Штамм чумного микроба yersinia реsтis, используемый в качестве тест-объекта для определения строения и функции новой дополнительной плазмиды возбудителя чумы

 

Использование: биотехнология, медицинская микробиология, генетика микроорганизмов . Сущность изобретения: получение нового штамма-чумного микроба Yerslnla pestls, имеющего дополнительную плазмиду мол. м. 20 мДа. Штамм выделен от блох большой песчанки, отловленной в 120 км северо-восточнее поселка Баканас. Он имеет типичные для возбудителя чумы культурально-морфологические и другие свойства и может быть использован в качестве генетического зонда при идентификации и детекции штаммов возбудителя чумы, выделенных из различных природных очагов .

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)з С 12 N 1/20

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНЧЪ. вМИ6 (21) 5008385/13 (22) 14.08.91 (46) 30.06.93. Бюл, М 24 (71) Среднеазиатский научно-исследовательский противочумный институт (72) И.Л.Мартиневский, В.М.Степанов.

Л.Е.Некрасова, О.А.Проценко, А,А.Филиппов, О.П.Плотников и Н.С. Солодовников (73) И.Л.Мартиневский (54) ШТАММ ЧУМНОГО МИКРОБА

YERSINIA PESTIS. ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ В КАЧЕСТВЕ ТЕСТ-ОБЪЕКТА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТРОЕНИЯ И ФУНКЦИИ НОВОЙ

ДОПОЛНИТЕЛЬНОЙ ПЛАЗМИДЫ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧУМЫ

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицинской и научно-исследовательской микробиологии.

Штамм чумного микроба Yersinla pestls

А-1567 выделен от блох большой песчанки, отловленной в 120 км северо-восточнее поселка Баканас, Штамм получают прямым по-. севом биологического материала на агаровые пластинки среды Хоттингера при

28 С. На вторые сутки инкубации отмечается типичный рост возбудителя чумы.

Штамм А-1567 характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки: штамм А-1567 имеет типичные для возбудителя чумы культурально-морфологические и другие свойства, Он растет в Я-форме на обычных питательных средах (бульон и агар Хоттингера, среда Мартена, обычный питательный агар, среда Эндо, дрожжевая среда, гидролиэаты каэеина и желатина).

„5U 1825375 А3 (57) Использование: биотехнология, медицинская микробиология, генетика микроорганизмов, Сущность изобретения: получение нового штамма-чумного микроба

YersInla pestls, имеющего дополнительную плаэмиду мол. м. 20 мДа. Штамм выделен or блох большой песчанки, отловленной в 120 км северо-восточнее поселка Баканас. Он имеет типичные для возбудителя чумы культурально-морфологические и другие свойства и может быть использован в качестве генетического зонда при идентификации и детекции штэммов возбудителя чумы, выделенных из различных природных очагов, Диаметр колоний при изолированном росте на среде Хоттингерв нэ 2-3 сутки 2-3 мм. на пятые — 2-8 мм(при 28 С выращивания), Оптимальная температура роста 2728 С, минимальная (еле заметный рост нэ 3 сутки) — + 2ОС, максимальная — +40 С. На среде Джексона-Берроуза растет в виде популяций, состоящих из пигментировэнных (pgm+) колоний. Нэ жидких питательных средах характер роста типичен для чумного микроба. В мазках выявляются грамотрицательные биполярные палочки.

Питательные потребности штамма.

Штамм растет при 28 С на среде следующего состава, гlл: глюкоза 3;,двузамещенный фосфорнокислый калий 7; однозамещенный фосфорнокислый калий 2; цитрат натрия

0,5; сернокислэя магнезия 0,1; сульфит натрия 0.5; цистеин 0,05; фенилаланин 0,05; метионин 0,05; треонин 0,05 (аминокислоты в L- u DL-форме), дистиллированная вода 1

1825375

Формула изобретения

Штамм чумного микроба Yersihia Pestls

КМ-939, используемый в качестве тест-объекта для определения строения и функции новой дополнительной плазмиды возбудителя чумы.

