Плазмида p741 , определяющая синтез микроцина и штамм бактерий escherichia coli, обладающий антибактериальной активностью

 

Использование: для профилактики кишечных заболеваний и коррекции микрофлоры пищеварительного тракта сельскохозяйственных животных. Сущность изобретения: плазмида p74¹ с мол. м. 30 МДа, неконъюгативная, в клетках штамма E. coli C 600 присутствует в количестве 1-2 копий на клетку: определяет устойчивость к канамицину (200 мкг/мл), синтез микроцина и устойчивость к продуцируемому ею микроцину: не соответствует широко распространенным группам несовместимости плазмид, в клетках штаммов E. coli поддерживается стабильно в неселективных условиях в течение не менее 100 генераций, не влияет на скорость роста и морфологию клеток E. coli, при трансформации клеток E. coli C 600 ДНК плазмиды p74¹ образуется 10² трансформантов на 1 мкг ДНК с помощью плазмиды p74¹ получен штамм E. coli М 17 ВКМ CR - 322Д, который безвреден для новорожденных телят, приживается в кишечнике новорожденных телят, предотвращается заболевание телят колибактериозом, повышает выживаемость заболевших животных. 2 с.п. ф-лы, 2 табл.

Изобретение относится к медицинской и ветеринарной микробиологии, касается получения новой плазмиды и нового штамма, обладающего антибактериальной активностью, и может найти применение для профилактики кишечных заболеваний и коррекции микрофлоры пищеварительного тракта сельскохозяйственных животных и человека. Целью изобретения является получение новой плазмиды, определяющей синтез микроцина широкого спектра действия и получение нового штамма Escherichla coli c широким спектром действия против возбудителей заболеваний пищеварительного тракта сельскохозяйственных животных и человека. В качестве новой плазмиды получена плазмида р74¹. В качестве нового штамма получен штамм Escherichia coli ВКМ CR-322Д. Для получения новой плазмиды р74¹ в природную плазмиду Р1, определяющую синтез микроцина, вводят транспозон Tn5 и отбирают клоны бактерия Escherichia coli, несущие плазмиду, которая не передается конъюгацией клетками других видов бактерий. Новая плазмида р74¹ имеет следующие характеристики: 1. Имеет мол.м. 30 МДа (определена как сумма молекулярных масс фрагментов, полученных при действии рестриктаз). 2. Неконъюгативна. 3. В клетках Е.coli присутствует в количестве 1-2 копий. 4. Определяет: устойчивость к канамицину (200 мкг/мл); синтез микроцина; устойчивость к продуцируемому микроцину клеток, несущих плазмиду. 5. Не соответствует широко распространенным группам несовместимости плазмид. 6. В клетках штаммов Е.coli поддерживается стабильно в неселективных условиях в течение не менее 100 генераций (продолжительность проведения опыта). 7. Не влияет на скорость роста и морфологию клеток E. coli. 8. При трансформации клеток Е.coli С600 дезоксирибонуклеиновой кислотой (ДНК) плазмиды р74¹ образуется 10² трансформантов на 1 мкг ДНК. 9. Картина рестрикции плазмиды р74¹ различными рестриктазами приводится в табл. 1. Для получения нового штамма Escherichia coli ВКМ-332Д использовали штамм Escherichia coli М-17, который трансформировали дезоксирибокуклеиновой кислотой новой плазмиды р74¹, и отбирали клоны, устойчивые к канамицину и способные синтезировать антибиотик. Новый штамм характеризуется следующими признаками. Морфологические признаки. Грамотрицательные, неспорообразующие, подвижные палочки с закругленными концами. Размеры 1,1-1,5х2,0-5,0 мкм. Культуральные признаки. Клетки штамма хорошо растут на простых питательных средах мясопептонном агаре (МПА), агаризованном бульоне Хоттингера, минимальных средах с глюкозой, глицерином. При выращивании в течение 1 сут при 37^оС в жидком бульоне Хоттингера или на мясопептонном бульоне (МПБ) дают равномерное помутнение бульона. При росте на агаризованном бульоне Хоттингера или МПА образуют серовато-желтоватые