Способ дифференциальной диагностики возбудителей газовой гангрены

 

Использование: микробиология, применение высокоэффективной жидкостной хроматографии для диагностики анаэробных инфекций. Сущность изобретения: для дифференциальной диагностики возбудителей газовой гангрены клостридии выращивают на мясном бульоне, с целью получения производных аминоп п пробы культуральной жидкости и контрольной питательной среды вводят внутренний стандарт, белки осаждают хлорной кислотой, осадок центрифугируют , центрифугат обрабатывают раствором дансилхлорида в ацетоне и полученные производные аминов разделяют ВЭЖХ, а вид клостридии определяют по соотношению содержания производных аминов в культуральной жидкости и контрольной питательной срсдо, В качестве внутреннего стандарта используют 1,6-диаминогексан. 1 Clostrdiumi perfringcns, Clostrlclium hlstolytlum, Clostridium oedematlens, Clostrldlum septicum определяют при наличии в культуральной жидкости / -фенилэтиламина, путресцина, кадаверина и шстамина в определенных соотношениях. 5 з.п. ф-лы, 5 ил,, 1 табл. сл с

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕспуБлик

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4915050/13 (22) 27.02.91 (46) 30.06. 93. Бюл. N 24 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт биологического приборостроения (72) H.Ô.Òèòêoâà, Т.И.Сергеева, В,А.Бабайцева и Е.В.Чирикова (56) Лабораторное дело, 1988, N. 3, с.3-9.

Brooks J, В. Moore W. F.Ñ. Уаэ

chromatografik,analysis of.amlne and other соарообв produced by several species of

clostrldlum. Can. J.MIcroblol, 1969, v.15, р.1433-1446. (54) СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ГАЗОВОЙ

ГАНГРЕНЫ (57) Использование: микробиология, и рименение высокоэффективной жидкостной хроматографии для диагностики анаэробных инфекций. Сущность изобретения: для дифференциальной диагностики возбудителей газовой гангрены клостридии выращивают

Изобретение относится к хроматографическим методам исследования, в частности к области применения высокоэффективной жидкостной хроматографии в бактериологии.

Целью изобретения является повышение точности способа, Это достигается тем, что в способе, включающем выращивание клостридий на мясном бульоне, получение производных аминов и их хроматографическое определение, в пробу культуральной жидкости вводят внутренний стандарт, осаждают белки хлорной кислотой, отделяют осадок белков центрифугированием, центрифугат обрабаты5Ы«182444б А1 (si)s С 12 0 1/04; 6 01 N 30/88 на мясном бульо IQ, с целью получения flpo изводных аминов л пробы культуральной жидкости и контрольной пита гельной среды вводят внутренний стандарт, белки осаждают хлорной кислотой, осадок центрифугируют, центрифугат обрабатывают раствором дансилхлорида в ацетоне и полученные ïðîизводные аминов разделяют ОЭЖХ, а вид клостридий определяют по соотношению содержания производных аминов в культуральной жидкости и контрольной питательной среде. Б ка естве внутреннего стандарта используют 1,6-диаминогексан, С1оstrdiumi perfringens, Clostrldium

histolytium, Clostridlum oedematlens, Clostrldium septicum определяют при наличии в культуральной жидкости /3-фенилэтиламица, путресцина, када верина и гистамина в определенных соотношениях. 5 з,п. ф-лы, 5 ил„1 табл. вают раствором дансилхлорида в ацетоне, продукты реакции разделяют высокоэффекти в ной >кидкостн ой х рома то граф и ей, и ри этом вид клостридий определяют по соотношению содержания аминов в культуральной жидкости и среде культивирования.

Кл. перфрингенс определяют при наличии в пробе/3 — фенилэт ламина, путресцина, кадаверина и гистамина в следующих соотношениях: — = 40-100; — =1 — = f — =- 4 — 14, . М2 з ° Nq

Цк »4к зк м где N<, Ny, Мз и Й4 — отношение площадей хроматографических пиков /l -фенилэтиламина, путресцина, кадаверина и гистамина

1824446 к площади пика внутреннего стандарта в кул ьтуральной жидкости, соответственно:

N1,, Йг,, Мз, и М« — отношение плоЩадей хроматографических пиков /3-фенилэтиламина, путресцина, кадаверина и гистамина к площади пика внутреннего стандарта в среде Вейнберга, соответственно, Кл.эдематиенс определяют при наличии в пробе Р --фенилэтиламина, путресцина, кадаверина и гистамина в следующих соотношениях;

М4, N2,N S,Nll — =- 40-100; — =1; — = 1; — =-1.