Составитель M. Серова

Техред M. Моргентал Корректор Л, Ливринц

Редактор

Заказ 2232 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул,Гагарина, l01 л (e случае приготовления плотных питательных сред добавляют 30 г агар-агара).

Физиолого-биохимические признаки.

Ферментирует с образованием кислоты беэ газа глюкозу, мальтозу, маннит, арабинозу, маннозу, ксилозу, глицерин. Не ферметирует лак1озу, сахарозу, рамнозу. дульцит, эритрит, мелибйоэу целлобинозу, Дает отрицательные реакции денитрификации и нитрификации, Имеет Р-галактозидазу. Реакция Фогес-Проскауэра положительная.

Не имеет фсрмента уреазы, оксидазы, редуктазы тетратионата, амилазы, декарбоксилазы лизина и дегидролазы аргинина.

Желатин не разжижает, не расщепляет малоната и тартрата натрия. Кальцийзависимый. На среде Хигучи-Смита мутирует в кальцийнезависимые клетки(Са ) с низкой частотой (2-8 х 10 — 7 — 8 х 10 ).

Отношение к гомо- и гетерологичным штаммам, Высокочувствителен к диагностическим чумному и псевдотуберкулезному фагам и фагу Л-413 "С", Отношение штамма к видовым диагностическим сывороткам. Аглютинируется противочумной сывороткой в титре 1: 1200.

Антигенные свойства штамма, Обладает антигенами fra, Ina, Тох.

Чувствительность к антибиотикам. Высокочувствителен к стрептомицину, рифампицину, гентамицину, пенициллину, мономицину, тетрациклину, хлорамфериколу, хлортетрациклину, Генетические особенности штамма, Штамм ауксотрофен. Имеет обычные для возбудителя чумы плазмиды pPst, pCad (pVlr), pFra Тох и дополнительную плазмиду мол. м. 20 мДа.

Вирулентные свойства. Штамм А-1567 высоковирулентен для лабораторных животных — морские свинки погибают от 10, а з белые мыши — от 10 микробных клеток при

2 подкожном методе заражения.

Условия хранения. Штамм хранится в запаянных пробирках на косячках среды

Хоттингера в холодильнике (3-10 С).

Условия выявления продуктов жизнедеятельности штамма. Для выявления токсина и антигенной фракции 1 может быть использована среда Хоттингера (температура инкубации — 37 С), Для выявления пигментсорбции используют среду Джексона-Бзрроуэа в обычной прописи.

il ри м е р. Культуру штамма и кишечной палочки выращивали в течение суток на агаре Хоттингера (рН 7,2), затем снимали клетки с площади 1 см и суспендировали в

200 мл буфера, содержащего 50 мМ Триса, 2,5 додецилсульфата натрия и NaOH (до рН 12,5). Образцы помещают в водяную баню при 68 С на 30 мин. Добавляют равный объем смеси фенол-хлороформ (1: 1) и тщательно перемешивают. Центрифугируют в течение 5 мин при 15 тыс. об/мин. Водяную фазу смешивают с 1/10 объема буфера и наносят в лунки 0,6 О/,-ного агарозного геля.

Электрофорез проводят в горизонтальных пластинах геля в буфере ТВЕ: 69 мМ триса, 89 мМ НзВОз, 2,5 MM Naz — ЗДТА. Постоянное напряжение 100 В, продолжительность электрофореза 3,5 ч. В качестве маркеров мол. м, используют плазмиды Е.coll: pCRI (7,5 мДа), pRK290 (13мДа), pSa (23 мДа), R6K (26 мДа), RP4 (37 мДа). В результате эксперимента выявляют наличие дополнительной плазмиды у штамма А-1567. Мол. м, плазмиды составляет 20 мДа, Таким образом, новый штамм возбудителя чумы, содержащий дополнительную плазмиду мол. м, 20 мДа, может быть использован в качестве генетического зонда при идентификации и детекции штаммов возбудителя чумы, выделенных из различных природных очагов.