округлые колонии (иногда с фестончатыми краями): на среде Эндо образуют красные с металлическим блеском колонии (1-2 сут 37^оС). Физиолого-биохимические признаки. Факультативный анаэроб. Температурный оптимум при росте на бульоне Хоттингера или МПБ 37^оС. Расщепляет с образованием кислоты и газа глюкозу, лактозу, сахарозу, мальтозу, рамнозу, арабинозу, маннит, инозит, очень слабо утилизирует сорбит. Не утилизирует цитрат натрия и малонат натрия. Уреазная активность отсутствует. Сероводород не образуется. Синтезирует β-галактозидазу. Образует индол. Не синтезирует фенилаланиндезаминазу. Желатиназная активность отсутствует, молоко сбраживает. Активности лизиндекарбоксилазы и орнитиндекарбоксилазы обнаруживаются. Аргининдигидролаза отсутствует. Штамм принадлежит к серологическому типу 02:К1(L):Н6. Отсутствуют адгезивные антигены К88, К99, F41, Аtt25, 987P. Штамм устойчив к канамицину (100-200 мкг/мл). Штамм хранится в лиофильно высушенном состоянии не менее одного года. Клетки, выросшие на косяках с агаризованным бульоном Хоттингера в течение суток, смываются раствором для лиофилизации следующего состава: 1 мл физиологического раствора + 1 мл смеси (10 мл сыворотки крови крупного рогатого скота без консерванта + 1 мл раствора сахарозы 30 г / 30 мл). П р и м е р 1. Получение плазмиды р74¹. Для получения новой мутантной плазмиды, неспособной к конъюгативному переносу, был использован E.coli С 600 (pl, RSF 1010). Плазмида pl, определяют синтез микроцина широкого спектра действия, плазмида RSF 1010 устойчивость к стрептомицину (100 мкг/мл) и сульфаниламидам. а) передача плазмид р1 и RSF 1010 с помощью конъюгации в клетки E.coli МКD5208. Донорный штамм E.coli С 600 (р1, RSF 1010). Реципиентный штамм E.coli МКD 5208F^-, прототроф, sup^o, val-r, sts-s. О передаче плазмиды рl в клетки E.coli МКD 5208 судили по мобилизации рl неконьюгативной плазмиды RSF 1010, определяющей устойчивость к стрептомицину (100 мкг/мл). Клетки донорного и реципиентного штаммов растили в LD бульоне до титра 1 х 10⁸ кл/мл, отбирали по 5 мл каждого штамма и смешивали в колбе на 100 мл для конъюгации. Клетки бактерий росли 18 ч при 37^оС без качания. Затем клетки центрифугировали, отмывали 2 раза физиологическим раствором, ресуспендировали в физиологическом растворе до исходного объема и высевались с помощью шпателя на чашки с агаризованной минимальной средой следующего состава (на 1 л дистиллированной воды), г: NH₄Cl 1; KH₂PO₄ 1,5; Na₂HPO₄ 3,5; MgSO₄ 0,1; глюкоза 24, рН 7,0-7,5, к которой был добавлен стрептомицин (100 мкг/мл). На этой среде могли расти лишь клетки E.coli МКD 5208, несущие плазмиду RSF 1010. Как правило, эти клетки содержали также плазмиду pl, что определялось по образованию микроцина (его выявляли по наличию зон плавления роста клеток E. coli вокруг уколов испытуемого штамма), а также по анализу плазмидной ДНК. В результате этой работы был получен штамм E.coli МКD 5208 (р, RSF 1010). б) введение транспозона Тn 5 в природную плазмиду pl. Ночную культуру штамма E.coli МКD 5208 (RSF 1010, pl) разводили средой LD до оптической плотности 0,1 ( λ560 нм), инкубировали с аэрацией до плотности 0,8, осаждали центрифугированием (4500 об/мин) 10 мин, суспендировали в прежнем объеме среды LD с MgCl₂ (0,01 М). К 0,1 мл клеток добавляли 0,1 мл суспензии фага λ:Tn 5 (титр фага 5,0 х 10⁸ед./мл), инкубировали с аэрацией 20 мин при 30^оС, добавляли 0,2 мл среды LB + MgCl₂, инкубировали еще 20 мин при 30^оС. Клетки высевали на чашки с агаризованной средой LB с канамицином (200 мг/мл), растирали шпателем и растили 1 сут. Выросшие колонии смывали физиологическим раствором и выделяли плазмидную ДНК (как описано ниже, раздел в). Плазмидной ДНК трансформировали (пример раздела г) клетки штамма E.coli МКD 5208. Отбор клонов вели по устойчивости к канамицину (200 мкг/мл) и чувствительности к