Способ получения двудольных растений, устойчивых к сульфонилмочевине

 

Использование: генетическая инженерия , в частности получение фрагментов нуклеиновых кислот, кодирующих ацетолактатринтетазу, устойчивую к гербициду. Сущность изобретения: конструируют рекомбинантные плазмидные. ДНК, кодирующие мутантную ацетолактатсинтетазу табака, трансформируют полученными ДНК клети Brassica, или картофеля, или табака, или сахарной свеклы, или дыни, или хлопчатника , или люцерны, отбирают трансформированные клетки, получают суспензионные каллусные культуры, проводят культивирование каллусной ткани и получают регенеранты, устойчивые к гербициду. 14 табл. ел

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)з С 12 N 15/84

ГОСУДАРСТВЕН.!ОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ (21) 4356001/13 (62) 4203296/13 (23) 25.08.87 (22) 30.06.88 (46) 07,06.93. Бюл. N. 21 (31) 900609 (32) 26.08.86 (33) US .(71) Е.И.ДюпонДе Немур Энд Компанй (US) (72) Джон Роберт Бедбрук, Рой Скотт Чэлэфф,. Саверио Карл Фалько, Барбара Джин

Мазур (US) и Нарендра Синг Ядав (lN)

-(56) Chaleff R.S. u Ray ТЯ. Herbicide

Resistant Mutants from Tobacco .Cell

Cultures, Science v.223, 1984, рр. 1148-1151.

Изобретение относится к генетической инженерии, в частности к получению фрагментов нуклеиновых кислот, кодирующих ацетолактатсинтазу, устойчивую к гербициду.

: . Сульфометуронметил и хлорсульфурон ингибируют рост некоторых .бактерий, дрожжей и вьйзйих растений путем ингибироввния,ацетолактатсинтазы (АЛС). первый общий фермент в биосинтезе аминокислот (валин, лейцин и изолейцин) с разветвленной цепью, Три основйых изофермента АЛС, : обозначеннце 1, И и И1, идентифицированы в кишечных бактериях. Изрферменты i и И!, но нв И, являются чувствительными к ингибированию конечного продукта валином.

Каждый из трех бактериальных изоэнзимов содержит большую и малую субъединицы белка. Энзимы АЛС из дрожжей Saccharomyces cerevislae и из некоторых высших рас„„ЯЦ„„1820914 А3 (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДВУДОЛЬНЬ!Х

РАСТЕНИЙ, УСТОЙЧИВЫХ К СУЛЬФОНИЛМОЧЕВИНЕ (57) Использование: генетическая инженерия, в частности получение фрагментов нуклеиновых кислот, кодирующих ацетолактатсинтетазу, устойчивую к гербициду. Сущ-. ность изобретения: конструируют рекомбинантные плазмидные ДНК, кодирующие цутантную ацетолактатсинтетазу табака, трансформируют полученными ДНК клети

Brass!ca, или.картофеля, или табака, или сахарной свеклы, или дыни, или хлопчатни.ка, или люцерны, отбирают трансформированные клетки, получают суспензионные каллусные культуры. проводят культивирование каллусной ткани и получают регенеранты, устойчивые к гербициду. 14 табл. г тении частично охарактеризованы и показывают некоторую степень ингибирования ко- а нечного продукта..Неизвестно, состоят ли Qp энэимы АЛС.дроссей и растений из одного или более различных полипептидов. Данные дают. основание предполагать, что местоположение энзимов АЛС дрожжей и О растений находится соответственно в митохондриях и хлоропластах. ф

Известно выделение генов, кодирующих анаимм АЛС иа кишечимх бактерий ба!топера typhimurlum u Eschurlchis coll, а также дрожжей S.ñåãåvisiàå. Нуклеотидные последовательности генов, кодирующих две субъединицы иэоэнзимов i. И и li! АЛС

E.ñîli, показывают, что они организованы как опероны ifvBN. ilvGM u ilvlH соответственно. Сравнение. выведенных аминокислотных .последовательностей больших

1820914 субьединиц иэоэнзимов АЛС Е.coll показывают три участка, содержащих приблизительно 50ф, консервативных аминокислот, на приблизительно 2/3 состоящих из бел,ков и разделенных участками с малоразличимой гомологией. Консервативные аминокиспотные последовательности встречаются также и среди малых субъединиц бактериальных изоферментов. В дрожжах S,cerevislae был идентифицирован единственный ген ILV2, 10 кодирующий активность АЛС. Анализ нуклеотидной последовательности гена ILV2 выявил, что полипептид, кодируемый им, гомологичен большим субъединицам бактериальных изоферментов АЛС. Аминокислотная последовательность АЛС дрожжей. характе. ризуется такой же структурной организацией и степенью гомолагии, которая наблюдается между большими субъединицами бактериальных изоферментов, за исключением того, что около 20 девяноста аминокислот в аминоконце дрожжевого белка обеспечивают перенос белка в митохондрию, Ранее не было никакой информации относительно структуры генов растений, кодирующих АЛС, или аминокислотной последователь- 25 ности энзимов АЛС растений, Изофермет! кишечных бактерий представляет собой единственную известную

АЛС в природе, которая является нечувствительной к ингибированию сульфометурон- 30 метилом и хлорсульфуроном. Поэтому кишечные бактерии чувствительны к этим . гербицидам только в присутствии валина, который ингибирует изофермент I. Идентифицированы сульфонилмочевинные герби- 35 цидустойчивые мутантные формы кишечных бактерий Salmonella typhimurlum и Е.соН (отобранные в присутствии валина), дрожжей S.cerevisiae и высших растений

Nicotiana tabacum. (табак), Arabldopsis 40

thaliana M Zea mays (кукуруза) .Эти мутантные фенотипы совместно расщепляются к гербицидустойчивым формам АЛС посредством генетических кроссов. ВЗ typhimurium гербицидустойчивые мутации связаны 45 с геном, кодирующим АЛС, а в E.coll u

5.cerevisiae эти мутации заключены в структурных генах для АЛС. В высших растениях мутации, ответственные за устойчивость, наследуются как единственные доминант- 50 ные или полудоминантные ядерные призна. ки. В табаке эти мутации картируются по одному из двух несцепленных генетических локусов. Хотя многие гены; вовлеченные в структуру и функцию дифференцированных 55 растительных тканей и органов, не экспрессируются в недифференцированных тка- нях, те, которые учасгвуют в основных клеточных функциях, экспрессируются и могут быть отобраны в дезорганизированном каллюсе или культуре. клеточной суспензии.

Это демонстрировалось во многих случаях путем отбора фенотипа в тканевой культуре, из которой были регенерированы растения, экспрессирующие такой же фенотип, Известен способ получения двудольных растений, устойчивых к сульфонилмочввине, предусматривающий получение суспензионных каллусных культур, отбор клеток, культивирование. каллуса и получение регенерантов, устойчивых к гербициду.

Поскольку ацетолактатсинтетаза представляет собой энзим, вовлеченный в аминокислотный биосинтез, было продемонстрировано, что гены, кодируЮщие этот фермент, экспрессируются в каллюсовой ткани так же, как и в целом растении. Мутанты табака $4, С3 и Нга. устойчивые к сульфонилмочевине и описанные в этом патенте, вначале были отобраны в тканевой культуре и затем регенерированы в целые растения, в которых устойчивые фенотипы были сохранены генетически стабильным образом.

Каллюсные ткани, происходящие от регене- рированных растений или их потомства, продолжают расти при концентрациях гербицида, которые ингибируют рост каллюса дикого типа, Таким образом, устойчивость к гербициду на основе счльфонилмочевины на клеточном. уровне растений указывает на устойчивость на уровне целого растения, Существуют ограничения для получения гербицидустойчивых сельскохозяйственных растений посредством тканевой культуры или обработки семян мутагеном: 1) метод культуры тканей ограничен теми культурами растений, которые могут подвергаться манипулированию в тканевой культуре и регенерации из тканевой культуры, 2) растения, происходящие от обработанных мутагеном семян и может быть из тканевой культуры, могут иметь нежелательные фенотипы, которые потребуют отщепления многочисленных генетических обратных скрещиваний и

3) перенос устойчивого гена путем размножения был бы ограничен культурными сортами одних и тех же видов, а также потребовал бы осуществления. многократных генетических обратных скрещиваний, Поэтому выделение фрагмента. нуклеиновых кислот, способного придать гербицидную устойчивость, и его последующее введение в сельскохозяйственные культурьг посредством генетической трансформации позволяет осу. ществить быстрый межвидовой перенос гербицидной устойчивости и устранить многие из укаэанных ограничений, Многие гены. выделенные иэ одного растения, были введены и экспрессированы в других растениях, нерастительные гены

1820914

3D

40

50 были экспрессированы в растениях только как химерные гены, в которых кодирующие последовательности нерасгительных генов были сплавлены с растительными регуляторнымй последовательностями, необходимыми для экспрессии генов. Однако было бы трудно ввести гербицидную устойчивость в растения путем введения химерных генов, состоящих иэ бактериальных или дрожжевых генов, кодирующим гербицидустойчивую форму АЛС, поскольку а) эти микробные АЛС-энзимы, как полагают, не содержат специфической сигнальной (транзитной) пептйдной последовательности, необходимой для ввода в растительные хлоропласты, представляющие собой клеточное местоположение растительной АЛС, б) бактериальные изоферменты состоят из двух различных полипептидных субъединиц и в) микробные АЛС-ферменты не могут функционировать оптимально в чужеродной клеточной среде высших растений. Следовательно, существует необходимость во фрагментах нуклеиновых кислот, которые кодируют гербицидустойчивую форму растительной АЛС и которые придают гебицидную устойчивость, когда они введены в гербицидчувствительные растения.

Предлагается использование фрагмента нуклеиновых кислот, кодирующего ацетолактатсинтетазу растений, встроенного s конструкцию нуклеиновых кислот, используемую для трансформации растений, содержащих ацетолактатсинтетазу дикого типа, которые являются чувствительными к гербицидному соединению сульфонилмочевины,.причем указанный фрагмент нуклеиновых кислот имеет по крайней мере одну точковую мутацию относительно фрагмента нуклеиновых кислотдикого типа, кодирующего ацетолактатсинтетазу растений таким образом, что при трансформации указанной конструкцией нуклеиновых кислот указанное растение приобретает устойчивость к внесению гербицидного соединения сульфонилмочевины.

Сущность изобретения состоит в следующем.

Получение фрагментов ДНК, кодируюtwx. гербицидустойчивую АЛ С.

Каллюснеые культуры чувствительного к гербициду.табака (Nicotiana tabacum, разновидность ХощЫ) подвергают воздействию сульфомвтуронметила при 2 ч. на млрд;

Отбирают устойчивые клеточные линии, обозначенные СЗ и S4. Стандартный генетический анализ растений, регенерированных из этих клеточных линий, показывает, что каждая из линий СЗ и S4 несет единственную полудоминантную ядерную генную мутацию, отвечающую за признак устойчивости к гербициду, а также то, что мутации СЗ и S4 не связаны генетически, т.е. находятся в. различных генах, обозначенных

SURA u SURB соответственно. Как показывает анализ, линии СЗ и S4 продуцируют активность энэима -АЛС, в 100 раэ более устойчивого к сульфонилмочевинным гербицидам-хлорсульфурону и сульфометуронметилу, чем АЛ С дикого типа. Устойчивость АЛС

10 к гербициду в генетических кроссах выделяется вместе с устойчивостью к ингибированию роста гербицидами. Наблюдение двух различных генов, которые мутировали с образованием гербициду- стойчивой АЛС, не было неожиданным, поскольку йлаЬасит, как полагают, представляет собой аллотетраплоид; . образованный иэ йлоаеп1оэИога(з и N.sylvestris, по сущестау содержащих два полных генома. Так, каждая клеточная линия СЗ и S4 содержит один мутант и один ген АЛС дикого типа. Клеточную линию $4 подвергают воздействию сульфометуронметила при 200 ч. на млрд., избирательная концентрация которого пол25 ностью ингибирует. рост S4. Идентифициру-. ют клеточные линии, устойчивые к 200 ч. на млрд., одну такую линию обозначают Нга.

Испытания показывают, что Hra выдерживает концентрации сульфомету- ронметила, которые в 1000 раз выше, чем те, которые требуются для полного ингибирования роста калл юса дикого типа. Как показывает анализ, линия Hra кросс устойчива к хлорсульфурону. Растения регенерируют из каллюсных культур Hra. Генетический анализ растений показывает, что мутации Hra u

S4 связаны, что говорит о том, что линия Hra содержит вторую мутацию в мутантном гене прародительной линии S4. Определяют активность АЛС в экстрактах листьев дикого типа и растениях табака гомозиготного мутанта Hra. Активность АЛС в экстракте из растений мутанта Hra приблизительно в

1000 раз более устойчива к хлорсульфурону, чем активность растений дикого типа

Для. того, чтобы клонировать устойчивый к гербициду ген АЛС, ДНК табака выделяют из гомозиготной мутантной линии $4

Й1со !апа tabacum. Порции по 50 г каллюсной ткани замораживают в жидком Nz и затем лиофилиэуют, Полученную высушеннун ткань потом измельчают при температуре около 23 С в мешалке с использованием 15секундных. импульсов до превращения в по55 рошок. 10 объемов сахарозного буферного раствора {О;3 М сахарозы; 50 мМ трис-НО рН 5; 5 мМ MgClg} прибавляют к смеси и полученную суспензию инкубируют при 0 С

s течение 5.мин. Суспензию фильтруют черве марлю и цеитрифугируют лри 350 х g u

1820914 течение 10 мин. Ядерный осадок в виде гранул ресуспендируют в лизисном: буферном растворе (20.мМ ЭДТК, 50 мМ трис-HCI pH

8, 1 Sarkosyl), прибавляют CsCI с получением 0,95 r на мл буферного раствора и полученную смесь центрифугируют при

17000 х g в течение 20 мин при 4 С. Зтидий бромид прибавляют к полученному супернатанту до концентрации 400 мкг на мл, показатель преломления регулируют до

1,39 и полученный раствор центрифугируют йри 90000 х g в роторе типа Beckman Tl 70 при 20 С в течение 3 суток. Полученную флуоресцентную полосу ДНК отщепляют от градиента и обрабатывают изопропанолом для экстрагирования этидий бромида, В заключение ДНК диализуют против буфера ТЕ и осаждают путем прибавления этанола, Из этой ДНК получают геномную библиотеку й!со0апа следующим образом, используя лямбда-вектор фага EMBL4. Фаг

EMBL4 получают из биомассы с агарозных чашек. Получают фаговую ДНК путем концентрирования. фага полиэтиленгликолем, удаления полиэтиленгликоля хлороформом и очистки фага с использованием ступенчатых градиентов глицерина. Полученный очищенный фаг затем обрабатывают дезоксирибонуклеазой и рибонуклеазой перед экстракцией фенолом. Фаговую ДНК извлекают из этанола. Для получения плеч фага

ЕМВ(4 фаговую ДНК псоледовательно гидролизуют эндонуклеазами Sat! и Bam Hl.

Плечи отжигают и затем отделяют от центрального фрагмента ía 10-40%-ном сахарозном градиенте. Плечи. полностью денатурируют и повторно.отжигают перед лигированием к ДНК табака. ДНК табака, полученную описанным образом, частично обрабатывают эндонуклеазой SAU3A и осаждают посредством градиента 10-40%ной сахарозы. Фракции от сахарозного градиента затем анализируют электрофорезом на 0,5 -ых агарозных гелях. Фракции, содержащие фрагменты в диапазоне размеров. 20 — 40 кб, диализуют, осаждаЮт и лигируют к плечам ДНК лямбда-фага, ДНК лигируют при концентрации 135 мкг на мл вектора и 45 мкг на мл вставки ДНК, Полученные лигированные контактамеры затем упаковывают с использованием экстрактов .упаковки лямбда-ДНК..Выхо фага составляет приблизительно 4,5 х 10 фагов на мкг вставки ДНК. Конструируют библиотеку из приблизительно 400000фагов, представляющую примерно.99%-ную полную библиотеку для табака, которая имеет приблизительно геномное содержанием 1,65 пикограммов или 1,52 х 10 пар оснований;

Полученную фаговую библиотеку ДНК

Nlcotlana выращивают и высевают на чашки на штамме (Е392 „Е.coll (АТСС 33572). Фаги высевают на чашки с получением 2000 — 5000

5 пятен на 90 мм чашках Петри или 50000 пятен на 150 мм чашках Петри. Вслед за переносом фаговой ДНК к нитроцеллюлозным фильтрам последние предварительно гибридизируют путем инкубирования в те10 чение приблизительно 4 ч при 56 С в 6 х

SSPE, содержащем 0,5% SDS, 100 мкг на мл денатурированной ДНК телячьего тимуса и

10 х раствора Denhardt. На этой стадии прибавляют свежую аликвоту гибридизирован15 ного раствора вместе с приблизительно 10 отсчетов в минуту радиоактивного зонда гена дрожжевой АЛС. Гибридизацию проводят в течение 24 — 48 ч при 56ОC. В этот момент фильтры вначале промывают в тече20 ние приблизительно 4ч вбxSSPEпри56 С, затем промывают еще трижды в течение 20 мин каждый раз в 2 х SSPE при температуре около 23"С. Затем фильтры сушат и подвергают воздействию ретгеновской пленки

25 Kodak XAR или ЯР и усиливают его экрана

Du Pont Crone&Lightning Plus при -70 С в течение 2 дней. Открытые места на пленке указывают положение пятен, потенциально содержащих гены АЛС Nlcotlana.