Мк гк %к нк

Кл,гистолитикум определяют при наличии в пробе Р -фенилэтиламина, путресцина, кадаверина и гистамина в следующих соотношениях: — =1; — = 60 — 300: — =5 — 15; — =1. 20

Ni N2,N NIl

NIl, N2g ЫИ NlIIK

Кл.септикум определяют при наличии в пробе Р -фенилэтиламина, путресцина, кадаверина и гистамина в следующих соотношениях:

Я(К2 J> N< — =1; — =-2 — 40; — =1-6; — =-1. "гк у ик

Введение в пробу внутреннего стандарта (1,6-диаминогексан) позволяет выражать . результаты через отношение площади пика конкретного амина к площади пика внут- 30 реннего стандарта и т.о. получать относительные количественные показатели содержания аминов в культуральных жидкостях клостридий.

Возможность учитывать различия меж- 35 ду видами не только качественные (наличие или отсутствие амина), но и количественные (содержание амина по отношению к внутреннему стандарту) повышает специфичность дифференциации видов. 40

Использование внутреннего стандарта, кроме того, позволяет улучшить другие характеристики метода: повышается точность определения за счет исключения ошибок, связанных с про- 45 боподготовкой, вводом пробы в хроматограф, нестабильностью рабочих условий хроматографии; упрощается анализ и обработка результатов за счет сокращения числа рассматри- 50

° ваемых информативных компонентов до четырех вместо 18-ти в прототипе.

Существенным отличием предлагаемого способа является применение высокоэффективной жидкостной xpoM3Tolðàôèè (БЭЖХ) для анализа аминов в культуральных жидкостях в целях дифференциальной диагностики видов возбудителей газовой гангрены.

Определение аминов как специфических метаболитов клостридий проводилось ранее методами газовой хроматографии (ГХ) или методами ГХ в сочетании с масс-спектрометрией, Цель работ состояла в выявлении спектра аминов, продуцируемых разными видами в среду культивирования.

Работы велись на качественном уровне.

Использование метода ВЭЖХ для анализа аминов в культуральных жидкостях позволяет в совокупности с остальными признаками повысить воспроиэводимость и специфичность определения клостридий.

На фиг.1 показана хроматограмма дансилпроизводных аминов среды Вейнберга, где 1 — j3 -фенилэтиламин, 2 — путресцин, 3 — кадаверин, 4 — гистамин, 5 — внутренний стандарт; на фиг.2 — хроматограмма дансилпроизводных аминов культуральной жидкости Кл.перфрингенс; на фиг.3 хроматограмма дансилпроизводных амин о в кул ьтурал ь ной жидкости Кл. эдематиенс; на фиг,4 — хроматограмма дансилпроиэводных аминов культуральной жидкости Кл.гистолитикум; на фиг.5 — хроматограмма дансилпроизводных аминов культуральной жидкости Кл.септикум.

Пример 1, Способ идентификации

Кл,перфрингенс осуществляется следующим образом.

Культуру инкубируют в среде Вейнберга. содержащей 1 глюкозы, под вазелиновым маслом при 37 С в течение 24 часов.

Культуральную жидкость центрифугируют 15 мин при 5000 об/мин.

К 1 мл центрифугата добавляют внутренний стандарт (1,6-диаминогексан) в количестве 5. 10 моль.

Осаждают белки 1 Н хлорной кислотой, взятой в отношении 1:2 к объему пробы.

Осадок белков отделяют центрифугированием 15 мин при 8000 об/мин. Центрифугат нейтрализуют насыщенным раствором углекислого калия до величины рН 7,0.

Осадок перхлоратов калия отделяют центрифугированием 10 мин при 8000 об/мин.

Получение дансилпроизводных аминов, К 0,5 мл центрифугата в темной склянке добавляют 30 мг сухого карбоната калия и 1 мл дансилхлорида в ацетоне (5 мгlмл). Сосуд завинчивают крышкой и термостатируют 30 мин при температуре 60 С.

Через 30 минут к реакционной смеси добавляют 10 мг пролина для связывания избытка реагента и термостатируют еще 10 мин при температуре 60 С. Отбирают 20 мкл и более реакционной смеси и вводят в хроматограф. Хроматографирук>т Ii 3 обрзщеннофазной колонке (С я.). ел о.ч;, "к, -ным

1824446 (по объему) раствором ацетонитрила в воде со скоростью 1 мл/мин.