стрептомицину (100 мкг/мл). В результате были отобраны клоны E. coli МКD 5208, содержащие плазмиды pl Tn 5 и не содержащие плазмиды RSF 1010. в) выделение плазмидной ДНК. Клетки из ночной культуры E.coli осаждали центрифугированием, суспендировали в 1 мл раствора А (50 мМ глюкозы, 10 мМ ЭДТА, рН 8,0 25 мМ трис-HCl, рН 8,0, лизоцим 2 мг/мл), добавляли 2 мл раствора В (1 SDS, 0,2 н. NaOH), осторожно перемешивали, добавляли 1,5 мл 3М ацетата Na (рН 4,8), выдерживали 1 ч при 0^оС. Смесь центрифугировали 20 мин при 16000 об/мин, к супернатанту добавляли изопропиловый спирт (0,6 от исходного объема смеси). Осадок промывали 70%-ным этанолом, подсушивали и растворяли в 100 мкл буфера ТЕ (10 мМ трис-НСl, рН 8,0; 1 мМ ЭДТА, рН 8,0). Образцы анализировали в 0,7%-ном агарозном геле в ТВЕ буфере (50 мМ трисборат, 4 мМ ЭДТА, рН 8,0). г) трансформация клеток E.coli МКD 5208 плазмидной ДНК. Плазмидной ДНК, выделенной из устойчивых к канамицину (200 мкг/мл) клеток E. coli МКD 5208 (pl, RSF 1010), после введения Tn 5 трансформировали клетки E. coli МКD 5208. Ночную культуру штамма E.coli МКD 5208 разводили в 100 раз средой LB и подращивали до середины логарифмической фазы роста. Клетки в объеме 400 мл осаждали центрифугированием, промывали 0,14 М NaCl, суспендировали в 2 мл 50 мМ CaCl₂, инкубировали в ледяной 1 бане 20 мин. К 50 мкл компетентных клеток добавляли 10 мкл суммарной плазмидной ДНК (в концентрации 0,1 мг/мл) и инкубировали 40 мин в ледяной бане. После температурного шока (42^оС, 3 мин) клетки разводили в 0,5 мл среды LB и инкубировали с аэрацией в течение 1-1,5 ч при 37^оС. Высев клеток производили на агаризованную среду LB с канамицином (200 мкг/мл) и инкубировали 1 сут при 37^оС. д) отбор клона, содержащего новую неконъюгативную плазмиду р74¹. Чтобы отобрать мутантную неконъюгативную плазмиду, проводили конъюгационное скрещивание донорных клонов E.coli МКD 5208 (pl Tn5) с реципиентным штаммом E. coli С 600 str-r, как описано в примере а). После 18-20 ч роста смешанной культуры клетки без отмывания физиологическим раствором высевали на чашки с агаризованным бульоном Хоттингера, к которому добавляли канамицин (200 мкг/мл) и стрептомицин (100 мкг/мл). Если клоны донора содержали неконъюгативную плазмиду, то на чашках с этой средой не вырастало ни одной колонии. Таким образом был отобран клон E.coli 5208 (pl Tn 5), несущий неконъюгативную плазмиду, названную р74¹. П р и м е р 2. Получение нового штамма Escherichia coli ВКМ СR-322D. Из клеток отобранного клона E.coli МКD 5208 (р74¹) выделяли плазмидную ДНК (как описано выше) и трансформировали ею (метод трансформации выше) клетки Escherichia coli М-17. Отобрали клоны, устойчивые к канамицину (100 мкг/мл) и способные синтезировать микроцин. Клетки рассевали два раза до отдельных колоний на среде с канамицином и проверяли на прототрофность, способность синтезировать микроцин и наличие плазмиды р74¹. Штамм, проявляющий эти признаки, был назван Escherichia coli BKM СR-322Д. Свойства нового штамма иллюстрируются следующими примерами. П р и м е р 3. Изучение антагонистических свойств нового штамма. Для оценки антагонистического действия клетки штамма высевали уколом на чашки с агаризованной средой и выращивали 2 сут при 37^оС. Выросшие колонии убивали парами хлороформа, после чего поверхность среды заливали вторым слоем 3 мл 0,7%-ной агаризованной среды того же состава, смешанной с 0,1 мл индикаторной культуры E. coli В, выросшей до экспоненциальной фазы роста (1-3 х 10⁸ кл/мл) на качалке в жидкой среде того же состава. Вокруг колоний штамма в этих условиях образовывались прозрачные зоны подавления роста индикаторного штамма до 400 мм в диаметре. Оптимальная активность штамма на минимальной солевой среде (г/л дистиллированной воды): NH₄Cl 1 г; КH₂PO₄ 1,5 г; Na₂HPO₄ 3,5 г; MgSO₄ 0,1 г; агар (Дифко или Феррак) 1,5% глюкоза 