Способ получения штамма клубеньковых бактерий люцерны

 

Использование: в области сельскохозяйственной микробиологии, для получения штаммов клубеньковых бактерий люцерны с повышенной конкурентоспособностью. Сущность изобретения состоит во введении в геном бактерий дополнительной плазмиды pPON, промаркированной транспозоном Tn5-mob, с помощью триродительского скрещивания штамма клубеньковых бактерий люцерны штамма Agrobacterlum rhizogenes Д 32 15834, и штамма бактерий Escherichla coll С600, несущего плазмиду RP4-4, и последующего отбора клонов с высокой азотфиксирующей активностью и симбиотической эффективностью. 3 табл.1 ил.

СОЮЗ COI3F T C K VIX

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСГ1УБЛИК (н)1 С 12 N 15/07

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ФЕКЛ "вЧОИ О1 f-. ч е

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4925248/13 (22) 31.01.91 (46) 23.06.93. Бюл. М 23 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии (72) Н,И,Новикова, Е.А.Павлова, В.И.Сафронова и А,П.Кожемяков (56) Генетические методы селекции клубеньковых бактерий (методические рекомендации). Л., ВНИИ с/х микробиологии, 1984, с.

30-35, (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ШТАММА КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ ЛЮЦЕРНЫ

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии, в частности к получению штаммов клубеньковых бактерий с улучшенными свойствами.

Цель изобретения — предложить генетический способ получения штаммов клубеньковых бактерий люцерны, сохранивших высокую аэотфиксирующую активность и симбиотическую эффективность исходных штаммов и повысивших их эа счет увеличения количества клубеньков, образуемых полученными штаммами, повысивших своа конкурентоспособность. что закреплено наследственно. В качестве такого способа предлагается проводить триродительское скрещивание штаммов клубеньковых бактерий люцерны, Agrobacterium rhizogenes Д

32 15834, содержащего плазмиду pPON, и бактерий Escherichia coli с600, несущего плаэмиду RP4-4, и отбирать клоны, Плазмида pPON получена на основе собственной корне индуцирующей плаэмиды штамма

„„. Ж „„1822883 А1 (57) Использование; в области сельскохозяйственной микробиологии, для получения штаммов клубеньковых бактерий люцерны с повышенной конкурентоспособностью. Сущность изобретения состоит во введении в геном бактерий дополнительной плаэмиды

pPON, промаркированной транспоэоном

Тп5-mob, с помощью триродительского скрещивания штамма клубеньковых бактерий люцерны штамма Agrobacterlum rhizogenes Д 32

15834, и штамма бактерий Escherichla coll

С600, несущего плазмиду RP4-4, и последующего отбора клонов с высокой аэотфиксирующей активностью и симбиотической эффективностью. 3 табл.1 ил.

Agrobacterium rhizogenes 15834 путем маркирования ее транспоэоном Тп5-mob. Донором плаз миды pPON служит штамм

Agrobacterium rhizogenes Д 32 (штамм

15384, промаркированный указанным транспозоном), устойчивый к рифампицину и канамицину в концентрации, соответственно, 40 и 200 мкгlмл. Плаэмида pPON Л имеет молекулярную массу в 258 М и пред- CO

Ю ставляет собой коинтеграт двух плазмид меньшей массы (107 и 154 М). поэтому в клетках Rhizoblum melllotl она может быть представлена в виде трех плазмид с молекулярной массой 107, 154 и 258 М. Эта плазмида несет гены, контролирующие индукцию "бородатых" корней у штаммов

Agrobacterium rhlzogenes (White F.F., Nester

ЕМ. Kairy root; plasmld encodes virulence

traits in Agrobacterium rhlzogenes - J.

Вас». ol., 1980, 141.3, 1134 — 1141). Донором плаэмиды RP4-4, несущей гены устойчивости к тетрациклину и ампициллину (концен1822883 трация антибиотиков в среде, соответственно. 20 и 100 мкг/мл), служит штамм

Escherlchla coll С600 (Simon R. High

frequency mobilization of gram-negative

bacterial repllcons by the in vitro constructed

Тп5-mob transposon. — "Molec. ben. benet"1984, 196.3, 413-420.

Сущность изобретения поясняется следующими примерами его реализации.