Выход аминов с колонки регистрируют фотометрическим детектором на длине оолны 254 нм.

На хроматограммах (фиг. t — 5) идентифицируют пики Р -фенилэтиламина 1, путресцина 2, кадаверина 3 и гистамина 4 по временем удерживания, полученным для стандартных веществ и рассчитывают отношения площади пика каждого из аминов к площади пика внутреннего стандарта, которые обозначают как N1. Nz. Йз и N4, соответственно.

Параллельно проводят анализ среды

Вейнберга, результаты которого служат контролем. Для контроля характерно незначительное содержание всех четырех рассматриваемых аминов. Рассчитанные для контроля отношения площадей пиков /3фенилэтиламина. путресцина, кадаверина и гистамина к площади пика внутреннего

СтаНдарта. ОбОЗНаЧаЮт КаК И1к, Ига, Мза И

N4x

Данные экспериментов приоедены в таблице и на хроматограммах (фиг.1-5).

Кл.перфрингенс определяют при — -40 — 100 (P -фен илэтиламин 1) u —"Ni N

1 11К % а

=4-14 (гистамин 4), путресцин 2 и кадаверин

3 содержатся на урооне контроля (табл„ фиг.1 и 2).

Пример 2. Способ идентификации

Кл.эдематиенс осуществляется следующим образом.

Рост культуры и анализ культуральной жидкости выполняют о соответствии с условиями, приведенными в примере 1.

На хроматограммах идентифицируют пики аминов и рассчитывают отношения площадей этих пиков к площади пика внутреннего стандарта. Результаты сравнивают с контролем (средой культивирования).

Кл.эдематиенс определяют при

Ng

N к

=40-100 (P -фенилэтиламин 1), путресцин

2. кадаверин 3 и гистамин 4 содержатся на уровне контроля (табл., фиг.1 и 3).

Пример 3. Способ идентификации

Кл.гистолитикум осуществляется следующим образом.

Рост культуры и анализ культуральной жидкости выполняют в соответствии с условиями, приведенными в примере 1.

На хроматограмме идентифицируют пики аминов и рассчитывают отношения площадей этих пиков к площади пика внутреннего стандарта. Результаты сравнивают с контролем (средой культивирования).

t5

Кл.гистолитикум определяют при

Np

N g.

-60-300 (путресцин 2) и — - = 5-15 (кадавег

Nqg рин 3), Р -фенилэтиламин 1 и гистамин 4 содержатся на уровне контроля (табл,,фиг.1 и 4), Пример 4, Способ идентификации

Кл.септикум осуществляется следующим образовал, Рост культуры и анализ культуральной жидкости выполняют в соответствии с условиями, приведенными о примере 1.

На хроматограммах идентифицируют пики акулинов и рассчитывают отношения площадей пиков. Результаты сравнивают с контролем.

Nf

Кл.саптикугл определяют при — = 2-40 4 а (путресцин 2), кадаоерин 3 находится на уровне контроля или превышает его, но не более, чем о шесть раз — = 1-6, /3 -фени 1 3

N gg. лэтиламин 1 и гистамин 4 находятся на урооне контроля (таблица, фиг.1 и 5).

В предлагаемом способе по сравнению с прототипом подготовка пробы культуральной жидкости состоит из простых операций осаждения белков хлорной кислотой и окрашиоания аминов дансилхлоридом (5-N,Nдиметиламинонафталин-1, сульфохлорид).

Отсутствие стадии экстракции органическими растворителями нативных аминов исключает возможные потери вследствие высокой раствори1лости диаминоо в воде.

Дансиламины устойчивы о тсче11ие нескольких дней и обладают способностью флуоресцировать и поглощать ультрафиолетовые лучи на длине волны 254 нм, что делает возможным применение как флюоресцентного, так и фотометрического детектороо для регистрации аминов при хроматографии. Чувствительность метода (предел детектирования по поглощению со-11 ставляет и 10 моля; по флюоресценции на порядок и более оыше) позволяет анализировать реакционную смесь после дансилировани я непосредственно беэ предварительного концентрирования.

Упрощение операций, использование меньшего количест оо аминов для идентификации вида клостридий позволяет сократить время и повысить специфичность анализа.