0,2% дрожжевой экстракт (Дифко) 0,3% рН 7,0-7,5. Штамм выделял вещество с антибактериальным действием, диффундирующее через целлофан и чувствительное к протеазам. Штамм проявлял антагонистическую активность против E.coli (действовал на все изученные в этом отношении штаммы E.coli различного происхождения, в том числе штаммы-возбудители колибактериоза сельскохозяйственных животных), а также Shigella, Salmonella, Proteus, Enterobacter, Serratia, Citrobacter, Klebsiella, Pseudo- monas, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus. В табл. 2 приведены результаты одного из опытов по действию клеток нового штамма на различные бактерии. П р и м е р 4. Изучение вирулентности и приживаемости нового штамма в организме лабораторных животных и телят. Штамм не вызывал гибели мышей с массой 16-20 г при введении им подкожно 10⁹ клеток, а также при введении внутрибрюшинно 5 х 10⁸ клеток. При пероральном введении штамма 7-дневным крысятам-сосункам (5 х 10⁸ клеток), а также при анальном введении 3-дневным мышам-сосункам (2-5 х 10⁸ клеток) установлена его безвредность. При вскрытии животных не было обнаружено микроскопически и макроскопически каких-либо воспалительных или дистрофических изменений в кишечнике. Показано, что штамм не продуцирует термолабильный и термостабильный энтеротоксины. Установлена хорошая приживаемость штамма в кишечнике крысят-сосунков; клетки выделялись из кишечника крысят на протяжении 30 дней (срок наблюдения). Штамм безвреден для телят при пероральном введении и не вызывает у них патологических изменений. П р и м е р 5. Получение препарата из клеток Escherichia coli ВКМ СR-322Д. Для получения из клеток нового штамма живого бактериального препарата, используемого для профилактики колибактериоза у телят, культуру растили одним из двух общепринятых способов. Клетки выращивали в чашках или матрицах на поверхности агаризованного (1,5% агара) бульона Хоттингера в течение 20 ч при 37^оС, после чего клетки смывали физиологическим раствором. С 1 см² поверхности питательной среды получают 0,8-1,0 х 10⁹ клеток бактерий. Культуру выращивают в ферментере слитно в жидкой питательной среде бульоне Хоттингера или бульоне, разбавленном в 4 раза минимально-солевой средой следующего состава (на 1 л дистиллированной воды): NH₄Cl 0,5 г, КН₂РО₄ 0,75 г, Na₂HPO₄ 1,75 г; MgSO₄ 0,05; глюкоза 0,3% рН 7,0-7,5. С 1 мл среды получали 7-10 х 10⁹ клеток. Препарат применяли в виде суспензии клеток в физиологическом растворе. Он может быть применен также в виде лиофилизованной культуры, разведенной перед использовании кипяченой водой или физиологическим раствором. Для лиофилизации клетки суспендировали в сахарозожелатиновой среды (1% желатина и 10% сахарозы в дистиллированной воде). Суспензия клеток в физиологическом растворе или прокипяченной воде сохранялась в холодильнике при температуре 4-12^оС и была пригодна к употреблению в течение не менее 10 дней; за этот период времени концентрация клеток уменьшалась не более чем в 2,5 раза. П р и м е р 6. Применение препарата из клеток нового штамма для профилактики и лечения колибактериоза у телят. Новорожденным телятам давали per os по 15 мл препарата (суспензия клеток в физиологическом растворе или прокипяченной воде, всего в количестве от 2 х 10¹⁰ до 1 х 10¹¹ клеток) за 30 мин до кормления 2 раза в день, начиная с первой выпойки молозива. С целью профилактики колибактериоза препарат живой культуры давали в течение 4 дней, с целью лечения в течение 6 дней. Препарат живой культуры испытывали на новорожденных телятах, принадлежащих различным совхозам, которые отличались по условиям содержания, кормления животных, а также по характеру протекания заболевания и наблюдаемому отходу животных. Хозяйство N 1. В хозяйстве у новорожденных телят наблюдали диарею. Препарат давали в течение 4 дней. У 10 опытных телят в первые 4 дня