Полученные авторадиограммы затем ориентируют над первоначальными, бактериофагсодержащими чашками Петри. С использованием широкого конца стерильной пастеровской пипетки вырезают пятна, соответствующие наиболее темным местам на авторадиограммах. Собранные пятна затем элюируют в буфер SM и высевают на свежие чашки Петри диаметром 90 мм. Каждая чашка получает около 100-200 фагов. Затем повторяют полный процесс определения местоположения фагов, используя вновь приготовленный зонд. Таким образом повторяют стадии определения местоположения и выделения фагов до тех пор, пока большинство пятен не покажет присутствие фага, содержащего ДНК, способную гибридизироваться к зонду гена АЛС дрожжей, Выделяют мини-препараты ДНК из очищенного от пятен фага, обозначенного Nt

А13. Продукты переваривания мини-препаратов ДНК с помощью рестрикционной эндонуклеазы ЕсоЮ подвергают электрофорезу через 0,7% агарозные гели и блоттингу на нитроцеллюлозных фильтрах. Фрагменты, содержащие ген АЛС, затем идентифицируют путем гибридизации с зондом дрожжевого АЛС-гена. Фрагменты, способные гибридизироваться е зондом, затем выделяют и субклонируют в векторы рВВ322, 1820914

10.

М13гпр9 или M13mp18. Эти фрагменты далее Hind III u BamH у нуклеотидов 1540 и 2518, секвенируют с использованием олигонуклео- соответственно; тидных праймеров методом дидезокси-тер- r) последовательность BamH 1-Cia I минирования цепи. Используют комплект длиной 702 пн, содержащая 3 -участок гена

I приборов, поставляемый New England 5 нопалинсинтазы(нуклеотиды 848 — 1550).

Biolabs.Использованиесинтетическихолиго- Нуклеотидная последовательность у нуклеотидныхпраймеровпозволяетосущест- слияния NOSP и кодирующей последовавить растяжение ДНК-последовательности тельности NPT II выглядит следующим вдоль клонированного фрагмента s перекры- . образом: последовательность NOS вающихся сегментах. С помощью Э ВМ-ана- 10 последователь. ность N P T I I лиза последовательности ДНК идентифи- AATAATCTGCAGCAAGCTTGCGGGGA цируют открытую рамку считывания 667 ко- TCGTTCG С ATG,..... дов. Выведенная аминокислотная последа- Pst I Hind III вательность этой открытой рамки считывания Вектор pKNK расщепляют рестрикцион. в основном гомологична последовательно-. 15 ным энзимом Sal I (BRL), полученный линейстям, ранее определенным иэ гена !1Н2 ный вектор после экстракции фенолом

Saccharomyces cerevIsIae и гена !Ь6 Е.coli, соединяют в присутствии ДНК-лигазы Т4 с что указывает на то, чтофрагментДНК, вос- очищенным фрагментом Sal I (2,1 кб), несустановленный из геномной библиотеки щим бэктериальный ген неомицинфосфотNlcotiana, содержит ген АЛС табака. Для 20 рансферазы I (НРТ !) в качестве селектирутого, чтобы определить, кодируетли этот ген - емого маркера для бактериальной устойчиАЛС гербицидчувствительный энзим дикого вости к канамицину. Лигазную смесь испольтипа или мутантный гербицидустойчивый вуют. для трансформации компетентных энзим из линии S4, ген вводят в гербицид- клеток НВ101 Е.со!1, и трансформанты сечувствительный табак дикого типа путем 25 лектируют на чашках, содержащих 100 мг/л ..

1ранаформации, опосредственной Agrobac- канамицина. Полученную рекомбинантную

ferIum tumefaciens. плазмиду, обозначенную pKNKS, подвергаТребуется генетический маркер для от- ют очистке. бора трансформированных растительных Ппазмиду pKNKS расщепляют рестрйкклеток. Используют устойчивость к антиби- 30 ционным.энзимом Есо Rl (BRL) и ее концы отику 6-418, получаемую в результате того, затупляют фрагментом Кленова (ВВЦ, Поп. чтобактериальный ген ИРТ11, кодирующий ученную линейную ДНК соединяют в принеомицинфосфотрансферазу, экспрессиру- сутствии ДНК-лигазы Т4 (New England ется в растениях. Дпя осуществления экс- . Bioiabs) с фосфорилированными линкерами прессии NPT 11 регуляторные последова- 35 Bgl П. Вслед за экстенсивным переваривательности растений синтезируют с участком нием рестрикционным энзимом Bgl П (ВК1 ) кодированияйРТ1.1 ввекторерКМК.Вектор для удаления избыточных линкеров ДНК рКНК происходит от часто используемой. пропускэютчерезколонкугель-фильтрации плазмидыpBR322 в результате отщепления Сефадекс G-150 (очищенный) с тем, чтобы сайтов Hind !П и Bam Н1 и вставки в сайт С!а 40 отделить ее от линкеров. Фрагмент ДНК вы- .

I фра1 мента Оа (приблизительно, 2,3 кб), деляют и обьем регулируют с получением который состоит из следующих компонен- концентрации ДНК около 78 мкгlмл. 1 мкп тов: ДНК сэмолигируют в присутствии ДНК-лиа) последовательность Оа I-Bgl П дли- - газы Т4 в общем объеме 5 мкл и используют ной 320 пн, содержащая промоторный уча- 45 для трансформации компетентных клеток сток гена неомицинфосфотрансферазы HB101 E.col!, Ампициплинустойчивые кпет(йЯТ П) транспозона Тп 5, происходящего в ки содержат плазмиду pKNKSG, которая результате преобразования сайта Hind:П! в идентична плаэмиде pKNKS за исключенисайт Cia f; ем того. что рестрикционный.сайт EcoRI зэб) последовательность SaU ЗА-Pst 50 мещен сайтом Bgl II, длиной 296 пн, содержащая промотор нопа- Фрагмент Sma I фага NtA13 содержит линсинтазы (NOSP). происходящий от гена участок, который гибридизируется к дрожнопалинсинтазы (NOS) (нуклеотиды -263 до жевому гену АЛС. Фаг МА13 частично пере+33), относительно сайта начала транскрип- варивэют рестрикционным знзимом Sma I u ции, путем создания сайтэ Pst I кодона ини- 55 вслед зэ экстракцией фенолом присоединяциации; ют к фосфорилированным лин кер м BamH I в) последоватеьность Hind Ill-Bam Ht в присутствии ДНК-лигэзы Т4. После гидродлиной 998 пн, содержащая кодирующую лиза BamH I иудаления избыточныхлинкепоследовательностьдля гена NRT 11, проис- ров путем эпектрофореза на эгэрозном геле ходящего от Тп 5, путем создания сайтов рестрикционный фрагмент BamH (16 кб), 1820914

10

25

40

55 содержащий АЛС-ген табака от фага NtA13, выделяют из геля эпектроэлюированием и используют для дальнейшего клонирования.

Вектор pKNKSG линеаризуют рестрикционным знзимом Bgl II (BRL) и вслед за дефосфорилированием кишечной .фосфатазой теленка его присоединяют в присутствии ДНК-лигазы Т4 к рестрикционному фрагменту (16 кб) BamH I, происходящему из фага NtA13. Лигазную смесь используют для трансформации компетентных клеток

НВ101 Е.соИ и отбирают ампициплинустойчивые трансформанты, которые. содержат рекомбинантную плазмиду, обозначенную

plV13. Ориентация фрагмента-вставки в

plV13 такова, что рамки считывания гена

NOS;NPTII в векторе и гена АЛС во вставке находятся в противоположных направлениях. После очистки тремя штриховыми разводками одной колонии НВ101 (plV13) используют для трехродительского скрещивания. 3 мл ночных. культур НВ101 Е,coll (p1V13) и НВ101 Е.coll (pRK2013) (номер

АТСС 37159) в среде LB, содержащй 25 мг/л кэнамицина, выращивают при 37ОС, а

GV3850 Agrobacterium tumefaciens — в среде

LB при 28-29 С. Клетки собирают при ком-. натной температуре в клинической центрифуге, промывают один раз в среде LB, не содержащей лекарства. собирают и ресуспендируют в 3 мл LB. 0,25 мл аликвоты всех трех штаммов смешивают в пробирке и смесь переносят на миллипоровый фильтр (2,5 см HAWP, 0,45 мкм), помещенный на поверхности трех фильтров из ватманской бумаги N. 1 в чашке Петри. После того, кэк вся жидкая среда абсорбирована ватманским фильтром (около 30 мин), миллипоровый фильтр с бактериями на его верхней поверхности кладут (сторона с бактериями показывает наверх) на чашку со средой LB беэ лекарства. После инкубирования в течение ночи при 28-29 С миллипоро.вый фильтр переносят к 5 мл 10 мМ раствора

MgS0p и завихряют с тем, чтобы ресуспендировать бактерии в.растворе. 0,1 мл алик воты высевают на чашки с .селективной средой (чашки с минимальной средой М9, содержащей 20 сахарозу, 1 мМ MgS04. 1

MM CaCIz и 1 мг/мл канамицина (Sigma)).

Через примерно 4 дня инкубирования при

28-29ОС проявляются несколько больших колоний. Очищают несколько трансконъюгантов тремя последовательными штриховым разводками (одноколониевыми) на тех же селективных чашках. Ожидают pocT TollbKo Agrobacterium, содержащих плазмиду

plV13, вновь объединенную с эндогенной плазмидой рбЧ3850 за счет их общих последовэтельностей pBR322. Это подтвердилось анализом "Southern" перед использованием изготовленной Agrobacterium, 6ЧКМТ13 для трансформаций растений, Для трансформации растительных клеток следуют стандартным асептическим методикам для манипуляции стерильными средами и аксенными растительно-бактериальными культурами, включая использование колпака с ламинарными потоками для всех переносов. Составы сред представлены в примере 6, Консервированные растения табака для заражения листовых пластин выращивают в растильне: 12 ч при дневной температуре 24 С и 12 ч при ночной температуре 20 С, относительной влажности около 80, смешанном свете флуоресцентного и накаленного свечения. Осуществляют заражение листовых пластин табака.

Молодые листья, не полностью распустившиеся и имеющие приблизительно 4 — 6 дюймов (101,6 — 1523 вам) в длину, собирают скальпелем с растений табака (Nicotlana

tabacum, разновидность Xanthl) приблизительно 4 — 6-недельного возраста. Листья поверхностно стерилиэуют в течение 30 мин погружением их в около 500 мл 10 -ro

Chlorox, 0;1 -ro раствора додецилсульфэта натрия и затем промывают 3 раза стерильной деионизированной водой, Листовые пластины диаметром 6 мм получают иэ целых листьев с помощью стерильного бумажного пуансона.

Листовые пластины инокулируют погружением их в течение нескольких минут в 20 мл ночной культуры (разбавление 1:10)

Agrobacterlum, несущей ппаэмиду GCKNT13.

Выращивание культуры Agrobacterium начинают инокулированием 10.мл бульона YEB единственной бактериальной колонией, удаленной из чашки со средой R-агара. Культуру выращивают приблизительно 17 — 20 ч в

18 мл стеклянных пробирках с культурой в качалке с платформой New Вгопзи!сК поддерживэя температуру 28" С.

После инокулировэния листовые пластины помещают на чашки Петри, содержащие среду агара CN. Чашки герметизируют парапленкой и инкубируют при смешанных флуоресцентном и "Сго and Sho" освещениях для растений в течение 2 — 3 дней в камере для выращивания культур, где поддерживается температура около 25 С.

Чтобы избавиться от листовых пластин

Agrobacterium и отобрать для выращивания трансформированных клеток табака, листовые пластины переносят на свежую CN-среду, содержащую 500 мгlп цефотаксима и 100 мг/л канамицина. Цефотаксим сохраняют в виде замороженного 100 мг/мл основно13

1820914 го раствора и прибавляют асептически (стерилизуют через 0,45-микрометровый фильтр) к средам после автоклавирования. . Свежий раствор канамицина (50 мг/мл) приготавливают для каждого использования и стерилизуют через фильтр, пропуская его в аатоклавированные среды.

Листовые пластины инкубируют в описанных условиях в.течение 3 недель и затем переносят на свежие среды такого же состава.

Приблизительно через 1 — 2 недели всхо10 ды, развивающиеся на среде, содержащей канамицин, подрезают стерильным скальпелем и высеаают в среде А, содержащей либо 100 ч. на млрд. хлорсульфурона, либо

100 мг/л канамицина. До истечения 3 недель регистрируют корнеобразоаание на для определения уровней устойчивости к хлорсульфурону и канамицину в проводимом испытании на каллюсовую индукцию на

25 селективных средах. Для индуцирования образования каллюса отрезают маленькие листья, которые разрезают, на несколько .участков с помощью скальпеля и засевают в

В-среду, содержащую либо 10 ч, на млрд, хлорсульфурона; либо 50 мгlп канамицина.

До истечения 3 недель регистрируют калпюсовой рост на селективной или неселективной средах.

Приведенные в табл.1 результаты указывают на то, что трансформация табака

35 была достигнута с помощью штамма

CVKNT13 на основе получения канамицинустойчивого каллюса, Канамицинустойчивый калпюс остается чувствительйым к сульфонилмочевинному герб ициду хлорсул ьфурон, что означает, что ген АЛС, выделенный из мутанта S4 табака в фаге Nta 13, кодирует

40 гербицидчувствительный энзим дикого типа. Этот ген АЛС растений использовался в качестве зонда гибридизации ДНК для выделения других растительных АЛС генов, включая гены, которые кодируют гербицидустойчивую АЛС.

Геномную библиотеку ДНК из мутанта

50

Нга табака конструируют в бактериофаге лямбда и подвергают скринингу на клоны, . которые гибридизируются к гену АЛС табака дикого типа из мутанта S4. Выделяют несколько фаговых клонов. Физическое картирование ДНК-вставок табака с использо- 55 ванием рестрикционных эндонуклеаз выявляет присутствие двух различных классов фрагментов ДНК, представляющих два гена АЛС: SURA u SURB. Сравнение физических карт генов SURA u SURB и tabacum селективной и неселективной средах.

В течение 2 недель посева удаляют ма- 20 ленькие листья с подрезанных проростков с картами от прародительских видов показывает. что ген SURA происходит от

N.sylvectrIs, а ген SURB происходит от

Н tomentosiformis. Ген АЛС дикого типа, выделенный ранее из мутанта S4. обозначают

SURA. Генетическое сцепление гербицидустойчивой мутации высокого уровня в Нга с мутацией $4 показывает. что мутация Hra наблюдается в том же гене АЛС, что и мутация $4, а именно в SURB, Следовательно, ожидается, что ген SURB, выделенный из мутанта Hra, должен быть мутантным геном, обозначенным SURB-HRa и кодирующим гербицидустойчивую АЛС. Выбирают один фаговый клон, содержащий ген SURB — Нга. для дальнейшего анализа. Этот фаговый клон, обозначенный 3, депонирован в Американской коллекции типовых культур, Рокаилл, Мэрилэнд, под каталожным номером

АТСС 40237. Фаговый клон переваривают рестрикционной эндонуклеаэой Spe I с получением ДНК-фрагмента (8,3 кб), который вставляют в сайт ХЬа I плазмиды рМис19, и полученную рекомбинантную плазмиду

pAGS148 депонируют а Американской коллекции типовых культур, Роквилл, Мэрилэнд, под каталожным номером АТСС

67124, Плазмиды рА6$148 и рА6$135 лигируют одну с другой, как описано ниже, и полученную рекомбинантную плазмиду

pAGS152 вставляют а LBA, . 4404

Agrobacterium tumefaciens. Полученную

LBA 4404 (pAGS152) Agrobacterium

tumefaciens депонируют в Американской коллекции типовых культур под каталожным номером АТСС 6712б.

Геномную библиотеку ДНК из.мутанта

СЗ табака конструируют в бактериофаге лямбда и подвергают скринингу на клоны, которые гибридизируются с ранее выделенными генами АЛС из табака. несколько фаговых -клонов выделяют, после чего

ДНК-вставки табака физически картируют рестрикционными эндонуклеазами. Идентифицируют два различных типа фрагментов ДНК, соответствующих гену SURA-СЗ и гену SURB. Для дальнейшего анализа отбирают два фаговых клона, обозначенных 35 и

38 и- несущих ген SURA — СЗ.

Фаговый клон 35 переваривают рестрикционными эндонуклеазами Spe (и Sai .

I с получением фрагмета ДНК (6,3 кб). Этот фрагмент ДНК вставляют в плазмидный вектор р0С119, переваренный рестрикционными зндонуклеазами XbA I u Sal I, и полученную рекомбинантную плазмиду pALS25 депанируют в АТСС, Роквилл, Мэрилэнд, под каталожным номером АТСС 67424.

