Способ обнаружения физиологически активных веществ растительного происхождения, обладающих антигрибной активностью

 

Использование: биология, биохимия растений и их защита от вредителей и болезней , обнаружение веществ с антигрибной активностью. Сущность изобретения: способ включает спиртовую экстракцию растительного материала, очистку экстракта и выявление открываемых веществ методом биоавтографии, количественную оценку их физиологической активности по подавлению прорастания уредоспор ржавчинного гриба in vitro. 2 ил.. 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ ет

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (2 I) 4911596/13 (22) 11.01,91 (46) 30.06,93. Бюл. М 24 (71) Северо-Кавказский научно-исследовательский институт фитопатологии (72) В.В.Чигрин, Л.В.Розум и Т.M.Ñèäîðîâà (54) СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ, ОБЛАДАЮЩИХ АНТИГРИБНОЙ АКТИВНОСТЬЮ

Изобретение относится к биологии, конкретно к биохимии растений и их защите от вредителей и болезней, и касается способов обнаружения веществ с антигрибной активностью.

Предлагаемый способ аналогов не имеСущность заявляемого способа заключается в том, что проводят исчерпывающую спиртовую экстракцию растений пшеницы и камедей, полученный экстракт очищают с помощью высокоскоростного центрифугирования, реэкстрагируют этилацетатом и хроматографируют в системе гексан — этилацетат — метанол (60: 40: 1), хроматограммы засевают грибом Clados porium

cucumerinium, с помощью которого обнаруживают места локализации антигрибного вещества, количественную оценку их физиологической активности проводят по подавлению прорастания уредоспор ржавчинного гриба in vitro.

Пример 1, Обнаружение ФАВ с помощью биоавтографии в листьях пшеницы, „„Я „„1824146 А I (я)ю А 01 N 61/00;G 01 N 30/90 (57) Использование: биология. биохимия растений и их защита от вредителей и болезней, обнаружение веществ с антигрибной активностью, Сущность изобретения: способ включает спиртовую экстракцию растительного материала, очистку экстракта и выявление открываемых веществ методом биоавтографии, количественную оценку их физиологической активности по подавлению прорастания уредоспор ржавчинного гриба in vitro, 2 ил., 1 табл, Листья пшеницы (5 r) фиксируют кипящим этанолом и проводят исчерпывающую экстракцию материала 80ь раствором этанола до полного обесцвечивания растительного материала. Экстракт упаривают на ротационном испарителе при температуре не выше 40 С до водного остатка, который а центрифугируют 30 мин при 10 тыс. об/мин. Ср

Надосадочную жидкость экстрагируют ( трижды равным объемом этилацетата. Объединенный этилацетатный экстракт упаривают досуха в ротационном испарителе при ю температуре не выше 40 С, сухой остаток + ь смывают небольшим количеством (— 4 мл),0 этилацетата, который наносят на пластину, покрытую силикагелем (толщина рабочего слоя 2,0 мм). Хроматограмму развивают в системе гексан — этилацетат — метанол (60:

40: 1). После подсушивания хроматограммы и тщательного проветривания для удаления следов органических растворителей ее засевают грибом Cladosporium cucumerinum u помещают во влажную камеру. Через 2 суток вся поверхность хроматограммы покрываются черно-зеленым мицелием гриба, и

1824146

Количество спор в поле зрения (ус- Подавление прораСорт растения или вид камеди

Растительстания спор, редненное из 10 полей) ный материал

1 (1 проросших спор — — — + общее (Пшеница

)()!

24

Капли

Кубанка-3 !

Литтл Клаб

100

25 только места расположения антигрибных веществ остаются белыми, т.к. эти соединения ингибируют развитие гриба (фиг. 1), Пример 2, Обнаружение ФАВ в камедях. 10 г камеди экстрагируют 80 раствором этанола, экстракт упаривают досуха в выпарительной чашке, Сухой остаток смывают 3 мл 80 (раствора этанола, подвергают хроматографическому разделению, как описано выше. После хроматографирования проводят биоавтографию, как описано крыше. Через 2 суток получают картину локализации антигрибного вещества (фиг. 2), Пример ы 1 и 2 позволяют обнаружить ФАВ в растительном материале и визуально, по размеру пятна ингибирования роста гриба Cladosporium cucumerium, оценивать их активность, Пример 3. Количественная оценка, выделенных из растительного материала

vеществ, по подавлению прорастания спор ржавчинного гриба Puccinia recondita, Лис ья пшеницы экстрагируют метанолом, экстракты концентрируют на ротационном 25

;;акуумном испарителе досуха, остаток растворяя т в небольшом количестве метанола, наносят на препаративные хроматогра1ичоские пластины с толщиной слоя в 2 мм. лроматограммы развивают в системе хлороформ-метан-вода (325:175:36) и высушивают в вытяжном шкафу. Участки хроматограммы, соответствующие зонам подавления роста гриба Puccinia reconodita, счищают, многократно экстрагируют мета нолом при встряхивании, экстракт центрифугируют и упаривают в выпарительных чашках досуха. Остаток растворяют в 1 мл горячей дист, воды, смешивают с 1 мл 2 агар-агара, наносят на предметные стекла, 40 на которые затем напыляют споры ржавчинного гриба в количестве, исключающем самоингибирование (не более 20-25 штук в поле зрения). Стекла помещают во влажную камеру на 16 ч, после чего под микроскопом 45 проводят подсчет проросших спор (в 10 полях зрения).

Суммарное среднее количество проросших спор по сравнению с контролем (чистый агар-агар) служит показателем токсического действия изучаемого вещества по отношению к прорастающим спорам облигатного патогена.

Этим же методом исследуют физиологическую активность растительных камедей (пример 2), Камеди (2 г) суспендируют с 1 мл

10,(, раствора этанола, Полученную суспензию смешивают с 1 мл 27; агар-агара и наносят на предметные стекла. на которые, после застывания агар-агара, напыляют споры ржавчинного гриба, Предметные стекла помещают во влажную камеру на 16 ч и затем под микроскопом подсчитывают количество проросших спор (10 полей зрения).

В опытах используются споры гриба, прорастаемость которых не ниже 80ф,, Физиологическая активность растительных экстрактов оценивается по подавлению прорастания уредоспор ржавчинного гриба, Статистическую обработку полученных данных осуществляют с помощью т-критерия

Стъюдента. Достоверность различий оценивают при уровне вероятности P = 0,95.

Полученные данные представлены в таблице.

Таким образом, способ дает возможность обнаружить ФАВ растительного происхождения, обладающее антигрибной активностью, Формула изобретения

Способ обнаружения физиологически активных веществ растительного происхождения, обладающих антигрибной активностью, заключающийся в том, что проводят спиртовую экстракцию растительного материала, очистку экстракта, выявление открываемых веществ методом биоавтографии и количественную оценку их активности по подавлению прорастания уредоспор ржавчинного гриба in vitro.

1824146 ф 1(>ф г

Ъ» с

Кубанка — 3

> »>г /

Продолжение 1at,>;,èöû

Литтл Клаб

1824146

С Ь /(с/. P

С-7 Cl УЙ /З Р2. dc CZ 74Z 4

Составитель B. Чигрин

Техред M,Mîðãåíòàë

Корректор С. Шекмар

Редактор

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 2201 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб„4/5