клинических признаков заболевания не было, на 5-7 день у отдельных телят наблюдалась легкая диарея, которая исчезла через 2 дня. Все 10 телят контрольной группы заболели диареей и подверглись лечению противоколибактериозной сывороткой. Хозяйство N 2. В хозяйстве наблюдался колибактериоз новорожденных телят. Препарат давали в течение 4 дней. У 12 телят наблюдали легкую диарею, которая прекращалась через 2-3 дня. Все 12 контрольных телят болели тяжелой формой диареи, из них 2 теленка (16,7%) пали, остальные после длительного лечения выздоровели. Хозяйство N 3. На животноводческом комплексе у новорожденных телят наблюдали колибактериоз. Препарат давали в течение 4 дней. Препарат испытан на 15 телятах. Телята заболевали на третьи сутки, диарея протекала 24-32 ч в легкой форме. Применение отваров и чая было достаточно для прекращения заболевания. Из 15 контрольных телят все переболели диареей, причем 3 теленка в очень тяжелой форме. Для лечения применяли антибиотики и сульфаниламидные препараты, а также сыворотку против колибактериоза, сыворотку по Кадыкову и глюкозу. Хозяйство N 4. Стационарно неблагополучное по колибактериозу. Препарат давали в течение 6 дней. Препарат был испытан на 16 телятах. Из них заболело 7 (43,7%) животных, пал 1 (6,25%) теленок. Из 16 контрольных телят заболело тяжелой формой диареи 12 (75%) телят и пало 4 (25%) теленка. Все телята контрольной группы подвергались длительному и усиленному лечению. Хозяйство N 5. В хозяйстве наблюдалась диарея у новорожденных телят. Препарат давали в течение 4 дней. Ежедневно отбирали пробы фекалий, которые высевали на дифференциально-диагностическую среду Эндо с канамицином, определяя в фекалиях наличие клеток нового штамма. Препарат испытан на 7 телятах. Установлено, что клетки нового штамма сохраняли жизнеспособность в кишечнике через 6-8 дней после последней дачи препарата. Пищеварение нормализовалось к 6-7 дню. Результаты испытаний, приведенных в 5 хозяйствах, показывают, что препарат, приготовленный из живой культуры нового штамма: безвреден для новорожденных телят; приживается в кишечнике новорожденных телят; предотвращает заболевание телят колибактериозом, заболевание протекает в легкой форме (слабая диарея, прекращается через 2-3 дня), не требующей применения антибиотиков, сульфаниламидных и других дорогостоящих лекарств, для лечения диарея доста- точно применение диеты, отваров и чая; повышает выживаемость заболевших животных. Приведенные примеры показывают, что новый штамм может быть успешно использован для профилактики и лечения колибактериоза новорожденных телят.

Формула изобретения

1. Плазмида р74¹, определяющая синтез микроцина, мол.м. ЗОМДа, содержащая ДНК плазмиды рl штамма Enterobacter sp. фрагмент ДНК фага λ содержащий транспозон Тn 5 в области tra гена, 6 фрагментов с размерами 25,0; 9,0; 6,8; 2,5; 2,2; 2,2, образующихся при расщеплении рестриктазой Есо RI, 5 фрагментов с размерами 24,0; 23,0; 3,3; 2,5; 2,0, образующихся при расщеплении рестриктазой Sal Gl 8 фрагментов с размерами 15,0; 14,0; 7,5; 4,0; 3,5; 3,3; 3,0; 1,8, образующихся при расщеплении рестриктазой Hindl III, 7 фрагментов с размерами 20,0; 14,0; 4,5; 3,8; 3,5; 2,5; 2,0, образующихся при расщеплении рестриктазой Pvu II, гены синтеза микроцина, устойчивости к микроцину, устойчивости к канамицину (100 мкг/мл), неконъюгативна, в клетке штаммов Е. соli в неселективных условиях в течение не менее 100 генераций стабильна, в клетках Е.соli присутствует в количестве 1 2 копий на клетку, не соответствует широко распространенным группам несовместимости плазмид, не влияет на скорость роста и морфологию клеток Е.соli, при трансформации клеток Е.соli С 600 ДНК плазмиды р74¹ образует 10² трансформантов на 1 мкг ДНК. 2. Штамм бактерий Escherichia coli ВКМ CR-322Д, обладающий антибактериальной активностью.

РИСУНКИ

Рисунок 1