Пример 1. Трехродительские скрещивания проводят на питательной среде следующего состава: К2НР04 - 0,5 r; MgSO< х х7Н20 - 0,2 г; NaCI 0,1 г; СаСОз — следы; маннит — 10,0 г; дрожжевой экстракт — 0,5 г; вода дистиллированная — 1 л, рН 7,0 — 7,2.

Выращивание при 28 С в течение 24 ч. Густые суспензии родительских штаммов наносят каплями на агаризованную среду указанного состава (20,0 г агара на 1 л среды). Через 16-18 ч клетки собирают в пробирки с 1 мл стерильной воды и высевают на чашки Петри с указанной агаризованной средой с добавлением антибиотиков — канамицина и стрептомицина (1000 мкг/мл) или канамицина и новобиоцина (120 мкг/MR).

Одновременно на эти среды высевают контрольные варианты, из которых делают разведения с высевом на указанную питательную среду для определения частоты появления рекомбинантов, Реципиентный штамм клубеньковых бактерий люцерны должен быть маркирован устойчивостью к стрептомицину или новобиоцину.

Клоны рекомбинантов появляются на 4 сутки при выращивании при 28 С. В наших опытах было выявлено 3 независимых скрещивания, частоты появления канамицин-устойчивых клонов у штамма CXMI-105

Rhizobium melilotl составляли 10 — 10 . Из каждого скрещивания отбирали по 3 рекомбинанта и проверяли их симбиотические свойства в условиях стерильного микровегетационного опыта на растениях люцерны сорта Зайкевича. В большие пробирки объемом 60 мл вносили по 5 г вермикулита, промытого и прокаленного при 800 С в течение 2 ч. В каждую пробирку добавляли по

10 мл среды Красильникова-Кореняко следующего состава: KzHPO4 — 1 г; MgS04 — 1 г;

Саз(Р04Ь вЂ” 0,2 г; FeS04 — следы: вода дистиллированная — 1 л. Пробирки со средой стерилизовали в автоклаве. Семена люцерны стерилизовали концентрированной серной кислотой в течение 5 минут, промывали стерильной водой и проращивали до появления корешка размером 3-6 мм (1-2 суток) при 28 С. Проростки раскладывали по 2 в каждую пробирку. Клубеньковые бактерии для инокуляции растений выращивали на агаризованной среде указанного выше со5

55 става (без антибиотиков) при 28 С в течение

2 суток и суспендировали в растворе микроэлементов: НзВОз — 0,05 г; (NH4)zMo04—

0,05г; KCI — 0,005 г; NaBr — 0,005 r; ZnSO< х х7Н20 — 0,03 г; А!2(ЯОа)з х 18HzO — 0.003 г;

MnSO< — 0,002 г; вода дистиллированная — 1 л. Через сутки после посева семян в каждую пробирку вносили по 1 мл инокулюма (10

10 ) кл/мл. Опыты ставились в 12-кратной повторности. Растения выращивали в теплице при 25 С в течение 30 дн. По истечении

30 дней пробирки герметично закрывали и вводили в них шприцем ацетилен до концентрации 10 по обьему. Количество этилена, образовавшегося в результате восстановления ацетилена нитрогеназой клубеньковых бактерий, определяли через

24 часа на газовом хроматографе. Величину ацетиленредуктазной активности клубеньков, являющуюся показателем интенсивности работы нитрогеназы, определяли по формуле M(CzHz) = р. Vñò. x V 10-6 М х

1ст. Нпр, х 22.4 где M(CzHz — ацетиленредуктазная активность клубеньков (ммоль/coc 24 ч);

Inр — длина пика этилена, полученного при введении исследуемой пробы;

Icr. — длина пика, полученного при введении стандартной пробы 0,1 (, этилена;

V<>. — объем стандартной пробы;

Vnp. — обьем исследуемой пробы;

V — объем пробирки с растениями.