Кроме четырех генов АЛС табака, а именно SURA и SURB, кодирующих герби1820914 цидчувствительные АЛС дикого типа, и

SURA-СЗ и SURB — Hra, кодирующих мутантную гербицидустойчивую АЛС, гены АЛС выделяют из Arabidopsls thaliana; Beta

vutgaris (свекла сахарная) и часть гена АЛС выделяют из Zea mays (кукуруза). Последние гены NlC из гербицидчувствительных.растений получают из геномных библиотек

ДНК, сконструированных в бактериофаге лямбда скринингом на ДНК, гибридизирующуюся с ранее выделенным геном АЛС из . дрожжей или табака. Ген АЛС дикого типа из сахарной свеклы выделяют в фаге, обозначенном Ф21, и физически картируют рестрикционными эндонуклеазами. Плазмида

pBALS216 депонирована в АТСС, Раквилл, Мэрилэнд, под каталожным номером 67425.

Гены, кодирующие гербицидустойчивые энзимы АЛС, выделены из спонтанных мутантов дрожжей, устойчивых к сульфонилмочевине. Секвенирование этих генов показывает, что молекулярную основу устойчивости составляют изменения в основных парах, приводящие к аминокислотным замещениям в 10 различных положениях в белке (табл.2), имено остатки 121, 122, 197, 205, 256, 359, 384, 588, 591, 595.

В шести из этих положений, а именно

122, 197, 205, 256, 384 и 591 (табл.2), получают более чем одно замещение, придающее гердицидную устойчивость. В положении

122 остаток аланина присутствует во всех известных энзимах АЛС дикого типа за исключением изоэнзйма I Е.coll, в котором остаток 122 замещен на аспарагиновую кислоту, пролин, треонин или валин, что приводит к получению АЛС, устойчивой к сульфонилмочевине. В положении 197. octaток пролина присутствует во всех известных энзимах АЛС дикого типа за исключением изоэнзимов П и III Е.соИ, замещение серина или аргинина приводит к получению АЛС, устойчивой к сульфонилмочевине. В положении 205, где остаток аланинэ-присутству. ет во всех известных энзимах АЛС дикого типа, замена остатка в положении 205 на аспарагиновую.кислоту или треонин прйводит к получению АЛС, устойчивой к сульфо. нилмочевине. В положении 256, где остаток лизина присутствует во всех известных энзимах АЛС дикого типа, замена остатка 255 на глутэминовую кислоту, аспарагин или треонин приводит к получению АЛС, устойчивой к сульфонилмочевине, В положении

384, где аспарагиновая кислота присутствует во всех известных энэимах АЛС дикого типа, замена остатка 384 на глутаминовую кислоту, аспарагин или валин приводит к получению АЛС, устойчивой к сульфонилмочевине. В положении 591, где триптофан

15 к сульфонилмочевине. В положении 359, где

30

40

45 приводящие к замещениям лизина — остатка

55

10 присутствует во всех известных энзимах

АЛС дикого типа, за исключением изоэнзима. I Е.coll, в котором замена 591 остатка на аланин, цистеин, глицин,. лейцин, аргинин или серин приводит к получению АЛС, устойчивой к сульфонилмочевине.

Были получены мутанты, устойчивые к гербицидам на основе сульфонилмочевины, в результате отдельных аминокислотных замещений в других четырех положениях, а именно 121, 359, 588 и 595. В положении

121, где глицин присутствует во всех известных.энзимах АЛС. замещение его серином приводит к получению АЛС, устойчивой метионин присутствует во всех известных энзимах АЛС, замещение его валином приводит к получению АЛС, устойчивой к сульфонилмочевине. В положении 588, где валин присутствует во всех известных энзимах:АЛС, замещение его эланином приводит к получению АЛС, устойчивой к сульфонилмочевине. В положении 595, где фенилаланин поисутствует во всех известных энзимахАЛС, за исключением изоэнзима III E,coll, замещение его лейцином приводит к получению АЛС, устойчивой к сульфонилмочевине.

Олигонуклеотиднаправленные сайтспецифические мутации, приводацие к аминокислотным замещениям в положениях 122, 205, 256, 359, 384 и 591, выполнены в дрожжевом гене, кодирующем АЛС (табл.3).

В положении 122 производят мутации, приводящие к замещениям аланина 18 аминокислотами, присутствующими в АЛС дикого типа. Каждое замещение за исключением глицина приводит к получению AJIC, устойчивой к сульфонилмочевине. В положение

205 мутации, приводящие .к замещениям аланина — остатка дикого типа на цистеин, глутаминовую кислоту, аргинин или триптофан, образуют АЛС, устойчивую к сульфонилмочевине. В положении 256 мутации, дикого типа на аспарагиновую кислоту, глицин, лейцин, пролин или триптофан, образуют АЛС, устойчивую к сульфонилмочевине.

В положении 384 мутации, приводящие к аминокислотным замещениям аспэрагиновой кислоты — остатка дикого типа нэ цистеин, глицин, пролин, лизин, серии или триптофан, образуют АЛС, устойчивую к сульфонилмочевине. В положении 591 мутации, приводящие к аминокислотным замещениям триптофанэ — остатка дикого типа на аспарагиновую кислоту. глутаминовую кислоту, фенилаланин, гистидин, изолейцин, лизин, эргинин, валин, метионин, аспарагин, глутамин, треонин или тирозин, 17

1820914

18 образуют АЛС, устойчивую к сульфонилмочевине, Все мутации, описанные в табл.2 и 3, Е,coll приводят к получению энзимов, которые активны и менее ингибируются гербицидами на основе сульфонилмочевины, чем энзимы дикого типа. Вместе взятые эти результаты показывают, что большинство замещений в этих 10 положениях приводит к получению, ферментативно активной гербицидустойчивой АЛ С;

Аминокислотные остатки в положениях

121, 122, 197, 205, 256, 359, 384, 588, 591 и

595 во всех. растительных энзимах такие же, . которые присутствуют в гербицидчувствительном дрожжевом белке дикого типа. Оказалось, что две мутации генетически связаны и введение этого фрагмента в чувствительные клетки табака придает клеткам такой же óðîвень гербицидной устойчивости, который обнаружен для первоначального высокоустойчивого мутантного растения табака, от которого происходит данный энзим. На основе этих фактов ожидается, что должны быть два аминокислотных замещения в энзиме, кодируемом этим фрагментом. Сравнение выведенной аминокислотной последовательности мутантной АЛС с выве. денной аминокислотной последовательностью АЛС дикого типа выявляет, что мутантная АЛС имеет замещение пролина аланином в положении 197 и замещение триптофана лейцином в положении 591. На основании изложенного обнаружено, что замещения в остатках пролина 197 и триптофана 591 придают гербицидную устойчивость. Сравнение выведенной аминокислотной последовательности мутантного энзима АЛС с аминокислотной последовательностью энзима.АЛС дикого типа выявляет, что мутантная АЛС имеет единственное замещение пролина глутамином в положении l97. Линия клеток СЗ, из которой был получен ген SURA-C3. показывает избирательную гербицидную устойчивость. Это означает, что мутация С3 придает устойчивость к сульфонилмочевинным гербицидам хлорсульфурон и сульфоментуронметил, но не придает устойчивость к гербициду на основе имидазолинона.

Идентификация аминокислотных замещений в гербицидустойчивых энзимах АЛС из растений в положениях 197 (от мутантов

СЗ и Hra) и 591 (от мутанта Нга) показывает, что замещения в положениях, операбельных в дрожжевой АЛС, также операбельны в растительной АЛС..

В то время как аминокислотные остатки, присутствующие в положениях 121, 122;

197, 205, 256. 359, 384, 588, 591 и 595, сохра15 винными гербицидами, чем растительная, или дрожжевая АЛС. Кроме того. сайт-направленная мутация, вызывающая замещеwe серина пролином в положении 197 в

20 Е.coll.ÀË Ñ II, придает мутантному энзиму в

35

5

10 няются во всех гербицидчувствительных энзимах АЛСдикого типа,до сих пор имеющих отличительные признаки эукариотов, некоторые замещения.в этих положениях встречаются в бактериальных энзимам АЛС дикого типа. Изоэнзим! Е.coll имеет серин, а не аланин в положении 122, и глутамин, а не триптофан в положении 591; изоэнзим И

Е.coll имеет серин, а не пролин в положении

197. а изоэнзим III Е,соИ имеет аланин, à не пролин в положении 197 и изолейцин, а не фенилаланин в положении 595. Каждый из этих изоэнзимов АЛС Е.colt более устойчив (от 50 раз до более чем 10 000 раз) к ингибированию. (определенными) сульфонилмоче100 раз большую чувствительность к ингибированию, т.е, такую чувствительность, которая присуща энзимам высших растений дикого типа. Таким образом, пролин в положении 197 вовлечен в гербицидное связывание в АЛС II Е.coll так же. как и в АЛС дрожжей. и высших растений, Кроме того, были выполнены сайтнаправленные мутации, которые приводят к замещениям триптофана лейцином и глутамина триптофаном в положениц 591 в

АЛС И и АЛС I соответственно. Мутация в

АЛС II придает энзиму больше устойчивости к гербицидам, чем АЛ С II дикого типа, тогда как мутация в АЛС придает ему больше чувствительности к гербициду, чем АЛС I дикого типа.

Сайтнаправленные мутации в положениях 197 и 591 в АЛС I и АЛС ll Е.соИ оказыва ют. воздействие на и н ги би р о ва н ие мутантных энзимов гербицидом так, как можно зто предсказать из действия дрожжевых и растительных белков АЛС гербицидустойчивых мутантов, Эти экспериментальные данные подверждают универсальность аминокислотных остатков. вовлеченных в гербицидное связывание с энзимами

АЛС из разнообразных источников.

Аминокислотные замещения, необходимые для придания гербицидной устойчиво-, сти, получают путем сайтспецифического мутагена фрагмента нуклеиновых кислот, кодирующего гербицидчувствительную

АЛС, следующим образом: (1) выделяют геномную ДНК или мРНК из растения; (2) конструируют геномную библиотеку из выделенной ДНК или кДНК-библиотеку из выделенной РНК;

1820914 .

20 (3) идентифицируют те фаги или плазмиды, которые содержат фрагмент ДНК, коди. рующий АЛС; (4) секвенируют фрагмент, кодирующий

АЛС; (5) субклонируют фрагмент ДНК, несущий ген АЛС, в клонирующий.носитель, который способен произвести однонитевую

ДНК; . (6) синтезируют олигонуклеотид длиной .около 15 — 20 нуклеотидов, который комплементарен определенной нуклеотидной по:следовательности АЛС, кодирующей одну из аминокислотных субпоследовательностей, за исключением нуклеотидного (-ных) изменения (изменений), необходимого для мутации; . (7) присоединяют олигонуклеотид к од-. нонитевой ДНК, содержащей мутируемый участок, и используя его для первичного синтеза in vitro нити комплементарной

ДН К, образующей гетеродуплекс; (8) трансформируют бактериальные клетки гетеродуплексной ДНК; (9) осуществляют скрининг трансформированных бактериальных клеток для тех клеток, которые содержат мутированный . фрагмент ДНК, путем а) иммобилизации.

ДНК на нитроцеллюлозном фильтое, б) гибридизации с 5 -концом, меченам Р, мута2 генным олигонуклеотидом и ри температуре . окружающей среды и в) промывки ее в условиях повышенной температуры с тем, чтобы избирательно отделить зонд от гена дикого типа, но не мутантного гена; . (10) выделяют фрагмент двунитевой

ДНК, содержащей мутацию из клеток, йесу.щих мутантный ген; и (11) подтверждают присутствие мутации анализом последовательностей ДНК, Получение гербицидустойчивых растений.

Фрагменты нуклеиновых кислот настоящего изобретения могут быть использованы для введения гербицидной устойчивости в растения. С целью вставления фрагмента нуклеиновых кислот, который включает ген, кодирующий гербицидустойчивую АЛС, в различные растения, используют .большое разнообразие методик в зависимости от желаемого вида или культурного сорта. Вообще экспланты или протопласты могут быть . взяты или получены иэ растений, выращенных либо in vitro, либо в почве. Экспланты илй протопласты могут быть получены из семядолей, стеблей, черешков, листьев, корней, незрелых зародышей, гипокотилий,. соцветйй.и т.д. В теории любая ткань, которой можно манипулировать in vitro с обра. зованием нового каллюса или

55 на млрд, в трансформированных каллюсах табака. . В работе, которая продолжается, фрагменты ДНК, содержащие сайтнаправленные мутации в гене SURA, который, как ожидают, кодирует гербицидустойчивую организованного роста ткани, может быть использована для генетической трансформации.

Для достижения трансформации экс5 плантаты или протопласты могут совместно культивироваться с Agrobacterlum, которую индуцируют для переноса фрагментов нуклеиновых кислот, расположенных между границами Т-ДНК плазмиды Ti, в раститель10 ные клетки. Другой. способ, менее встречающийся на практике, заключается в прямом поглощении ДНК растительными протопластами.

8 примерах целый ряд эксплантов иэ, 15 различных растений культивируют совмест. но с Agrobacterlum с тем, чтобы достигнуть трансформации в гербицидную устойчивость. Эти экспланты культивируют так, чтобы позволить расти.каллюсу. Затем каллюс

20 сразу исследуют на устойчивость к сульфонилмочевинам или растения регенерируют, а затем исследуют на устойчивость к сульфо.нилмочевинам, Исследование заключается

s ферментативном анализе экстрактов рас25 тительных клеток на наличие активности

АЛС, устойчивой к гербициду, и/или в выращивании растительных клеток в культуре йли целых растений в присутствии обычно ингибирующих концентраций гербицида.

30 Фрагменты ДНК состоят из участка, кодирующего синтез гербицидустойчивой

АЛС, и участка, предназначенного для экс, прессии кодирующей последовательностив . растениях. Ф рагмент ДНК (8,3 кб), кодирую35 щий белок гербицидустойчивой АЛС, состоит иэ приблизительно 800.п.н. в направлении 5

-конца (no направлению вверх) кодирующего участка, достаточного для экспрессии белка

-в растениях. Этот фрагмент ДНК.может при40 давать устойчивость к хлорсульфурону при концентрации последнего до 2000 частей на млрд. в трансформированных калюсах табака. Растения, регенерированные из трансформированных клеток, также проявляют

45 устойчивость на уровне целого растения, Фрагмент ДНКдлиной 6,3 кб, который кодирует белок гербицидустойчивой АЛС, содержит 2,5 кб в.направлении 5 "конца (no направлению вверх) и i,8 кб в направлении

50 3 -конца (по направлению вниз) кодируюi щего участка, достаточного для экспрессии белка в растениях. Этот фрагмент ДНК может придавать устойчивость к хлорсульфурону при концентрации последнего 2 частей

1820914

АЛС, были выполнены заявителем. Эти мутации приводят к получению следущих аминокислотных замещений: Ala 122 íà Ser, который как известно, операбелен B изознзиме И АЛС Е.соИ и дрожжевой АЛС, А!а 122 на Val, который, как иэвестйо, операбелен в изоэнзиме И АЛС Е,coll и дрожжевой АЛС, Ala 122 ía Pro, который, как известно, операбелен в дрожжевой АЛС, Pro 197 íà Ser, который, как известно, операбелен в дрожжевой АЛС и в изаэнэиме И АЛС Е.соП, Pro

197 на Ala, который, как известно, операбелен в АЛС, кодируемой геном SURB-Hra табака, Lys 256 íà Glu, который, как известно, операбелен в дрожжевой АЛС, Asp 384 на

Vat, который, как известно, операбелен в дрожжевой АЛС, и Trp 591 íà Leu, который, как известно, аперабелен в дрожжевой АЛС и АЛС, кодируемой геном SURB-HRa таба ка. Путем обьединения вышеприведенных мутаций также были выполнены двойные мутации, приводящие к получению двух аминокислотных замещенйй, таких как Ala

122 ía Ser u Pro 197 íà Ser, или А!а 122 на

Ser u Pro 197 íà Ala, или Pro 197 на А(а и Trp

591 íà Leu, или Pro 197 ía Ser u Trp 591 на

Leu. Эти мутации были выполнены во фрагменте ДНК, содержащем примерно только

180 п.н. в направлении 5 -конца (па направI лению вверх) и только около 600 п.н. s направлении 3 -конца (по направлению вниз) последовательности, кодирующей АЛС. Эти фрагменты ДНК были вставлены в табак посредством трансформации. Гербицидная устойчивость не была экспрессирована в этих трансформантах. Полагают, что использование регуляторным последовательностей, найденных достаточными для экспресии гербицидной устойчивости с участкам, кодирующим мутант ЗОВА — СЗ. а именно 2,5 кб в направлении 5 -конца (па направлению

I вверх) и 1,8 кб в направлении 3 -конца (по

1 направлению вниз) кодирующего участка, привело бы к экспрессии гербицидной устойчивости со всеми сайтнаправленными мутациями в участке, кодирующем SURA.

Сайтнаправленные мутации, которые, как ожидают, кодируют гербицидустайчивую АЛС, были выполнены также в гене АДС свеклы сахарной. Эти мутации приводят к получению следующих аминокислотных замещений: Ala 122 íà Pro, который, как известно, операбелен в дрожжевой АЛС, Pro 197 на Ala, который, как известно, операбелен в

АЛС, кодируемой геном SURB — Нга табака, Trp 591. íà Leu. êîòoðûé, как известно, операбелен в дрожжевой АЛС и в АЛС, кодируемой геном SURB-Hra табака и двойного мутанта, Pro 197 на Ala u Trp 59l на Leu. парирования, полиэтиленгликоля или дру25 гих агентов или способов, известных для

40

5

20 который, как известно, оперэбелен в АЛС, кадируемой геном SURB — Hra табака.