Объем вводимой о хроматограф анализируемой пробы может колебаться от 1 до 100 мкл о зависимости от концентрации аминов.

Хроматография занимает 30 минут, Поскольку исход заболевания газовой гангреной оо многом зависит от своевременности и целенаправленности спсцифи1824446

Относительное содержание аминов в культуральных жидкостях клостридий после 24-часового роста на среде Вайнберга ческого лечения, жизненно важным является быстрое установление вида ведущего возбудителя, Недостатком большинства бактериологических и биохимических методов дифференциации видов является недостаточная специфичность и необходимость использования тестовых биологических материалов, требующих высокой исходной чистоты, а также контроля и обновления их в процессе хранения, подопытных животных, Предлагаемый метод обладает высокой специфичностью и достоверностью дифференции видов; не требует для выполнения диагностики специфического биологического тестового материала (ферментов, сывороток, индикаторных сред, диагностикумов, экспериментальных животных); реактивы универсальны и допускают длительное хранение; методика подготовки пробы к анализу, а также сам анализ, просты и хорошо воспроизводимы, могут быть легко стандартизованы и унифицированы.

Внедрение предлагаемого метода в практику бактериологических лабораторий дополнительно к традиционным методам будет способствовать повышению достовернОсти дифференциальной диагностики и сокращению времени анализа (теста).

Формула изобретения

1. Способ дифференциальной диагностики возбудителей газовой гангрены, включающий выращивание клостридий на мясном бульоне, получение производных аминов из культуральной жидкости, разделение их хроматографическим методом и определение по их содержанию вида клостридий, о т л и ч а ю щ и и С я тем, что, с целью повышения точности способа, в пробы культуральной жидкости и контрольной питательной среды вводят внутренний стандарт, осаждают белки хлорной кислотой, образовавшийся осадок центрифугируют, центрифугат обрабатывают раствором дансилхлорида в ацетоне, полученные производные аминов разделяют высокоэффективной жидкостной хроматографией и определяют вид клостридий по соотношению содержания аминов в культуральной жидкости и контрольной питательной среде.

5 2.Способпоп1,отличающийся тем, что в качестве внутреннего стандарта используют 1,6-диаминогексан.

3. Способ по п.1, о т л и ч.а ю шийся тем, что Cloctridlum perfrlngens определяют

10 при наличии в культуральной жидкости Рфенилэтиламина, путресцина, кадаверина и гистамина в следующих соотношениях: — 40-100; — -1; — 1; — =4 — 14, Ni, Na .Ns,йч и » Nz< йЗк

15 где N>, Nz, йз и N4 — отношение площадей хроматографических пиков P -ôåíèëýòèëýмина, путресцина, кадаверина и гистамина к площади пика внутреннего стандарта в среде культивирования соответственно.

20 Nix, Nz», йз» и й4к — отношение площадей хроматографических пиков Р -фенилэтиламина, путресцина, кадаверина и гистамина к площади пика внутреннего стандарта в контрольной питательной среде

25 соответственно.

4. Способ по п1, отличающийся тем, что Clostrlsium histolytlcum определяют при наличии в пробе Р-фенилэтиламина, путресцина, кадаверина и гистамина в сле30 дующих соотношениях: — =1; — =60-300: — -5-15; — 1, й4, йх йз йи й(к Ni» йз» йн»

5. Способ по п.1, о т л и ч à е щи и с я тем, что Ciostrldlum oedematlens определя35 ют при наличии в пробе р -фенилэтиламина, путресцина, кадаверина и гистамина в следующих соотношениях: — =40 — 100; — =1; — =1; — -1. й(. Nr, N5, .Nq

Nx Ns» йзк 4»

40 6.Способпоп1 отличающийся тем, что Clostrldlum septlcum определяют при наличии в пробе Р-фенилэтиламина, путресцина, кадаверина и гистамина при следующих соотношениях:

45 N< йа .йз . йч — 1; — =2 — 40; — =1 — 6; — 1. йН "4» N3< й/ 4

+ П р и м е ч а н и е: амины в контроле обозначены Йь, Й2к,Ng<, Й4к .

20 мин

1824446

Продолжение табл.

1824446

I0

20 мин

2С мин

1824446

20 нин

Вит. а

Фиг. 5.

Составитель Н.Титкова

Техред М.Моргентал Корректор А.Мотыль

Редактор

Заказ 2216 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035. Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина. 101