Способность к индуцированию "бородатых" корней исследовали на раневых поверхностях листьев табака в асептической культуре по методике, описанной в работе

Bercetohe J. Chrigni О., Adam S., David С., Morphogenetic and cellular reori ептабопз

induced by Ag robacterium rhizogenes (strain s

1855, 2659 and 8196) on carrot, реа and

tobacco - "Plant $сГ, 1987, 52, 3, 195-210, Семена табака стерилизовали раствором 30 перекиси водорода и 96 этиловым спиртом, взятым в соотношении 1;1, в течение 10 минут. Затем их помещали на среду Мурасиге и Скуга без гормонов (мг/л)

: и Н4ИОз - 1650; КМОз - 1900; CaClz x 2Н20

- 440; MgSO x 7Н20 — 370; KHzP04 — 170;

НзВОз — 6.2; MnSO4 х 4Н20 — 22,3; СоС12 х

x6HzO — 0.025; CuSOq х 5НгΠ— 0,025; ZnS04 х 7H?O - 8,6; NazMo04 х 2Н О вЂ” 0,25; KJ

0,83; FeS04 х 7НгΠ— 27,8; Ма ЭДТА х 2Н О вЂ” 37,3; тиамин-Н С! — 0,1; пиридоксин — H CI — 0,5; никотиновая кислота — 0,5; мезо-инозит — 100; глицин — 2,0: индоксилуксусная кислота — 2,0; кинетин — 0,2: сахароза—

30000. рН 5,6 — 5,8. Выращивали в течение

2-3 недель. Срезанные листья проростков

1822883

10

55 надсекали перпендикулярно главной жилке и помещали в суспенэию клубеньковых бактерий, выращенных в течение суток на качалке в жидкой среде с маннитом и дрожжевым экстрактом приведенного в примере 1 состава. В бактериальной культуре листья табака выдерживали 1-2 часа и переносили на среду Торри без гормонов (мг/л); MgS04 х 7Н20 — 42; Са(МОз)г х 4HzO — 242; КМОз-85; KCI — 61: КНгРО4-20; FeClg — 1,5; MnS04 х Н20 — 4.5: ZnSO4 х 7HzO — 1,5;

НзВОз- 0,25; NazMo04 х 2HzO — 0,25; CuSO4 х 5Н20 — 0,04; никотиновая кислота — 5,0; тиамин-HCI — 1,0; сахароза — 60000. рН 6,0.

Выдерживали 12 ч и перекладывали на среду Мурасиге и Скуга укаэанного состава с добавлением 0,25 мг/л бензиламинопурина и 0,05 мг/л а-нафтилуксусной кислоты. Учет патогенности проводили на 14 день после инокуляции. Характерный фенотип "бородатых" корней: корни, индуцированные патогенными рекомбинантами, отличаются от нормальных корней тем, что они быстрее растут, сильнее разветвлены, имеют вертикальное и горизонтальное направление, а не только вниз. Растения, регенерированные из трансформированных корней, сильно ветвятся, имеют сморщенные листья.

Результаты микровегетационного опыта и определение способности к индуцированию "бородатых" корней представлены в табл.1.

Как видно из табл.1, ацетиленредуктазная активность не отличалась достоверно от контрольного варианта (эа исключением штамма под N 9), что указывает на сохранение азотфиксирующей активности штаммареципиента. (Масса растений также не различалась, поэтому данные о ней не приводятся), Восемь из полученных штаммов обладали усиленной вирулентностью и образовывали большее количество клубеньков на растениях люцерны, чем штамм-реципиент. Все полученные штаммы, в отличие от штамма-донора, не обладали несвойственной и ненужной для

Rhlzobium способностью индуцировать "бородатые" корни.

Пример 2. В микровегетационном опыте по той же методике была исследована динамика нодуляции корней люцерны после инокуляции 4 иэ полученных рекомбинантов. Каждым рекомбинантом, а также— в качестве контроля — штаммом-реципиентом инокулировали по 30 проростков. Отмечалось среднее количество клубеньков на 1 растение на 9-й, 10-й, 15-й, 22-й и 30-й дни.

Результаты представлены на фиг,1.

Как показано на чертеже, отобранные штаммы превосходят исходный родительский штамм по скорости образования клубеньков на люцерне, Известно, чтоу мутантов Rhizoblummellloti с задержкой нодуляции отмечается снижение конкурентоспособности, соответственно ускоренная нодуляция будет коррелировать с усиленной конкурентоспособностью. Для анализа конкурентоспособности исследуемых штаммов был поставлен микровегетационный опыт, в котором использовали метод относительной оценки конкурентоспособности по массе растений по методике. изложенной в статье

Л.А.Шарыповой и Б,В,Симарова "Метод сравнения конкурентоспособности эффективных штаммов Rhizobium meliloti — Труды ВНИИ с/х микробиологии, т.55, 1985, с, 85 — 90. Совместно с исследуемым штаммом была проведена инокуляция неактивным штаммом СХМ1-48, обладающим высокой конкурентоспособностью, в концентрации, в 1000 раз превышающей концентрацию исследуемых рекомбинантов. Конкурентоспособность учитывали как отношение прибавки массы растений, полученной при совместной инокуляции, к прибавке массы растений, полученной в варианте моноинокуляции активным штаммом. Использование больших пробирок позволило выращивать растения в течение 2 мес. Результаты опыта приведены в табл.2.