Предпочтительный способ встраивания фрагмента нуклеиновых кислот в растительные клетки заключается в использовании

Agrobacterium tumefaciens, содержащей фрагмент нуклеиновых кислот между границами Т-ДНК либо на бесплечевой плазмиде

Ti(т.е. плазмиде Ti, из которой удалены гены для иммуногенности апухолевых клеток). либо в бинарном векторе in trans в плаэмиду Ti c Vir-функциями. Agrobacterium можно . использовать для трансформации растений инокулированием тканевых эксплантатов, таких как стебли или листовые пластины. или совместным культивированием с растительными протопластами. Другой предпочтительный способ встраивания фрагмента нуклеиновых кислот настоящего изобретения заключается в непосредственном введении фрагмента или вектора. содержащего фрагмент, в растительные пратапласты или клетки с помощью или без помощи электроизменения пропускающей способности мембраны к макромолекулам.

Фрагменты нуклеиновых кислот настоящега изобретения можно использовать для трансформации протопластов или клеточных культур из широкого спектаа видов высших растений для образования культур растительных тканей настоящего изобретения. Эти виды включаютдвухдольные растения табак, петунья, хлопчатник, свекла сахарная. картофель, томат, салат-латук, дыня, подсолнечник, соя культурная, canola (рапс) и другие виды Brassica и тополя; и однадольные растения (кукуруза, пшеница, рис, Loiium multif lorum u Asparagus

officinaiis). Ожидается, что все линии растительных клеток, имеющие протопластное происхождение, могут стабильна трансформироваться фрагментами настоящего изобретения. фрагменты нуклеиновых кислот настоящега изобретения можно также вставлять в растительные клетки с последующим образаванием трансформированных растений настоящего изобретения. Трансформация целых растений осуществляется в, растениях, клетки KOTopr!x могут быть трансфармированы инородными генами на стадии, на которой могут быть регенерированы целые растения. В соответствии с настоящим изобретением трансфармируемые растения являются однодольными. и двудольными растениями. Предпочтительна, если трансформируемые растения выбирают из труппы, состоящей из табака, петуньи, . 23

1820914

24 хлопчатника. свеклы сахарной, картофеля, томата, салата-латука, подсолнечника, сои культурной, canola и других видов Brasslca, тополей, люцерны, клевера, сахарного тростника, ячменя, овса и проса. Наиболее предпочтительно, если трансформируемые растения выбирают из группы, состоящей иэ табака, петуньи, картофеля, томата. подсолнечника, свеклы сахарной, люцерны, салата-латука или видов Brassica.

Можно дополнительно повысить уро- вень экспрессии фрагментов нуклеиновых кислот путем замещения их первоначальных регуляторных нуклеотидных последовательностей и 5 - и 3 -концов АЛС-кодируI I ющей последовательности синтетическими или природными последовательностями, обеспечивающими экспрессию высокого уровня и/или тканьспецифичную экспрессию, Можно также заместить нуклеотидные последовательности фрагментов нуклеиновых кислот настоящего изобретения другими синтетическими или природными последовательностями, которые кодируют

: транзитные пептиды, способствующие эффективному хлоропластному поглощению фрагментов нуклеиновых кислот настоящегб изобретения.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

П. р и м е, р 1. Выделяют ДНК табака (Nicotlana tabacum сорта ХамЫ) иэ мутанта

HVa. Отщепляют листы 2х13 r размером . 2,54.-5,08 см (1-2 дюйма) от растений и сразу же разминают в 2 объемах па 20 мл буфе, ра.А (10 мМ трицин-КОН, рН 7,6-1;14 М сахарозы — 5 мМ MgCIQ — 5 мМ 2-меркаптоэтанол) в холодной комнате с помощью ступок и пестиков. Прибавляют добавочное количество 40-50 мл буфера А, полученные суспензии фильтруют через 16 слоев марли.

Фильтрат центрифугируют в роторе типа

Sorvall GSA при скорости вращения 2500 об/мин и температуре 4 С в течение 5 мин.

Осадок после центрифугирования ресуспендируют в 10 мл буфера А, примешивают еще 100 мл буфера А и клетки центрифугируют при указанных условиях. Полученные гранулы затем ресуспендируют в 100 мл буфера А в смеси с.0,47-ным раствором Тритона Х-100, выдерживают на льду в течение

10 мин и центрифугируют указанным обра. зом, Гранулы после центрифугирования дважды промывают в последнем буферном растворе. Полученные конечные гранулы ресуспендируют в 5 мл ресуспензионного буфера (50 MM трис-H Cl, рН 8, 20 мМ ЭДТК), прибавляют 1 мл ресуспензионного буфера, содержащего 107ь саркозила, а затем обьем доводят до 10 мл посредством ресуспенэионного буфера. Прибавляют протеиназу К до концентрации 100 мкгlмл до получения лизатов, лизаты подвергают перевариванию при 37 С в течение ночи. Лизаты затем доводят до плотности 1,55 г/мл CsCI и до конечной концентрации 300 мкгlмл бромида этидиуса. Растворы центрифугируют в роторе типа ВесЬпап Tl 70.1 при скорости вращения 40 000 об/мин при 15 С в течение

24 ч, полосу флуоресцентной ДНК снимают после визуализации длинноволновым УФизлучением. Для снятия ДНК в боковых стенах трубок полиалломера прокалывают отверстия иглой калибра 18, что дает воз10

15 можность вязкой ДНК капать каплями в трубку для сбора материала. Для предотвращения среза ДНК на всех стадиях после. лизиса клеток соблюдают большую осторожность. ДНК вновь ресуспендируют в мягких условиях в растворе CsCI с плотностью 1,55 гlмл и бромида этидиума с концентрацией 300 мкг/мл, а затем центрифугируют в ротора типа $агчаП

TFT65.13 при скорости вращения 40. 000

20 об/мин и при 15 С в течение 48 ч. Затем

ДИК вновь собирают через боковой прокол трубки-сборника. Затем ее экстрагируют 10 раз в мягких условиях посредством изоамипоеого спирта, насыщенного ТЕ-буфером (10 мМ трис-HCl, pH 8, 1 мМ ЭДТК). а затем экстенсивно диалиэуют против ТЕ-буфера.

Конструируют библиотеку ДНК табака.

ДНК табака гидролизуют рестрикционным энэимом $ао 3А с образованием большин30

35 ства фрагментов, как определено электрофорезом в агарозном геле, протяженностью в интервалое 20 кб, (т.п.о). Полученные фрагменты нагружают на градиенты 10-407ь сахарозы (в 1 М NaCl, 20 мМ трис, рН 8, 1 мМ рифугированием в роторе типа Bekman SW

28 при скорости вращения 26000 об/мин и при 17 C в течение 16 ч, Фракции, образованные от градиентов. концентрации сахаро45 зы, -собирают и анализируют электрафореэом в агарозном.геле, причем фракции, содержащие фрагментй размером 20 кб (20 т,п.о.), диализируют против TE-буфера и осаждают этанолом. Затем указанные фракции лигируют с плечами ЕМВИ фага лямбда, расщепленными BamH l при молярном соотношении 2;1, и упаковывают в головки фага лямбда, следуя инструкциям изготовителя по плечам генома лямбда и реакциям

55 упаковки

Библиотеку ДНК табака, содержащую

400 000 фагов, высевают в чашки со штаммом-хозяином Е,соИ LE 392 при плотности

50 000 фагов на 150 мм чашку Петри с распределением на 10 чашках. Осуществляют

40 ЭДТК)и фракционируют по размерам цент25

1820914

10 вставку, отличающуюся от укаэанной, кото- 20 рая, как предполагают. содержит ген SURBHra, кодирующий АЛС, устойчивую к

35

50 перенос из бляшек фага на сдвоенные нитроцеллюлозные фильтры и затем гибоидизируют с зондами, меченными Р и з несущими либо 5 —,либо 3 -фрагменты гена

АЛС, полученные в системе мечения рибозондов. Бляшки, дающие положительные сигналы на пленках.иэ .обоих комплектов фильтров, собирают и очистку повторяют многократно до тех пор, пока не получат хорошо изолированные гибридизирующиеся бляшки.

Анализируют минипродукты ДНК из очищенного фага обработкой рестрикционным энзимом. Различа эт два класса вста8оК фрагментов клонированной ДНК табака. Фаги 1, 2, 17 и 18 содержат вставки, родственные с ранее выделенным геном

АЛС из места SURA. кодирующего чувствительную к гербициду АЛС. Фаг 3 содержит гербициду. Фрагменты EcoR 1, которые окружают участки гибридизации фага 3, субклонируют.в фаговые векторы M.13 и проводят анализ последовательности ДНК, используя олигонуклеотиды для расширения секвенированных участков в перекрывающихся сегментах. Обнаружена единственная открытая рамка считывания из 1992 нуклеотидов, которая идентифицирована как ген АЛС путем сравнения выведенн ной а минокислотной последовательности с консервативными участками аминокислотных последовательностей белков

АВС.других видов, АЛС-гены, изолированные из гербицидустойчивого мутантного табака Нга, вводят в чувствительные клетки табака через систему "бинарный вектор", используя Agrobacterlum 1ите1ас!епз. гены АЛС первоначально вводят в бинарный вектор в АлиаеГас!епз через коньюгацию плаэмиды и затем используют сконструированную Алигпе1аciens для трансформации растительных клеток чужеродными генами путем совместного культивирования.

А). Введение изолированных генов АЛС табака в АлигпеГас!епз

1). Очищенный фрагмент нуклеиновых кислот Spe I размером 8 3 кб настоящего изобретения, изолированный из мутанта

HVa табака и содержащий кодирующую последовательность для гербицидустойчивой формы гена АЛС, вставляют в сайт Xba I плазмидного вектора рМис19. Хотя рестрикционные энзимы Spe I и ХЬа распознают отличающиеся ДН К-последовательности, продукты этого гидролиза носят аналогичную, выступающую на 5 -конце после-!. довательность. Ориентацию вставляемого фрагмента в одной из результирующих плазмид pAGS148 определяют за счет анализов с помощью рестрикционного энзима.

Бинарный вектор pAGS135 используют для переноса плазмиды pAGS148 в

А.tumefaclens. Плазмида PAGS135 происходит из плаэмиды pAGS112. Она получена в результате переваривания ДНК плаэмиды

pAGS112 рестрикционной эндонуклеаэой

Xho I, обработки фрагментом Кленова полимераэы I ДНК Е.coll и самолигации ДН К, эа счет чего осуществляется удаление сайта

Xho I вне правого предела Т вЂ” ДНК. Плазмида

5 pAGS112 происходит от вектора pl AER c широким диапазоном хозяев. Она получена путем встраивания ее в pLAER фрагмент

EcoR I, в котором пределы Т-ДНК ограничиваются геном для экспрессии устойчивости к канамицину в растениях и уникальным сайтом Bamk для клонирования. Плазмиды pAGS148 и pAGS135, очищаемые CsCI, переваривают Bamk I и образующиеся

BamK I — расщепленные плазмиды связыва5 ют. Гибридную ДНК вводят в фаг лямбда in

vitro и используют для заражения штамма

НВ101 Escherichia co!i. Трансформанты выбирают на ампициллине.

2). Коньюгация плаэмиды pAGS152 из

Е,со!! в А tumefaciens.

Плазм иду pAGS152 вставляют в

tumefaciens путем конъюгации. Йтамм

НВ101 Е.coil, содержащий плазмиду

pAGS152; и штамм НВ101 Е,coli, содержащий мобилизирующий вектор pRK2013 (АТСС 37159), смешивают с штаммом

LBA4404 А оте1ас!епз. содержащим плазмиду pAL4404, и подвергают скрещиванию на твердой LB-среде при 28 С в течение 16 ч. Трансконьюгаты селектируют на пластинах, содержащих рифампицин при концентрации 100 мг/л и тетрациклин при 1 мл/л.

Алоп е1ас!епз LBA4404: рА65 I52 подвергают рестрикции на минимальной А-среде, содержащей тетрациклин при 1 мг/л.

В основном аналогичный метод используют для .получения как штамма LDA4404

А tumefaciens, содержащего плазмиду

pA6S112, причем бинаирный вектор не содержит какой-либо вставки фрагмента нуклеиновых кислот, так и штамма LBA4404

А tumefaciens, содержащего плазмиду

pAGS145, причем бинарный вектор содержит фрагмент нуклеиновых кислот от фагового клона 1. Последний фрагмент также изолируют иэ мутанта Нга растений табака и он несет ген для экспрессии гербицидчувствительной формы АЛС, этот ген не является аллелем дикого типа гена для экспрессии гербицидчувствительной АЛС. а представ27

1820914

28 ляет собой ген SURA иэ второго генетического покуса, В). Введение изолированных генов АЛС в чувствительные клетки табака посредством совместного культивирования клеток растений с штаммами LBA4404 Алиае1ас!епз (pAGS145) и LBA4404 (pAGS152).

Все манипуляции на стерильных средах и растительных материзлах проводят в колпаках с лзминарным потоком в приемлемых емкостях. Выращивание растений и культивирование растительных клеток проводят при 27 С. Все манипуляции на протопластзх осуществляют при комнатной температуре, если не указано по-другому.

1 день (после полудня), Приготавливают среду для изоляции протопластов путем прибавления следующих компонентов к КЗ/S (l) — среде: 0,1 (мас./об.) МЕ$-буфера (Sigma Chemical Со.), 1 ((мас./об.) целлюлазы (Onozuka или целлюлизин) и 0,1 мацеразы (Onozuka). После осторожного перемешивания примерно в течение ЗО мин значение рН доводят до 5 6 с помощью КОН и полученную среду стерилиэуют на фильтрах.

Стерильные растения табака (Nlcotlana

tabacum .сорта Висконсин-38) культивируют из 1 см апикальных или вспомогательных эксйлантатов на ОМ$-среде в коробках типа

Магента при цикле из 16-часового светлого периода (6000-8000 люкс) с последующим

8-часовым темным периодом. Когда растения достигнут 5-7 недельного возраста, отщепляют полностью распустившиеся листья (3-6.листьев снизу от верхушки) и каждые двз листа помещают верхней поверхностью вниз на 20 мл среды для изоляции протопласта, содержащейся в чашке Петри размером 100х250мм. Затемлистья погружают в среду и мелко измельчают острым хирургическим скальпелем. Среднюю жилку листа фиксируют и надрезы делают наружу от нее в направлении к краю листа с промежутками примерно 2 мм. После этого чашки

Петри герметизируют парапленкой и маце, рированную ткань инкубируют в течение ночи (14-17 ч) в темноте при 27 — 29"С при осторожном встряхивании в роторе (20-25 об/мин).

2 день (утро).

Воронку для фильтрования емкостью 75 мл; заполненную 4 слоями марли, закрепляют в копьцевидном держателе. Стеклянную пробирку (длиной примерно 15 см и внешним диаметром < 5 мм) прикрепляют к воронке с системой трубок из латекса. . Используемую воронку. марлю, систему трубок и пробирок из стекла и латексз эаво50

А.tumefaclens измеряют при 550 нм, доводят до 0,15 с помощью среды "Минимал А" и бактерии продолжают выращивать, как указано выше, 3 день (после полудня)

Когда оптическая плотность (при 550 нм) культур Алиее1ас!епз составляет 0.6 (логарифмическая фаза- культур ), примерно через 6 ч .после разбавления укаэанные бактерии вносят в клетки при титре прймерно

50 бактерий/растительную клетку (оптическая плотность порядка 1 при 550 нм - 1,4 х х 10 бактерий). Полученную смесь бактерий

9 и растительных клеток совместно культивируют в течение 66 ч при 24 С при слабом рачивают в алюминиевую фольгу и стерилиэуют в автоклаве в виде единого целого.

Систему стеклянных пробирок помещают в колбу Бабкока. а марлю пропитывают

5 средой КЗ/$(1). Переваренную ткань листа с двух чашек Петри осторожно выливают в воронку. Марлю промывают и выжимают в указанную колбу. Заполненные колбы доверху заливают средой K3/$(1), покрывают

10 фольгой и центрифугируют примерно при

100 х g в течение 10 мин. Плавающие протопласты (1-2 мл) собирают серологической пипеткой (1 мп) и помещают в 20 мл среды

КЗ/$(1), содержащейся в другой колбе Баб15 кока. После ресуспендирования протопластов за счет осторожного перемешивания колбы Бабкока заполняют доверху и центрифугируют, как указано. ранее.,Плавающие протопласты (1 — 2 мл) собирают по описан20 ному методу и помещают в 30 мл среды

K3/G(l). Указанные протопласты подсчитывают в гемацитомере, а полученный объем регулируют для получения 1 х 10 протопластов на мл. 5 мл аликвот протопластов

25 высевают в чашки Петри (тканекультивируемые чашки Петри размером 100 х 20 we (Согйпо) эти чашки используют во всех последующих манипуляциях с протопластами) и выращивают в темнотс.

30 2 день (после полудня)

Единую колонию клеток Алмте1зс!епз, содержащую вектор трансформации требуемого растения, а именно рА6$112 (указанный плазмидный вектор), pAGS152 (содержащий .

