравнения также подвергают стерилизации при указанных условиях образцы нативной полиферментной смеси, 35 Активность лиофильно высушенной полиферментной смеси после воздействия водяным паром снижается на 25, а нативная смесь инактивируется, Через 12 мес хранения активность лио40 фильно высушенной иммобилизованной полиферментной смеси, подвергнутой паровой стерилизации, составляет; а) при 4 С хранения — 95 от исходной после паровой стерилизации;

45 б) при 20 С вЂ” 85 от исходной; в) при 50 С вЂ” 60 от исходной.

Формула изобретения

Применение активированного углерод50 но-волокнистого материала в качестве стабилизатора иммобилизованных на том же материале сериновых протеиназ,