Как показывает табл.2, по своей симбиотической эффективности исследуемые штаммы на 20-40 превзошли исходный штамм СХМ1-105. Конкурентность рекомбинантов в 2-3 раза превосходила конкурентоспособность штамма CXMI-105. Для окончательной оценки конкурентоспособности полученных рекомбинантов был поставлен вегетационный опыт на нестерильном песке в 3-килограммовых сосудах в пятикратной повторности. В качестве инфекционной нагрузки был также использован штамм СХМ1-48 а соотношении 1000;1, Результаты опыта приведены в табл.3.

Как показывает табл.3, отобранные рекомбинанты обладают не только высокой симбиотической эффективностью и азотфиксирующей активностью, но также способны успешно конкурировать с местной популяцией клубеньковых бактерий за сайты взаимодействия на корнях люцерны.

Кроме того, в той же таблице 3 показаны результаты анализа абсолютной конкурентоспособности этих штаммов по маркеру устойчивости к канамицину. Для этого из клубеньков, образованных на корнях люцерны, выделяли штаммы бактерий и высевали их на селективную среду с канамицином. Было проверено Ilo 100 клу1822883

Таблица1

Свойства рекомбинантов СХМ1-105 (pPON) беньков. Результаты показывают, что метка сохраняется, и отобранные штаммы действительно высококонкурентоспособны. Стабильность сохранения плазмид в клетках R.òålÏDÎ проверяли в течение 1,5 лет методом электрофореза в агаровом геле. Отобранные рекомбинанты были стабильны.

Таким образом, можно заключить, что предлагаемым нами способом можно на основе селекционных штаммов быстро получать штаммы с высокой азотфиксирующей активностью и симбиотической эффективностью эа счет повышения их конкурентоспособности, повышения количества клубеньков, образованных этими штаммами.

Формула изобретения

Способ получения штамма клубеньковых бактерий люцерны, включающий введение в их геном дополнительных плазмид, о т л и ч а5 ю шийся тем, что, с целью повышения азотфиксирующей активности и симбиотической эффективности штаммов за счет повышения количества образованных клубеньков, введение в геном дополнительных плазмид

10 проводят путем триродительского скрещивания штамма клубеньковых бактерий люцерны, штамма бактерий Agrobacterlum

rhlzogenes Д32 15834, содержащего плазмиду

pPON, штамма бактерий Escherichia coll

15 С600, несущего плазмиду RP4-4, и отбирают клоны, обладающие повышенной азотфиксирующей активностью и симбиотической эффективностью.

Симбиотические свойства рекомбинантов в условиях микровегетационного опыта

Симбиотические свойства рекомбинантов в условиях вегетационного опыта

1822883

Таблица2

Таблицами

1822883

О»

Редактор Т.Шагова

Заказ 2174 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государс венногп комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва. Ж-35, Раушская наб„4/5

Производствс.l но и..щательскии комбинат "Патент, г, Ужгород, ул.Гагарина, 101

4)

11

З:

44 3

Е

Составитель Н.Новикова

Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор Ы.Куль

Способ получения штамма клубеньковых бактерий люцерны Способ получения штамма клубеньковых бактерий люцерны Способ получения штамма клубеньковых бактерий люцерны Способ получения штамма клубеньковых бактерий люцерны Способ получения штамма клубеньковых бактерий люцерны Способ получения штамма клубеньковых бактерий люцерны 

 

Похожие патенты:
Изобретение относится к области клеточной инженерии

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к способам иммунохимической оценки пролиферации лимфоцитов человека, и может быть использовано в фундаментальных исследованиях и в клинико-лабораторной практике для оценки пролиферативной активности клеток при онкологических и онкогематологических заболеваниях
Наверх