35 фрагмент нуклеиновых кислот настоящего изобретения) или pAG$145 (содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую чувствительную форму АЛС); выращиваемую на пластине

"Минимал А", инокулируют в 5 мл среды

40 "Минимал А" в 18 мм тестируемой пробирки и выращивают в течение ночи в роликовом барабане при скорости вращения 40-60 об/мин при 27-28 С.

3 день (утро)

Оптическую плотность культур

1820914

30 освещении (примерно 500 люкс). Нетрансформированные протопласты-контроли инкубируют аналогичным образом, но без использования агробактерий. Для каждого совместного культивирования проводят последующее протоколирование (для клеток, трансформированных различными агробактериями, а также для нетрансформированных клеток).

6 день (утро)

Совместное культивирование прерывают путем прибавления 20 мл смеси в соотношении 1:1, состоящей из среды КЗ/G(2) и среды С, дополненной 500 мг/л цефотаксима (при отборе против агробактерий) к 5 мл смеси для совместного культивирования.

Совместно выращенные клетки осторожно и тщательно ресуспендируют в новой среде путем смешивания серологической пипеткой (5 или 10 мл). Плотность клеток составляет 2 х 10 протопластных эквивалентов/мл (протопластные эквивалентные = исходным протопластам при 100 выхода и выживаемости клеток), а осмолярность составляет

0,35 М. Три порции по 5 мл аликвот из каждой культуры распределяют в свежих чашках Петри.

С этого момента до тех пор, пока культивируемые клетки не внедряется в твердую среду. они растут при слабом освещении (500 — 1500 люкс) без движения и их переносят в различные среды в стерильных условиях. В -указанные времена клетки из одной чашки переносят в неселективные среды, в то время как клетки с других двух чашек из каждой культуры переносят в селективные среды, содержащие либо 50 мг/л канамицина или 2 нг/мл хлорсульфурона для отбора трансформированных растительных клеток.

Для этих переносов клеток содержимое из каждЬй чашки собирают с помощью серологической пипетки (5 мл), помещают в раздельные конические трубки центрифуги из полистирола (емкостью 15 мл) и центрифугируют примерно при 50 x g 8 течение 5 — 10 мин. Надосадочную жидкость удаляют пипет.кой, не разрушая рыхлых гранул, Полученные гранулы из совместно выращиваемых клеток с каждой из чашек затем осторожно ресуспендируют в соответствующей свежей среде.

10 день

Клетки переносят в 5 мл среды С, которая в случае неселектируемых растительных клеток дополнена 500 мг/л цефотаксима. а в случае селектируемых клеток дополнена

500 мг/л цефотаксима и либо 50 мг/л канамицина, либо 2 нг/мл хлорсульфурона. Каждую из укаэанных культур возвращают в чашки Петри, из которых они были взяты.

Таким образом, для осуществления обмена

55 смеси в соотношении 1:3, состоящей из среды

С и среды MSP, дополненной 50 мг/л канамицина или 2 нг/мл хлорсульфурона. 5 мл аликвот

+3 ресуспендированных культур(5 х 10 протопластных .эквивалентов/мл) распределяют по четырем свежим чашкам Петри на селектируемую культуру и выращивают, как указано выше.

23 — 24 дни

Каждую культуру селектируемых клеток объемом 5 мл разбавляют 7;5 мл среды MSP дополненной 50 мг/л канамицина или 2 нгlмл хлорсульфурона B целях получения в среде с минимальной потерей клеток, не все клетки должны быть гранулированы.

13 день

Неселектируемые клетки переносят в 20

5 мл смеси с соотношением 3:1. состоящей из среды С и среды MSP с добавкой 500 мг/л цефотаксима, и 5 мл аликвоты распределяют в свежей чашке Петри (при плотности 5 х х 10з протопластных эквивалентов/мл}. Се10 лектируемые клетки ресуспендируют в 5 мл смеси (3:1), состоящей из среды С и среды

MSP, дополненной 500 мг/л цефотаксима и

50мг/л канамицина, либо 2 нг/мл хлорсульфурона и возвращают на первоначальные

15 чашки для последующего культивирования.

16 — 17 день

Клетки переносят в 5 мл =меси в соотношении 1:1, состоящей из среды С и среды

MSP, дополненной 500 мг/n цефотаксима (в

20 случае неселектируемых растительных клеток) или 500 мг/л цефотаксима и либо 50 мг/л канамицина, либо 2 нг/мл хлорсульфурона (в случае селектируемых клеток) и выращивают, как описано выше.

25 20 день

Неселектируемые клетки переносят в 25 . мл смеси в соотношении 2:1, состоящей из среди С и среды MSP, и затем полученную смесь прибавляют в 25 мл смеси в соотно30 шении 1:1, состоящей из 2 объемов среды

MSP и 1 g, (мас./об.) раствора агарозы типа

Vli (температура 50 С). Полученную культуру быстро перемешивают серологической пипеткой (25 мл) с широким отверстием и

35 распределяют в 5 мл аликвот на свежие чашки Петри. Суспендированные микрокаллюсы в растворе агара осторожно и равномерно распределяют по чашкам взбалтыванием вручную. Чашки покрывают и оставляют под

40 колпаком в течение часа для затверждения перед тем, как их обернут в парапленку и перенесут в вегетационную камеру. Плотность клеток составляет примерно 5 х 10 протопластных эквивалентов/мл и осмолярность составляет 0,15 M. Внедрившиеся клетки подсчитывают примерно 10 дней спустя счетчиком для подсчета колоний.

Селектируемые клетки переносят в 20 мл

1820914

Среда для культивирования й.1эЬасшп плотности клеток 2 х 10 протопластных з зквивалентов/мл. Эту культуру с установленной плотностью смешивают с 12,5 мл среды в соотношении 1;1, состоящей из 2 обьемов среды MSP и 1 (мас./об.) раствора агарозы типа ЧИ (температура 50 С), дополненной 50 мг/л канамицина или 2 нг/мл хлорсульфурона. 5 мл аликвот перемешанных культур быстро распределяют с помощью широкогорлой серологической пипетки (25 мл) на свежие чашки Петри. Конечная плотность посева составляет 1 х 10 з протопластных эквивалентов/мл, а осмолярность культуры составляет 0,1 M. Чашки отверждают, как описано выше. Внедрившиеся клетки подсчитывают примерно 10 дней спустя счетчиком для подсчета колоний.

25 день

От 10 до 12 индивидуальных трансформированных каллюсов/колоний собирают и переносят скальпелем N. 11 в чашку Петри, содержащую среду MSP с использованием или без использования соответствующего селективного агента для регенерации растений. Каллюсы выращивают при 27 С с фотопериодом в 16 световых часов (5000 — 8000 люкс) с последующими 8 ч темноты, Побеги появляются спустя 2-3 недели и продолжают свое развитие в течение нескольких месяцев. Побеги длйной 2-3 вм срезают острым хирургическим скальпелем и переносят для укоренения в среду OMS в ящики

Магента. После образования корневой системы (1-4 недели) растения переносят в почву для регенерации.

Результаты совместного культивирования.

Полученные результаты вследствие экспериметов по совместному культивированию показывают, что фрагмент нуклеиновых кисЪ

К /S (1) — сахароза, фитогормонный рез жим 1 (повышенный)

К /G (1) — глюкоза. фитогормонный режим 1 (повышенный)

К /6 (2) — глюкоза, фитогормонный режим 2 (пониженный) лот настоящего изобретения, кроме гена

SURA табака для экспрессии .гербицидчувствительной формы АЛС, придает устойчивость к гербициду, когда его вводят в гербицидчувствительные клетки табака (см. табл.4 и 5). Поскольку фрагмент нуклеиновых кислот настоящего "изобретения может придать устойчивость к гербициду при аналогичной частоте, когда его вводят в любую ориентацию относительно вектора, он содержит регуляторные последовательности обоих

5 - и 3 -концов относительно кодирующей

1 последовательности, которая необходима для экспрессии гербицидустойчиваго гена AflC.

Уровень устойчивости к гербициду, придаваемый фрагментом нуклеиновых кислот настоящего изобретения, определяют путем посева 100 колоний каждой из трансформированных клеток pAGS152 йлаЬэcurn, устойчивых к хлорсульфурону при 2 ч. на млрд. и не совместно культивированных клеток дикого типа Й tabacum при различных концентрациях хлорсульфурона. Подсчитывают количество активно растущих колоний при различйых концентрациях хлорсульфурона после 1 месяца (см.табл,6).

В то время кэк колонии дикого типа чувствительны к хлорсульфурону при концентрации

2ч. на млрд., колонии, получаемые из совместного культивирования с плазмидой

pAGS152 Алшпе1ас1епз, могут выдержать концентрации до 2000 ч. на млрд. Такой уровень устойчивости полученных трансформан-. .тов сравним с уровнем гербицидустойчивого мутанта Hra табака, из которого фрагмент нуклеиновых кислот настоящего изобретения изолирован, причем он примерно в 10 раз выше уровня гербицидустойчивого мутанта S4 табака (родитель Нга).

1-NAA 3,0 мг/л 2 — NAA 0,1 мг/л

BAP 1,0 мг/л RAP 0,1 мг/л рН доводят до 5,7. стерилизуют на фильтре и хранят при 5 С.

1820914

Загрузка

10Х

100Х

100Х. 1000Х

1000Х

1 мг/мл

1 мг/мл

Н доводят до

0,8 % (масс/о

50 мгlмл

1 мг/мл в 5 мМ К.ОН селективные агенты в стерильных условиях после охлаждения среды до 50" С.

Распределяют 25 мл на чашку !!етри (100 х

25 мм) и при необходимости прибавляют

1.

1ОО

10 мл ! мл

Среда MSP (для регенерации растений)

Компонент

Соли-макроэлементы

Fe ЗДТК

Витамины В5

Микроэлементы MS

Микроэлементы MS !!

Сахароза

Mes — буфер .

NAA

ВАР

Агар

Смесь автоклавируют

Сульфат канамицина или

Хлорсульфурон

Конечная ) Кол-во/

1820914

Кол-во/л (Конечная ) °

Загрузка

1000Х

100Х

3,0 7 (масс/об) 3.,0 мМ рН 5,7 — добавляют агар 0,8 $ (масс/об) 8,0 г помещают в автоклав, распределяют 50 мл на ящик. Магента азме ом 7,62 см Х 10,16 см

Минимальная Среда А

Компонент (Конечная ) Кол-во/л

Загрузка автоклав в 990 мл

МЯ$04 7Н20

Глюкоза

Для отвеждения среды: агар (15 гlл) фирмы Difco Васю автоклавируют в отдель(ЭДТК полностью растворяют перед прибавлением Ре$04; значение рН доводят до 3) Среда OMS (для поддержания растений)

Компонент

Микроэлементы М$И

Витамины В5

Сахароза

Mes — буфер

Агар

К2НР04

КН2РО4 (Ин)2$04 ит ат нет ия2Н20

1 мл

10 мл

30г 590 мг

10,5 г

4,5 г

1,0г

0,5 r

1 мл добавляют стерильно .

10 мл добавляют сте ильно ном объеме 500 мл. Перед посевом соли и агар смешивают.

1820914

Дополнительное оборудование, химические препараты и среды, МЕ$-буфер

Sigma N

Sigma N

М—

А—

Calbiochem

Calbiochem

Calbiochem

21

44

Sigma N

ЕЛ.du pont de Nemours

and Company, Wilmington

Delaware 19898

Чашки Петри для тканевой культуры размером 100 мм х 20 мм

Колба Бабкока

Центрифуга (приспосабливаемая с колбой Бабкока)

Ящики Магента размером

7,63 см х 10.16 см

Агар Т.С.

Corning

Kimble

Damon /lEC

Division HN — Sll

Magenta Corp., 4149 W.Montro

Chicago, И 68641

KC Biological CR--100 (2-(N-морфолино1 зтансульфокислота)

Агароза типа УП с низкой температурой застудневания (удерживается в расплавленном состоянии при 50 С)

Целлулизин

Маце раза

Цефотаксим, натриевая соль, разбавлен мlг д. Hz0 стерильная хранят при 5 С в темноте менее

10 суток в качестве основного раствора (50 мг!мл)

Сульфат канамицина, разбавлен м/г д. HzO, стерилизированная на фильтре, хранят при

-20 С, в темтоте, в качестве основного раствора (50 гlмл), Хлорсульфурон

Пример 2, Получают ДНК табака из мутанта С3 и конструируют, как описано в и римере 1, геномную библиотеку ДН К на бактериофаговом векторе ЕМВ13. Фаг, несущий гены АЛС, идентифицируют, как описано в примере 1, посредством гибридизации с 5I концом зонра фрагмента гена АЛС табака. меченным P.

Шесть независимых рекомбинантных фагов изолируют путем скрининга из

600 000 рекомбинантов из библиотеки мутанта СЗ. Анализ рестрикционной зндонуклеазы этих изолированных фагов показывает, что

ДНК-вставки из 3 фагов могут быть линеарны с геном SURA из библиотеки мутанта Hra (фаги 35, 36 и 38). Остальные 3 фага (фаги 31, 34 и 37) содержат вставки ДНК. соответствующие гену SURB. Как полагают, ген АЛС в фагах 35, 36 и 38 является геном SURA — СЗ, кодирующим гербицидустойчивую АЛС, а ген АЛС в фагэх 31. 34 и 37 является геном

SURB, кодирующим гербицидчугствительную АЛС.

Фрагменты ДНК из фагов 31, 35 и 38 субклонируют в плазмиду pUC119, а затем в бинарный вектор плазмиды pAGS135, в ос1820914

40 новном как описано в примере 1. Фрагмент рестрикционной эндонуклеазы Яре из фага

31 (размером примерно 8,3 кб), аналогичный фрагменту, содержащемуся в плазмиде рА6Я48, но несущий ген SURB, кодирую- 5 щий гербицидчувствительную АЛС, субклонируют в обеих возможных ориентациях в векторе. Фрагмент рестрикционной эндонуклеазы. Spe I— - Sal I (размером примерно

6,3 кб) из фага 35 и фрагмент Spe I — Sal l 10 (размером примерно 7,8 кб) из фага 38 субклонируют с получением рАЫЗ5 (АТСС М

67424) и PALSÇ8, соответственно. Указанные фрагменты включают 2,5 кб.участка, кодирующего АЛС, в направлении 5 -конца 15 (по направлению вниз), 2 кб АЛС-кодирующей последовательности, кодирующей гербицидустойчивый энзим и 1,8 и 3,3 кб, соответственно, АЛС-кодирующего участка в направлении 3 -конца (по направлению 20

1 вверх). Последние два субклонированных фрагмента содержат сайт рестрикционной эндонуклеазы BamH I. Частичные переваривания BamH или pALS35 и pALS38 используют для встэвления этих плэзмид в сайт 25

BamH I бинарного вектора плазмиды

pAGS1Ç5. Гены АЛС в бинарном векторе, обозначенные р312, р313, р351 и р381 (таблица 7) переносят в Аtumefaciens путем трехродительского скрещивания, как описа- 30 но в примере 1.

Введение генов АЛС в гербицидустойчивые клетки табака путем совместного культивирования растительных клеток с 35

А tumefaciens, несущим гены АЛС, в бинарный вектор проводят по методу, описанному в примере 1.. Полученные результаты экспериментов по совместному культивированию представлены в табл.7. Как ожида- 40 лось, ген АЛС, изолированный в фаге 31, т.е. ген SURB, кодирующий гербицидчувствительную АЛС, не дает никаких гербицидустойчивых растительных клеток. Ген АЛС, изолированный в фагах 35 и 38, т.е. ген 45

SURA-С3, кодирующий гербицидустойчивую АЛС, действительно дает растительные клетки, устойчивые к гербициду. Растительные клетки, устойчивые к гербициду, образуются при более низкой частоте, чем 50 растительные клетки, устойчивые к кэнамицину, а также при более низкой частоте, чем .наблюдается в случае, когда используют ген

SURB — Нга: Это может быть в связи с меньшей устойчивостью к гербициду АЛС-энзи- 55 мэ. кодирующегося геном SURA-СЗ, по сравнению с АЛС-энзимом, кодирующимся геном SURB-Hra, либо в связи с более низ- . кой экспрессией гена SURA — СЗ по срэвнению с геном SURB Hra, либо и с тем. и с другим.

Пример 3, Осуществляют мутации в гене SURA дикого типа табака in vitro, чтобы он кодировал гербицидустойчивую АЛС.

Фрагменты. рестрикционной эндонуклеазы. содержащие часть гена SURA, субклонируют в фаговые векторы М13 или плазмидные векторы, содержащие начало М13 репликации для. получения однонитиевой ДНК. Специфический фрагмент ДНК, который субклонирован, зависит от участка, подвергаемого мутагенезу ln vitro, и наличия сайтов рестрикционной эндонуклеазы.

Синтезируют олигонуклеотиды длиной

16-17 оснований, которые гибридизуются с однонитиевой ДНК из АЛС-гена SURA с одноосновными неправильными подборами.

Эти неправильные подборы предназначены для превращения аминокислотных кодонов, обнаруженных в гене АЛС дикого типа, в кодоны. обнаруженные в генах АЛС, которые кодируют АЛС-энзимы, устойчивые к гербицидам на основе сульфонилмочевины.

Указанные олигонуклетоды содержат фрагменты:5 GTTCAATTGGAGGATCÇ;для замены

trp 591 на leu, 5 GTCAAGTGGCACGTAGG 3, для замены pro 197 íà ala. u

5 6ТСАА6Т6ТСАС6ТА66 3!, для замены pro 197 íà ser, 5 ATGTACCTGА66АТАТТ 3, для замены !уз 256 на glu, 5 GAGGTTTGTTGATAGAG 3, для замены asp 384 на ча!, 5 AGGTTTGAGGATAGAGT 3, для замены азр 384 íà glu, 5 ТАСТ6АТ6АТТТТСА66 3, для замены а! а 205 на азр и

5 СА66Т66СССТТССАТ6 3, для замены ala 122 на рго.

Указанные олигонуклеотиды гибридизуют с однонитиевой ДНК и используют в качестве праймеров для синтеза комплементарной нити в реакции, катэлизируемой фрагментом Кленова ДНК-полимеразы 1. Полученную ДНК трансформируют в компетентные клетки Е.col! mutl. Отдельные бляшки или колонии очищают в зависимости от того, использованы ли фаговые векторы М13 (M13

mp 18/19) или плазмидные векторы М13 (рТ218В/19R) начала репликации. Минипродукты однонитиевой ДНК получают и используют в реакциях секвенирования ДНК для идентифицировэния клонов, несущих мутированные основания.

1820914

Эти сконструированные in vitro сайтспецифические мутации можно вставлять индивидуально или в комбинации в ген SURA дикого типа, который содержит 5 - и 3 -кон I I цевые регуляторные последовательности, необходимые для обеспечения экспрессии гена в растительных клетках (см. пример 2), Такое включение достигают путем замены фрагментов рестрикционной эндонуклеазы, несущих мутации плазмидой, содержащей ген SURA, из которого удален аналогичный фрагмент. Выбор рестрикционного фparмента для замены зависит от положения мутации в гене и от наличия сайтов рестрикционной эндонуклеазы. Введение мутированных генов SURA в растительные клетки далее осуществляют по мето.ду, описанному в примерах 1 и 2. Любой из фрагментов ДНК, содержащих мутации, которые приводят к получению гербицидустойчивой АЛС, как раскрыто в описании настоящего изобретения, можно получить в.основном по этому методу, Кроме того, нет необходимости осуществлять мутации только в гене SURA. Аналогичные мутации можно осуществлять в гене SURB или в любом другом растительном гене, кодирующем АЛС, для которого доступна информация о ДНК-последовательности.

Пример 4. ДНК получают иэ Beta

vulgaris сорта Зеппйа (сахарная свекла), а

:геномную библиотеку ДН К в векторе EM 8 L3 бактериофага лямбда конструируют, как описано в примере 1. Рекомбинантные фаги (300 000) подвергают скринингу путем гибридизации с зондом, меченным . P, фрагмента гена АЛС табака на 5 -конце, как

i. описано в примере 1. Фильтры промывают при 42 С (0,1XSSC) и выделяют 20 индивидуальных клонов, На второй стадии очистки рекомбинантный фаг гибридиэуютс обоими

3 - и 5 -концами зонда гена АЛС табака.

I i

Кроме того, фильтры, которые гидридизированы с зондом 5 -конца. промывают при

55 С. Только. один клон ф21 гибридизуется с обоими 5 - и 3 -концами зонда,.причем

1 i концы остаютря тибридизованнь ми после промывки при 55 6. Препараты минилизатов ДНК получают из 20 клонов и переваривают с помощью EcoR 1 и Ncol. Различные иэоляты содержат разные фрагменты, полученные в результате обработки рестриктазами, причем. опять только ф21 гибридизирован с обоими зондами и остается гибридизированным после промывки при 55 С. Один фаг, а именно ф41, также содержит полосу гибридизации; которая остается после промывки при 55ОС, тем не менее он не гибридизируется с зондом на 3 -конце. Участок, I кодирующий АЛС, связывают с фрагментом

BamH l — Hind lll размером 3 кб путем гибридизации с зондами из гена N.tàÜàñum на

5 - и 3 -концах, Обе нити ДНК этого фраг1 мента секвенируют, Фрагмент ВагпН l—

Hind ill субклонируют в векторы pUC119 или

Bluerscript; затем генерируют делеции экзонуклеазы Ш или Bal 31, Это осуществляют l0 методом дидезокси-секвенирования, Сравнительный анализ выведенной аминокислатной последовательности, кодируемой геном сахарной свеклы, с этой же последовательностью гена (генов) табака указывает на отсутствие гомологии в первых 88 аминокислотах предполагаемого белка, Указанный участок может представлять собой пептид перехода в хлоропласт. В связи с этим гомология составляет примерно 90-",ь в

20 случае вставки 4 аминокислот вокруг остатка 290 АЛС табака. Проверка аминокислотных остатков, которые определяют сайты для гербицидной устойчивости, установляемой в табаке и дрожжах, указывают на то, что указанные остатки консервируются

25 также и в АЛС сахарной свеклы. Полученные данные позволяет осуществить прямой подход к конструированию гена, кодирующего энзим АЛС сахарной свеклы, 30

35 устойчивый к гербицидам, посредством сайтспецифического мутагенеза, как описано а примере 3.

В этом гене сахарной свеклй подвергают мутагенезу три сайта. Кодон GCA для ala в положении 122 заменяют ССА для pro, кодон ССА для pro в положении 197 заменяют CGA для ala и кодон TGG для trp в положении 591 заменяют TTG для leu. Двойные мутации, изменяющие pro íà ala в положении 197 и trp íà leu B положении 591, которые имеют сходное действие с геном

SURB-Нга табака; также проводят путем комбинирования двух отдел ьн ых мутаций.

Для трансформации растений посред- . ством указанных мутаций, сконструированных in vitro, в гене АЛС сахарной свеклы, в плазмидный вектор рОС1 l9 клонируют

50 фрагменты ДНК, содержащие мутации .и проходящие от сайта BamH l размером примерно 910 п.н. e 5 -концевом направлении ! (по направлениЮ кверху) кодирующего участка до сайта.Pst l размером 1000 п.н. в 3

55 -концевом направлении (по направлению книзу). кодирующего участка. Укаэанные фрагменты вставляют в бинарный вектор

pAGS140 для трансформации в клетки растения. как описано в примере 1. Указанный бинарный вектор pAGS140 аналогичен век-

43 тору pAGS135. га исключением того, что между сайтом BarnH l и правой границей

Т-ДИК Ti-плазмиды Agrobacterium

tumefaciens вставляют ген, который придает устойчивость растениям к антибиотику гигромицину, Введение генов АЛС в табак и сахарную свеклу, чувствительные к гербициду, путем совместного культивирования растительных клеток с помощью А tumefaс епз, несущего гены АЛС в бинарный вектор, проводят, как описано в примерах 1 и 2, Полученные результаты совместного культивирования на табаке представлены в табл.8. Гербицидустойчивые трансфарманты получают с помощью 3 или 4 мутантных генов АЛС сахарной свеклы. Частота выхода гербицидустойчивых трансформантов ниже, чем для трансформантов, устойчивых к канамицину, и ниже, чем частота выхода герби цидустойчивых трансформантов при использовании гена SURB-Нга табака, Полагают, что зто вызвано слабой экспрессией мутантных генов АЛС сахарной свеклы в табаке. Вышеуказанйое можно обьяснить либо недостаточными регуляторными последовательностями нуклеатидов, расположенных по направлению книзу или кверху от мутантных генов АЛС сахарной свеклы в используемых фрагментах ДНК, либо плохой утилизацией регуляторных последовательностей нуклеотидов сахарной свеклы в табаке.

Введение генов осуществляют стандартным способом совместного культивирования. Для каждого построения аликвоту совместно культивируемых растительных клеток (исходная концентрация растительных клеток 2х10 ) отмеривают для устойчивости к хлорсульфурону, и другую аликвоту — для устойчивости к канамицину. Селекцию осуществляют при 2 ч, на млрд. хлорсульфурона или при 50 ч. на млн, канамицина, Пример 5. Ген SURB-Hra, описаный в примере 1, трансформируют в культурные сорта табака заражением Agrobacterium

tumefaciens пластинок табачных листьев, потомство трансформантов анализируют с тем, чтобы продемонстрировать экспрессию устойчивости на уровне целого растения и наследственность признака гербицидной устойчивости. Затем поступают стандартными стерильными методами для манипулирования стерильными средами и аксенными культурами растений и бактерий, включая

° использование колпака с ламинарным потоком для всех переносов. Растения табака для заражения листовых пластинок высевают в чашки и выращивают в растильне: 12 ч при дневной температуре 24 С и 12 ч при ночной температуре 20"С, относительной влажности около 80%, при смешанном холодном белом ceete флуоресцентного и накаленного свечения осуществляют заражение пластинок табачных листьев.

Молодые листья; не полностью распустившиеся и имеющие длину примерно 4-6

10 ем их в 500 мл 10%-.ãî раствора Chlorox, 0,1%-го раствора додецилсульфата натрия и затем промывают 3 раза стерильной деионизированной водой, Пластины листьев диаметром 6 мм получают из целых листьевс.

20 использованием стерильного бумажного пуансона, Пластины листьев инокулируют погружением их в течение нескольких минут в 20 мл ночной культуры Agrobacterium (разбавление 1:10), несущей плазмиду pAGS152.

Культуры Agrobacterium появляются после инокулирования 10 мл бульона Min А (пример 1) с единственной бактериальной колонией, удаленной из бляшки с бульо25 ном Min А и тетерциклина (пример 8 ), °

Культуру выращивают в течение примерно

17 — 20 ч в стеклянных пробирках (18 мм) с культурой в качалке с платформой типа New

Brunswick, поддерживая температуру при

28ОС

После инокулирования пластины листьев помещают на чашки Петри, содержащие среду с агаром CN (пример 6). Чашки герметизируют парапленкой и инкубируют при 40 смешанном освещении для растений, т.е. флуоресцентном и "Gro and Sho" (General

Electric) в течение 2-3 суток в камере для культивирования, где температуру поддер45. живают примерно при 25 С

Чтобы освободить пластинки листьев от

Agrobacterlum и отобрать для выращивания трансформированных клеток табака, пластинки листьев переносят на свежую среду

CN, содержащую 500 мг/л цефотаксима и

100 мг/л канамицина. Цефотаксим сохраняют в виде замороженного основного раствора (концентрация 100 мгlмл) и прибавляют в стерильных условиях (стерилизуют через 0,45 мкм фильтр) к средам после автоклавирования. Свежий раствор канамицина (50 мг/мл) приготовляют для каждого использования и стерилизуют через фильтр, пропуская его в автоклавированные среды, дюймов (10,16 — 15,24 см). собирают скальпелем с растений табака возраста примерно 4-6 недель (Nicotiona tabacum, сорт

CV.NK326 или К14). Листья поверхностно стерилизуют в течение 30 мин погружени1820914

20 в теплицу, где они растут до зрелости. Отдельные. цветки заключают в мешки для то- 25

Пример 6, Для трансформации гербицидчувствительного .томата в гербицидустойчивый используют ген SURB Íãà из табака, переносимый на бинарном векторе

Пластинки листьев инкубируют в условиях культивирования, описанных выше. в течение 3 недель и затем переносят на свежие среды такого же состава.

Всходы возраста приблизительно 1-2 недель, развивающиеся на канамицик-отобранных эксплантатах, подрезают стерильным скальпелем и высева1от в среде А, содержащей 100 мг/л канамицина. Корнеобразование на селективных и неселективных средах регистрируют в пределах 3 недель. Всходы, которые укореняются в канамицине, переносят в почву и выращивают в растильне. как описано выше..Через

3 — 5 недель, но перед тем, как происходит цветение, листовую ткань вырезают и используют для анализа АЛС, как описано в примере 6. Результаты этих анализов, которые указывают на то, что развивается гербицидустойчивая форма АЛС, приведены в табл.9. Растения, проявляющие активность гербицидустойчивой АЛС. затем переносят го, чтобы позволить самооплодотворение без перекрестного опыления. Зрелые семена собирают и осуществляют испытания по качеству потомства дпя определения наследственности признака гербицидной устойчивости. Семена поверхностно стерилизуют, как описано выше, сушат. и семена сажают на среде SG (1/4 соли MS, 0,75% сахарозы.

0,8 arapa) в присутствии или отсутствии гербицида (DPX-F6025, Classic ). Чувствительные семена прорастают, но далее не . развиваются. Результаты испытания по качеству потомства приведены в табл.9. Сегрегационное соотношение трех устойчивых потомств по сравнению с одним чувствительным потомством указывает на присутствие вставки на одном сайте гена SURB-Нга в трансформант, который является .стабильно унаследованным. Это наблюдают в 15 случаях из 17 трансформантов. более высокие соотношения устойчивых потомств к чувствительным показывают множественные вставки в несвязанных положениях в геноме. Соотношение 15:1 указывает на присутствие двух несвязанных геков SURBHra, а соотношение 255:1 — на присутствие четырех несвязанных генов SURB-Нга в трансформантов К14 N 40 и К14 N.:7 соответственно.

pAGS152 в штамме А.tumс1агi .ns HA 1404 (см. пример 1).

Следуют стандартным сп р льным методикам для манипупирйпаним стРрипьных сред и аксенных культур растений и бакге рий. включая использование коппака с flaминарным потоком для всех переносов.

Семена томата (1 усорегэ1сон esr.ulentum сорт Herbst Res Cherry) поверхностно с герилиэуют в течение 30 мин в 10%-ом растворе

Chlorox, 0,1 )(,-ом раст воре дедоципсуп ьфата натрия и промывают 3 раза стерильной деионизированной водой. Семена сажают в ящиках Magenta (Magenta Corp.). содержащих l00 мл среды с агаром OMS, и инкубируют при смешанном освещении дпя растений, т.е. флуоресцентном и "Gro

and Sho" (General Electric) в растипьне, поддерживая в ней температуру около

25 С. Семядоли от всходов 10-15-дневного возраста используют дпя инокуляции

Agrobacterium.

Семядоли скарифицируют путем отщепления около 2 мм ткани от каждого конца семядоли при помощи стерильного скальпеля, Скарифицированные семядопи высевают на чашки Петри на среду с агаром CTM либо в присутствии, либо в отсутствии 75 мкм ацетосирингона (Aldrich Chemical), Для приготовления инокулирования семядолей единственную бактериальную колонию с чашки с агаровой средой Min А и тетрациклина (1 мкм/мл) инокулирут в колбу, содержащую 30 мл бульона Min А (пример 1), и выращивают в течение 2 суток при

28 С s качалке с платформой New

Brunswick. 8 то утро, когда инокулируют семядоли, культуру бактерий разбавляют стерильным бульоном Min А до оптической плотности О,1 при 650 нМ и ей дают размножаться до оптической плотности 0,2 в условиях выращивания, описанных ранее. Эту культуру затем используют неразбавленной для инокулирован ия.

Чашки с агаром СТМ, содержащие эксплантаты семядолей, наполняют 5:мп бактериального раствора в течение приблизительно

5 мин перед тем, как удалить раствор. Затем чашки закрепляют лентой Time Tape (Shamrock Scientific $рес!аИу) с двух сторон чашки и инкубируют в течение 2 суток при смешанном освещении дпя растений, а именно флуоресцентном и "Gro and Sho" (General Е!ес1г1с) при температуре около

250С.

Чтобы освободить растительные культуры от Agrobacterium и отобрать.дпя выращивания трансформированных клеток томата, зксплантаты семядолей переносят 8

1820914

4. Уравновешивают колонки РО-10 50 (Pharmacia) промыванием 5 раз колоночным буферным раствором (100 мМ КНРО4, рН

7,5, 0,5 мМ MgCIz, 10% глицерина, 1 мМ пирувата).

5. Для засева зкстракционного супернатанта прибавляют холодный насыщенный раствор (NH<)zSOq с получением 50% фракции. Инкубируют на льду в течение 30 мин, 6, Центрифугируют экстракт в роторе

SS-34 втечение 20 мин при скорости вращесвежую среду СТМ, содержащую 500 мг/л цефотаксима и 50 мг/л канамицина, и инкубируют их при таких же улсовиях культивирования, которые описаны выше, в.течение приблизительно 3 недель. Затем семядоли переносят в свежие среды с таким же составом и селективными веществами, как и среда

СТМ, однако при 1/10 концентрации эеатина.

Приблизительно через 2 — 4 недели всхо. ды, развившиеся из канамицинотобранных семядолей, отрезают и высевают в средах

OMS, содержащих 500 мг/л цефотаксима и

100 мг/л канамицина. Всходы томата, которые усокренились в канамицине через 2-3 недели, переносят в почву в 8-дюймовых (20,32 см) сосудах и накрывают пластмассовыми мешками. Растения выращивают при смешанных флуоресцентном и накаленном свечениях: 12 ч при дневной температуре

24 С и 12 ч при ночной температуре 20ОС, относительной влажности около 80%, в течение одной недели перед тем, как снять пластмасссовые мешки, Затем растения выращивают еще 2-4 недели и осуществляют испытание АЛС. В этих экспериментах показано повышение неингибированной активности АЛС в присутствии сульфонилмочевины Glassie в экстрактах листьев из трансформированных растений (табл,10), Анализ активности АЛС в отсутствии или в присутствии гербицида из трансформированных или нетрансформированных растений осуществляют следующим образом, 1, Измельчают 2,5 г относительно молодой листевой ткани (4 — 6 дюймов/10,1615,24 см в длину) в тканевом гомогенизаторе, содержащем 10 мл экстракционного буферного раствора (100 мМ КНР04), рН 7,5, 0,5 мМ MgClz, 10% глицерина, 1 мМ пирувата, 0,5 мМ тиаминпирофосфата, 10 нМ флавинаденийнуклеотида) и 200 мг Poiyclar AT (BDH BIochemIcals). Эту смесь сохраняют на льду.

2, Гомогенизируют экстракт в течение приблизительно 10 с с в политроне (Brinkman

Instruments) при наатройке на N 7, 3. Центрифугируют экстракт в роторе

Sorva1I SS-34 в течение 20 мин при скорости вращения 16 000 об/мин и 4 С, 10

30 40 ния 16 000 об/мин и температуре 4 С. Декантируют супернатант.

7. Ресуспендируют гранулы в 1 мл холодного колоночного буфера.

8. Загружают экстракт на колонку и прогоняют объемом колоночного буферного раствора с получением полного объема загрузки, равного 2,5 мл. Этот прогон пропускают через колонку, 9, Элюируют белки двухкратным объемом загруженного экстракта. Извлекают в трубке Falcon (15 мл), расположенной под колонкой.

10. Приготавливают реакцию для каждого экстракта в трубках для микроизмельчения следующим образом; 350 мкл реакционной смеси (200 мМ пирувата, 5 мМ тиаминпирофосфата, 0,9 мМ фламинадениннуклеотида, 5 мМ КНРОф, рН 7,0), 50 мкл либо 5 мМ КНРО4, либо нужной концентрации сульфонилмочевины, и 100 мкл растительного экстракта подвергают взаимодействию.

11, Инкубируют реакционную смесь в течение 1 ч при 30ОС.

12: Для прекращения реакции прибавляют 50 мкл 6 M раствора HzSO4 и инкубируют при 60 С в течение 10 мин. Центрифугируют в микромельнице в течение 5 мин.

13, Приготавливают пробирки для развития красок следующим образом; 500 мкл

0,5%-го креатина реакционной пробирочной надосадочной жидкости, 0,5 мл раствора а -нафтона (1.5 г а-нафтола в 30 мл

2,5N МаОН). Смесь перемешивают и нагревают при 60 С в течение 20 мин.

14. Завихряют каждую пробирку и помещают 100 мкл каждой пробы в резервуары микротитровых чашек. Снимают показания при оптической плотности 530.

В

Среда индукции каллюса I упаковка солей-MS (Gibco Murashlge

OrganIcs Medium) с 3%-ной сахароэой на1л

1 мл 1 мг/мл NAA рН 5,8

0,2 мл 1 мг/мл ВАР

0,8% агара

CN

Среда индукции всходов

1 упаковка соелй MS с 3% сахарозы на 1 л

1 мл 1 мг/мл NAA рН 5,8

1 мл 1 мг/мл BAP

0,8% агара

А

Среда корневой индукции

1 упаковка солей MS (без сахарозы) на1л

5О

1820914

10 г сахарозы рН 5,8

0,8% агара

R-среда Argobacterium

Прибавляют 7,5 г агара к 440 мл воды,. автоклавируют и сохраняют при 55 С. При- 5 бавляют следующие стерильные компоненты:

Среда УЕВ

10 ного раствора гербицидэ на основе сульфонилмочевины можно получить растворением

1 мг гербицида в 100 мл 0.01 N NH4OH с последующим разбавлением (соотношение

1:10) путем добавления 5 MM КНРО, рН 7.

NH4OH и т.д.

20 Гербицидные разбавления: При прове25

1 мМ МЕЯ

3% глюкозы

0,7% агара рН 5,7:

Смесь автоклавируют и прибавляют 1 мл 1 мг/мл раствора зеатина.

Среда 0MS

1 упаковка солей MS

1 мл витаминов 85 (см, выше) 3

3 мМ MES

3% сахарозы

0,8% эгара рН 5,7

Среда Min А + 1 мкгlмл тетрациклина

1. Прибавляют 7 5 гагара к 400 мл воды.

2. Приготавливают основной раствор:

К2Н Р04 5,25 r

КН2Р04 2,25 г (NH<)2S04 0,5 г

Лимоннокислый натрий 2Н20 0,25 г/100 мл

3. Приготавливают и автоклавируют . смесь 20 г/100 мл MgS04 7Н20

4. Приготавливают и автоклэвируют

20%-ный раствор глюкозы

5. Приготавливают тетрациклиновую смесь (1 мг/мл в смеси этанола и Н20), которую затем стерилизуют через фильтр (50

o6 %) 40

50

0,5 мл 1М раствора MgSO4

0 5 мл 1М раствора СаС!2

10.0 мл 20%-ной сахарозы

5,0 мл 100 Mr/мл канамицина

50,0 мл 10 х солей (60 г/л йа2НР04 7Н20

30 г/л КН2Р04;

5 г/л NaCI;

10 гlл ИНаС1)

Среда СТМ

1 упаковка солей MS

1 мл витаминов 85 (на 100 мл; 100 мг никотиновой кислоты, 1000 мг тиамингидрохло рида,.

100 мг пиридоксин. гидрохлорида, 10000 мг мионизита) Для получения среды Min А + 1 мкг/мл тетрациклина смешивают (1) и (2), прибавляют

0,5 мл (3), 5 мл (4) и 0,5 мл (5). на литр

Бактомясной экстракт 5,0г

Бактодрожжевой экстракт 1.0-г

Пептон 5.0 г

Сахароза 5,0 г

М9ЯОт 7Н2О 0.5 г

Агар (при желании) 15,0 г

Гербицидные растворы: 1 ч. на млн. основЭта смесь достаточна для испытания гербицида при концентрации 100 ч. нэ млрд. или ниже. Если требуются более высокие концентрации, растворяют 1 мг в 10 мл 0,01N дении стандартного испытания 50 мкл гербицида прибавляют к 450 мкл испытуемой смеси и экстрагируют, для 1:10 разбавления гербицида. Итак, для каждой испытуемой концентрации следует разбавить 10х раствор в 5 мМ КНРОа рН 7, из основного раствора.

Пример 7. Ген SURB-Нга табака. кодирующий гербицидустойчивую АЛС, используют для трансформации 8еса vulgaris (сахарная свекла) с использованием

Agrobacterlum tumefaciåïç.

Чтобы поверхностно стерилизировать семена, 50-100 семян помещают в стерильные чашки Петри (25 х 100 мм) в колпаке с ламинарным потоком и прибавляют 25 — 30 мл 70%-го этанола. Семена перемешивают вручную в течение 1-2 мин, этанол декантируют, после чего прибавляют 25 — 30 мл 20%ro Chlorox (2G мл коммерческого отбеливателя (80 мл стерильной воды) 1 капля Tween 80), Семена перемешивают нэ ротационной качалке при скорости вращения 40 об/мин в течение 20 мин и отбеливатель декантируют. Стерилизацию отбеливателя повторяют

2 раза в течение всего 60 мин, стерилизованные семена промывают 3 раза в течение

5 мин, каждый раз 25-30 мл стерильной воды..

Для прорастания семян последние высевают на чашки Петри (15 х 150 мм) со средой, отвержденной эгаром 1/2 PGp (12 семян на 50 мл среды); и культивируют при

24 С в темноте.

П р и м е ч а н и е, 10 — 20%-ное загрязнение семян можно ожидать для хорошей, чистой делянки с семенами. По этой причине семена высевают далеко друг от друга на больших пластинках и прорастания наблюдают непрерывно, незагрязненные семена

1820914

40

50.переносят к свежим пластинкам. Если загрязнение грибковое, тогда переносы осуществляют в камере с ламинарным потоком оез вентилирования.

60 — 80% всхожесть семян ожидают для. хорошей делянки семян. Прорастание не синхронное. Необходимо приблизительно

14 суток для достижения а) всех всходов и б) достаточной элонгации с тем, чтобы получить много подходящих эксплантов.

Получают ночные суспензионные культуры (О/N) Agrobacterium, как описано в примере 1. Заново посеянная Agrobacterlum. имеет более короткий латентный период, чем культуры, сохраняемые в течение длительного времени при 5 С. Важно использовать логфазовые бактерии в качестве инокулятов. Поэтому необходимо провести испытание с тем, чтобы обеспечивать пол- учение ночной культуры, которая достигает лог-фазы (оптическая плотность при 550 нм

0,4-0,8) перед инокулированием гипокотилий, Для получения растительных эксплантатов гипотолии разрезают на сегменты около 0,5 см при помощи острого хирургического скальпеля и сразу высевают на чашки с PGp 0,1/0,1, отвержденный агаром. Необходимо следить за тем, чтобы не. случилось высыхания или повреждения раны при использовании тупого скальпеля или при c>tea тии пинцетом.

Для инокулирования эксплантатов последние погружают отдельно в суспензию с лог-фазой соответствующего штамма

Agrobacterium. Зксплантаты погружают на короткий срок (1-3 с) и располагают в решетчатой конфигурации на свежей чашке:

25 эксплантатов на 100 мм чашке PGp

0,1/0,1, о -гвержденной агаром.

Эксплантаты сушат, оставляя чашки открытыми в колпаке с ламинарным потоком в течение 10 — 30 мин. Вследствие этого

Agrobacterlum концентрируется на бане.

Это также может ограничить возможное повреждение. наносимое водой. При этом очень важно следить за тем, чтобы ткань не, повредилась. Требуется тщательное наблюдение за данной стадией. Затем чашки герСреды и структурообразователи метизируют пара-пленкой и культивируют при 24ОС в течение 3 суток.

Зксплантаты собирают в жидкой PG

0,1/0,1, содержащей цефотаксим при кон5 центрации 500 мкгlмл в чашках Петри (25х100 мм), и осторожно встряхивают на ротационной качалке при скорости вращения 40 об/мин в течение 1 ч. Среду декантируют, заменяют свежими противоселек10 тивными средами и встряхивают осторожно в течение еще 2 ч. Эксплантаты высевают в решетчатой конфигурации на чашки (25 х

100 мм) со средой PG 0,1/0,1, отвержденной

arapoM и содержащей цефотаксим (500

15. мкг/мл), и культивируют при 24 С в течение

3 сугок, Отбор трансформированных раститель ных клеток осуществляют следующим образом. Эксплантаты переносят на свежие

20 чашки со средой PG 0,1/0,1, отвержденной агаром и содержащей 100мкг/мл ванкомицина или 2 нг/мл хлорсульфурона в качестве. селективных агентов. Число устойчивых колоний подсчитывают через 20-30 дней. В каждой ране можно наблюдать более чем одну колонию. Трансформанты отщепляют следующим образом, Каллюс удаляют из раны/экспланта хирургическим скальпелем и культивируют независимо друг от друга на свежих селективных средах. Некоторые

Agrobacterlum могут избежать контрселекии..Возможны дополнительные промывки . в жидких средах, содержащих цефотаксим, а также повторные переносы к цефотаксимсодержащим чашкам, отвержденным агаром. С соблюдением предложенных правил можно установить приблизительно 15% загрязнения эксплантатов, которые являются допустимой потерей; Результаты эксперимента по трансформации с использованием линии клеток Beta vutgaris 87193 сахарной свеклы приведены в таблице 11. Уровень устойчивости к хлораульфурону в каллюсах

В.Vulgarls, трансформированной мутантным АЛС-геном SURB-Hra табака, сравнивают с уровнем устойчивости к хлорсульфурону в нетрансформированных каллюсах, Эти результаты показывают, что ген SURB-Hra табака. кодирующий гербицидустойчивую

АЛС, может быть эффективно экспрессирован в сахарной свекле.

1820914

Основные растворы о/л ноте.

0,1

Миоинозит

100

Микронутриенты MS (1000Х) Растворяют MnCIj 4Н О в разбавленной HCI.

Соединения растворяют отдельно перед тем; как растворяют следующее соединение, Кипятят, охлаждают. рН4, сох аняютвтемноте и и4 С.

МпСЬ 4Н20. НэВОз

ZnS0< 7Н20

NaMoGr - 2Н20

CuSO4 5H20

СоСЬ 6Н О

197,9

1,8

287,5

166.206

249,7

23,7,9

100 мкм

1,2

0,1

0.1

19800 мг

1820914

К ль ныес е ы

Brass!ca na us (конечная) Кол-во/л

Загрузка

Среды 1

Компонент

100 мл

1 мл

10 мл

10 мл

0,2 мл

3мл

30 r

18,2 г

8г

0,59 r

Соли-макроэлементы

Микронутриенты MS

Fe ЭДТК

Витамины I

2,4 — Р

Кинетин

Сахароза маннит

Агар

Буфер Mes

10Х

1000Х

100Х

100Х

1 мг/мл

1 мг/мл

3 мас./об.

1,8 мас./об, 0,8 мас./об.

3мМ

Н 5,7, сте илизация автоклвви ованием

Пример 8. Ген SURB — Hra табака, кодирующий гербицидустойчивую АЛС, используют для трансформации Brasslca париз, сорт Giga.

Для поверхностной стерилизации семян последние погружают на 1 мин в 70 ный этанол, затем на 30-60 мин в раствор

СЫогох/Tween (см.пример 7). Поверхностно стерилизованные семена культивируют на

1/2 MS, 1/2 Рбо (см. пример 7) при 24ОC в темноте. Через 5-10 дней после прорастания гипокотоли разделяют на участки 0,5 см и помещают на твердой среде !, содержащей 100 мкм Ацетосиригона (1AS100).

Сразу же зксплантаты окуйают по отдельности в суспензию логфазы LBA4404, содержащей бинарную плазмиду pAGS15.

Эксплантаты высевают обратно на

lAS100. Капельку Agrobacterium осторожно сушат на ткани за счет оставления пластинки открытой в колпаке с ламинарным потоком.

Совместное культивирование осуществляют. при 24 С при малом свете или в темноте в течение 3 суток.

Через 3 суток эксплантаты собирают в жидкой сере 1, содержащей 500 мг/л цефотаксима, в чашках Петри (25х100 мм) и встряхивают на ротационной качалке при скорости вращения 40 об/мин в течение 3 ч.

Эксплантаты высевают на твердую среду 1, содержащую 500 мгlмл цефотаксима, и культивируют в течение 3 суток при 24 С при малом свете.

Эксплантаты высевают на чашки с твердой.средой 1, содержащей 100 мг/л ванкомицина и 100 мг/л канамицина.

Приблизительно через 1 месяц трансфор- мированные каллюсы появляются в виде дискретных узелков на концах эксплантатов.

Сразу после появления узелки отрезают острым скВльпелем и высекают на твердую среду 1, содержащую 100 мг/л канамицина.

Когда трансформированный каллюс достигает достаточного размера (диаметр 0,5 см), его переносят к среде KR, содержащей

100 мг/л канамицина. Этот материал регенерируется быстрее. если его высевают на свежие среды каждые две недели. Корни

5 регенерируют на 1/2 MS; содержащей 2 мкм

lBA.

В одном эксперименте иэ 100 скарифицированных сайтов (любой конец сектора гипокотиля 0,5 см) 20 развили каллюсовую

10 ткань, которая была устойчивой к канамицину при его концентрации 100 мг/л. Пять из

20 трансформированных линий клеток последовательно индуцируют для регенерации на канамицине, соматические, скрещиваю15 щиеся, между собой сибсы для каждого регенрирующего генотипа были получены узловым размножением. Эти растения опрыскивают различными концентрациями хлорсульфурона, результаты приведены в табл.12. Двз из

20 пяти трансформантов устойчивы к хлорсульфурону на уровнях; которые приблизительно в 10 раз выше уровня, летального для контрольных (нетрансформированных) растений.

Для дальнейшей демонстрации экс25 прессии гена SURB-Нга в трансформированном Вгаэв!са napus осуществляют испытание АЛС в присутствии гербицида хлосульфурон, как описано в примере 6.

Сравнивают активности АЛС нетрансфор30 мировзнного родителя и трансформанта Ro

M 5 (табл.12). Результаты приведены в табл,13. В трансформанте наблюдается неуклонное повышение процентной доли ингибирования активности АЛС. Таким

35 образом, ген SURB-Hra табака, кодирующий гербицидустойчивую АЛС, может экспрессироваться в Brass!ca паров, однако. эта.экспрессия не является эффективной.

Добавление нуклеотидных регуляторных

40 псоледовательностей Brass!ca паров, как ожидают, могло бы повысить уровень экспрессии гербицидустойчивой АЛС и уровень выдерживаемости к лиственному введению гербицида..

1820914

57 ти стерилизованные на фильтре компоненты прибавляют асептически

Основные аство ы

Brassfca na us

Компонент

Соли-макроэлементы

Кол-во/л

Заг зка конечная

Состав

ЙН4ЙОЗ

КМОз

MgSO4 . 7Н20

КН2РО4

CaCf2 2Н20

КИОТ (ЙН4)2$04

MgSO4 7Н20

КН2Р04

ЙН4ЧОз

CaCl2 ° 2Н20

МпС12 4Н20

НзВОз

ZnSO4 7Н20

NaMo04 ° 2Н20

CuS04 5Н20

CoCf2 6НгО йаг ЭДТК

FeS04 7Н20

Миоинозит

Тиамин

Глицин

Никотиновая кислота

Пиродоксин

Фолиевая кислота

Биотин

10Х

Соли-макроэлементы

КЗ

10Х

СаОг 2НгО

Микронутриенты MS

100Х

1000Х

Fe ЭДТК

100Х

Витамины I f00X рильные семена промывают 3 раза в стерильной дистиллированной воде и прорастают на среде OMS при 24 С в течение 16-часового дня.

Семядоли всходов дыни возраста 7-14 дней разрезают на срезы 5 мм при помощи нового,острогоскальпеля, Этизксплантатыпогружают в культуру Agrobacterfum с лог-фазой, полученную, как описано-в примере 1. Затем эксплантаты переносят к новым чашкам для совместного культивирования и культивируют при 24ОС в течение 3 суток (16 часов в день)..Пример 9. Ген SURB-Нга табака, . кодирующий гербицидустойчивую АЛС, используют для трансформации Cucumis melo, сорт Amarillo Ovo (дыня).

Поверхностная стерилизация семян в значительной степени упрощается первоначальным удалением семянной оболочки. Затем семена старил.изуют промывкой в

70 -ном этаноле в течение 2 мин, послечего семена промывают в смеси СЫогох и

Tween (см. пример 7) в течение 20 мин. Сте20,5 мМ

18,8 f,5

1,25

3,0

25,0 мМ

1,0

1,0

1,5

3,1

6,3 мМ

100 мМ

1,2

0,1

0,1

100 мкМ

100 мг/л

0,5

2,0

5,0

0.5

0,5

0;05

16,5 г

19,0

3,7

1,7

4,4

25,0 r

1,34

2,5

2,01

2,5

92,3 r

19800 мг

3,73 г

2,78

1000 мг

5. 59

1820914

60.Бактерии убивают путем промывки зксплантатов втечение 3 ч с осторожным перемешиванием в промывочных средах и культивируют на свежих чашках с селективной средой.

Эксплантаты субкультивируют каждые

3-4 недели, причем отсекают более компактные, более темно-зеленые секторы от белого ворсистого калласа.

Когда "Морфогенный" каллас (очень темно-зеленый, компактный, возможно, чуть узнаваемые листья) становится заметным, его переносят к регенерационным средам. Ткань может проходить прямо к росткам вместо того, чтобы проходить через морфогенную стадию, Всходы укореняются в корнеобразующих средах. Приблизительно 70 $ зксплантатов развивают каллас, устойчивый к канамицину при концентрации

100 мкм/и. Трансформированный каллас помещают на среды, содержащие возрастающие концентрации хлорсульфурона, и рост в присутствии гербицида определяют взвешиванием каллюса через 30 дней (табл.14). Некоторые трансформанты растут при высоких концентрациях хлорсульфурО. на (1000 ч, на млрд) так же хорошо, как и в

его отсутствие; например транс 1, транс 2 и .транс 7. Таким образом, re SURB-HRa табака трансформирует дыню и обеспечивает вйсокий уровень гербицидной устойчивости.

Измерения показывают многократное увеличение веса калласа, Среды

0MS

Соли MS u Fe ЭДТК 1х

Витамины 85 1х

Сахароза 3;6

MES 3 мМ рН 5,7

Агар 0,8

Автоклавирование в течение 20 минут

Основная среда

Соли MS u Fe ЭДТК . 1x

Миоинозит: 100 мг/л

Тиамин 1 мг/л

Сахароза 3 g, MES 3мМ рН 5,7

Агар 0,8%

Автоклавирование в течение 20 мин

В качестве среды для совместного культивирования используют основную среду плюс:

100 мкм ацетосирингона (ацетосирингон хранят как основной раствор 100 мМ в . ДМСО)

6 мг/л кинетина

1,5 мг/л 1АА

В качестве промывочной среды используют основную среду без arapa плюс:

500 мг/л цефотаксима

6 мг/л кинетина

1,5 мг/л IAA

В качестве селективной среды используют

5 основную среду плюс:

6 мг/л кинетина

1,5 мг/л IAA

100 мг/л ванкомицина

Одно из следующих селективных ле10 карств в зависимости от конструкции

AgrobacterIum::

100 мг/л канамицина

50 мг/л гигромицина

100. мг/л хлосул ьФурона

15 В качестве регенерационной среды используют основную среду плюс;

0,1 мг/л BAP

100 мг/л ванкомицина

Описанные выше селективные лекарст20 ва

В качестве корнеобразующей среды используют ОМБ плюс:

2 мкм IBA

100 мг/л ванкомицина

25 описанные выше селективные лекарства

Пример 10. Ген SURB-Нга табака, кодирующий гербицидустойчивую АЛС,. используют дл я трансформации Medic ago

30 sativa, сорт Иапде!апбег.

Растения выращивают. и субкультивируют в.OMS. Используемыми материалами являются черешки и сегменты стебелька (длиной 5 мм).от растений приблизительно

35 через 2 месяца после последней субкультуры, Черешки и стебли стерильных растений разрезают на 5 мм отрезки при помощи нового острого скальпеля, Эти эксплантаты погружают в культуру Agrobacterlum лог-фа40 зы, полученную, как описано в примере 1. переносят к свежим чашкам для совместного культивирования и культивируют при

24 С в течение 3 суток (16 часов в день).

Бактерии убивают путем промывки экс45 плантвтов а течение трех часов с осторожным перемешиванием в промывочной среде и. культивируют на свежих чашках с селек, тивной средой, Эксплантаты субкультивируют каждые

50 3-4 недели. Через приблизительно один месяц заметен трансформированный каллюс, выросший иэ обработанных концов экс- . плантатов, которые отрезают от эксплантата и высевают на свежие селективные

55 среды, Когда каллюс становится более организованным (участки более темно-зеленые и более компактные), его переносят к свежим средам для созревания, Когда появляются развившиеся зародыши, их переносят к средам для прораста61

1820914

Среды

OMS

Соли М$ и Fe ЭДТК Витамины 85

Сахароза

МЕ$ рН 5;7

Агар 0,8

Автоклавирование в течение 20 мин.

Основная среда:

Соли М$ и Fe ЭДТК 1х 30

Витамины UM 1x"

Сахароза 3$ рН 5,7

Агар 0,8

Автоклавирование в течение 20 мин. 35

*100x витамины UM . (количестве указаны для ЯО мл загрузки 100x)

Тиамин HCt 1r

Никотиновая кислота 05г 40

Пиридоксин HO 1г

Миоинозит 10г

Глицин 0,2 г

Среда для совместного культивирования: 45

Основная среда плюс:

100 мкм ацетосирингона (ацетосирингон сохраняют в виде смеси 100 мМ в ДМСО)

2,4- О . 0,5 мг/л

BAP 0,2 мг/л

Промывочная среда

Основная среда беэ агара плюс:

Цефотаксим .. 500 мг/л

2,4-0 0.5 мг/л

BAP 0,2 мг/л . 55

50 ния. После прорастания маленькие растения выращивают на этой же среде.

Менее 1 эксплантатов развивают каллюс, устойчивый к канамицину при концен-, трации 100 мг/л. Канамицинустойчивые 5 секторы находят устойчивыми к гербициду хлорсульфурон при концентрации 50 ч. на млрд. Из канамицинустойчивого каллюса получают 3 всхода. Ткань иэ этих трансформантов испытывают на гербицидустойчивый 10 рост при разных концентрациях хлорсульфурона. Один трансформант способен расти при концентрации хлорсульфурона 1000 ч. на млрд. Остальные два способны расти при

5000 ч. на млрд. Таким образом, ген SURB- 15

Hra табака может использоваться для трансформации люцерны и обеспечивает высокий уровень гербицидной устойчивости. да плюс

0,5 л1 /м

0.2 мг/л

f00 мг/л щих селективн ости от констр

50 мг/л

100 мг/л

Селективная сре

Основная среда

2.4-0 л

BAP

Ванкомицин.

Одно из следую ых лекарств, в зависим укции

Agrobacterium .

Гигромицин

Хлорсульфурон

Среда для созревания: то же, что и селективная среда, но без

2,4 — D

Среда для прорастания:

Основная среда плюс ванкомицин 100 мг/л

Селективноелекарство, как описано выше.

Формула изобретения

Способ получения двудольных растений, устойчивых к сульфонилмочевине, предусматривающий получение суспенэионных каллусных культур, отбор клеток, культивирование каллусной ткани и получение регенераторв, устойчивых к гербициду, о т.л и ч аю шийся тем, что перед получением суспензионных каллусных культур конструируют рекомбинантную плазмидную ДНК

pHiaB1NpAGS152, или р735114, или p735D, или р735Н. или р73592, или рМ78; или рМ7А. или рМ?СА, или pM?D8, или pM?H8, или рМ?А0, или рМ7АН, или рМ7А92, или рМ7А8, или pGVKAP, или pAGS589, или

pAGS596, или pHGS594. или рА6$591, или

p5T35D, или р5Т35Н, или pAGS351, или рА6$381, или pAGS140 с геном SURB-Hra, кодирующую мутантную ацетолактатсинтезу табака, в которой А(а 122 замещен íà Pro, или Pro 197 на Ata, или Pro 197 на 6Ь, или

Pro 197 íà Ser, или Afa 205 на,Азр, или Trp

591 íà Leu. или Ala 122 íà Tro и Тго 591 на

Leu, или Рго 197 на Ala u Ala 205 на Asp, или Pro

19? íà Gfn и А!а 205 íà Asp, и Pro 197 íà Ala и Trp 591 на Leu, или Pro 197 íà 6tn u Trp 591 .на Leu, или Pro 197 на Sei и Тгр 591 íà Leu, или Afa 205 на Asp u Trp 591 ía Leu, или ацетолактатсинтетазу Aiablodopsls, в которой Pro 197 замещен на Ser, или ацетолактатсинтетазу сахарной свеклы, в которой А!а

122 замещен на Pro, или Pro 197 на Ala, или

Trp 591 на Leu. или Pro 197 на А(а и Trp 591 на Leu. и трансформируют полученными

ДНК клетки Brassica, или картофеля, или табака, или сахарной свеклы, или дыни, или хлопчатника, или люцерны и отбирают трансформированные клетки.

1820914 ч

Таблица 1

+Штамм Agrobacterlum, содержащий плазмиду Ti, несущую ген АЛС табака и ген N0$/ЙРТИ (канамицинустойчивость)

**Штамм Agrobacterium, содержащий плазмиду Ti, несущую только ген Й0$/NPTll

***Штамм Agrobacterlum, содержащий плазмиду Ti (лишенную либо гена АЛС табака, либо гена N0$/NÐTÞ).

Табл ица2

Спонтанные мутации дрожжевого гена АЛС, приводящие к устойчивости к сульфонилмочевинному гербициду

Результаты каллюсовых тестов табака, зараженного 6ЧКЙТ13, Количество трансформированных ростковых эксплуантатов, продуцирующих каллюс на селективных и неселективных средах

182O9 4

Тл.блицами

Сайт-направленные мутации дрожжевого гена АЛС, приводящие к устойчивости к сульфонилмочевинному гербициду

Мутантный коон

Аминокислота икого типа

Ами

Кодон дикого типа

Аминокислотн. положения нокислотное амещение

122

GCT

А1а

GCT

Afa

256

ДА6

Lys

359

ATG

Met

384

GAC

Asp

591

TGG

Trp

T+T

GTT

АСТ

CCT

ААТ

АТТ

СЯТ

СОТ

CTT, ТАТ

Т Т

TTT

ОАА

«АТО

АЩ CÌ

ZGG

СОТ

TGT

ОАФ

TGG

GAC

GGG

CTG

CCG

TGG

ССА

CAG

ССЬ

TGG

ТСС

GGT

ТО С

ААА

GAC

ОАО

TT®

САС

ТА

АТА

ОТ6

AAG

AGG

ATG

ЯАС

САО G

Ser

Vaf

Thr

Pro

Asn

Ие

His

Arg

Leu

Tyr

Cys

Phe

Glu

Met

Lys

Gln

Trp

Arg

Cys

Clu

Trp

Asp

Gly

Leu

Pro

Trp

Pro

Glu

Pro

Тгр

Ser

Gly

Cys

Lys

Asp

Gly

Phe

Hfs

Tyr

lie

Vai

Lys

Arg

Met

Asn

Gln

Thr

1820914

68.

Таблица4

Перенос-ДНК из фагового клона 1 в чувствительные клетки йлаЬасит

*Некультивируемые совместно (контрольные) растительнйе клетки.

**Растительные клетки, культивируемые совместно.с АлцаеГас!епз, содержащим плазмиду pAGS145, с канамицинустойчивым вектором, содержащим ген табака дляэкспрессии гербицидчувствительной АЛС из фагового клона 1.

Таблица5

Перенос ДНК из фагового клона 3 в чувствительные клетки йлаЬасив

*Некультивируемые совместно (контрольные) растительные клетки.

++Растительные клетки, культивируемые Совместно с Алоае1ас1епз, содержащим плазмиду pAGS112, с канамицинустойчивым вектором..

*+*Растительные клетки, культивируемые совместно с Алоае1ас1епз, содержащим плазмиду pAGS152, с канамицийустойчивым вектором. содержащим фаговый клон 3.

Таблица 6

*100 колоний, высеянных при каждом уровне хлорсульфурона.

*"Колонии, полученные из некультивированных (контрольных) растительных растений.

*"*Колонии, полученные в результате совместиого культивирования (контрольньвх) . растительных клеток с А,тиеИас!епз, содержащей pAGS f52 и первоначально селектированную за счет устойчивости к хорсульфурону при концентрации 2 ч/млрд., Уровень устойчивости к хлорсульфурону в клетках N.tabacum сорта W38, трансформированных мутантным геном АЛС

69

1820914

Таблица7

1. Некультивируемые совместно растительные клетки.

2. Растительные клетки, культивируемые совместно с А tumefac(ens, содержащим pAGS152, субклон $4/Hra.

3. Растительные клетки, культивируемые совместно с А tumefaclens, содержа° щим pAGS312, сублокан СЗ, ф31 (ориен- тация 1).

4. Растительные клетки, культивируемые совместно с Алите1ас1епз, содержащим

pAGS313, субклон СЗ, ф31 (ориентация 2).

5. Растительные клетки, культивируемые совместно с А tumefaciens, содержащим pAG5351, субклан СЗ, ф35, 6. Растительные клетки, культивируемые совместно с Алите1ас!епз, содержащим pAGS381, субклон С3, ф38.

Таблица8

Гербицидная устойчивость в растительных клетках, трансформированных сайтспецифическими мутантными генами АЛС сахарной свеклы

Таблица9 Эксперимент 3 по пав горному введению АЛС

Перенос ДНК иэ фаговых клонов 31, 35 и 36 к чувствительным кле гкам N.tàÜàñèï

Число колонийобраэующих единиц, происходящих от 10 протопластных эквивалентов leреэ один месяц после совместного культивирования

1820914

Продолжение табл. 9

Потомство устойчивое/чувствительное ф неигнибированной активности АЛС сегрегационное соотношение устойчивое/чувствительное

1000 ч. на млрд

100 ч. на млрд

Активность АЛС в каждой линии относитСя к активности в отсутствие гербицида, которая принимается за 100$, Используемый геобицид на основе:сульфонилмочевины представляет собой ОРХ-F6025 (6!азз!6 } при концентрации 10 ч,на млрд;

Устойвое потомство способно расти при:указанных концентрациях гербицида

0РХ-F6025 (Classic );

Таблицэ10

Активность АЛС томатов трансформированного и дикого типов

° J j Активности АЛС в каждой линии относятся к активности в отсутствие гербицида, которую принймают за 100$. В качестве соединения сульфонилмочевины испарьзуют 0РХ-F6025, которое яаляется действующим началом в гербициде 6(азз6."".

Таблица 11

Линия 87193 Beta vulgarls, трансформируемая LBA4404 Agrobacterlum tumefaclens, несущим лазмиду, pAGS152.

Нетрансформированная линия 87193 Beta vulgarls, К14 ЬЬ27

К14; N.29

К29 tk31

К14 %32c

К14 A&40

К14 %41

К14 ЬЬ42

К14 1+53

К14 М54

К14 М54А

44

32

41 . 40

29

37

34

129/45

192/46

106/35

140/65

218/18

255/35

162/74

130/59

99/38

137/55

108/42

163/67

99/34

63/86

212/26

296/74

77/72

149/139

92/43

100/72

3/1

3/1

3/1

3/1

15/1

3/1

3/1

3/1

3/1

3/1

1820914

ТлГ!лицч12

I

10 н. нэ млн.

+++ нормальный рост, никакой осевой индукции;

++ уменьшенный рост, сублетальный у пчелы, осевая индукция;

+ уменьшенный рост, летальный у пчелы, осевая индукция; — летальный, Табл и ца 13

Активность АЛС Brasslca napus дикого типа и,трансформированного Brasslca napus

Активности АЛС дан@ по отношению к активности в отсутствие гербицида, которая принимается за 100 . Используемым соединением сульфонилмочевины является хлорсульфурон (DPX-W41S9), который представляет собой действующее начало в гербициде Glean .

Таблица14