Способ получения днк, кодирующей гормон роста лосося, способ конст-ния промежуточной рекомбинантной плазмидной днк, содержащей днк-фрагмент, кодирующий гормон роста лосося, для получения плазмид ps gh1, ps gh3, ps gh9, ps gh10, ps gh14 и ps gh17, способ получения реком-ной плазмидной днк ps gh1b2, кодирующей гормон роста лосося, способ получения реком-ной плазмидной днк psgh ii с2, кодирующей гормон роста лосося, способ получения реком-ного гормона роста лосося
Изобретение относится к генетической инженерии и касается получения кДНК, кодирующей гормон роста рыбы, получение рекомбинантных плазмидных ДНК, кодирующих данный гормон, а также способа получения полипептидного гормона роста рыб с использованием микроорганизма. Сущность изобретения; информационную РНК извлекают из гипофиза лосося, после чего синтезируют ДНК, комплементарную иРНК (кДНК). Получают пробу ДНК, соответствующую последовательности аминокислот. NIKON ца гормона роста лосося, после чего клонируют ген гормона роста лосося путем отбора кДНК, которая гибридизуется с пробой ДНК, и определяют последовательность оснований ДНК. Описана экспрессия и накопление в питательной среде гормона роста лосося в результате культивирования микроорганизма, содержащего рекомбинантнуюплазмидную ДНК, в которую введена кДНК, кодирующая гормон роста лосося. 4 з. п. ф-лы. Ј
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК (я)з С 12 N 15/18, 15/70
ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ
ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ (21) 3913602/13 (22) 28.06.85 (46) 30.06.93, Бюл, М 24 (31) 134536: 213361: 50096 (32) 29.06.84: 12.10,84; 13.03.85 (33) JP (71) Киова Хакко Когио Ко, ЛТД JP) (72) Сусуму Секина, Тамио Мазуками, Мориюки Сато, Сейга Итох и Акико Сайто (J P) (56) Jarmer и др. Gen Comp. Endocrln, 1976
30, 91.
S.W.Termer et а1. Endocrinology, 1981
108, 377, А.F.Cook и др, Gen Comp Endocrim, 1983
50, 335. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДНК, КОДИРУЮЩЕЙ ГОРМОН РОСТА ЛОСОСЯ, СПОСОБ
КОНСТРУИРОВАНИЯ ПРОМЕЖУТОЧНОЙ
РЕКОМБИНАНТНОЙ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК, СОДЕРЖАЩЕЙ ДНК-ФРАГМЕНТ, КОДИРУЮЩИЙ ГОРМОН РОСТА ЛОСОСЯ, ДЛЯ
ПОЛУЧЕНИЯ ПЛАЗМИД PS GH1, PS GH9, PS GH10, PS GH14 И PS GH17, СПОСОБ
ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК PS GH1B2, КОДИРУЩЕЙ
ГОРМОН РОСТА ЛОСОСЯ, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ПЛАЗМИДИзобретение относится к генетической инженерии и касается получения ДНК, кодирующей гормон роста рыб, получения рекомбинантных ДНК, кодирующих данных гормон, а также способа получения полипептидного гормона роста рыб с использованием микроорганизма.
Сущность изобретения состоит в следующем.
Полную PHK получают из гипофиза лосося (Qmorhynchus Keta) и пропускают через колонку, заполненную олиго (AT) целлюло,, . Ы,, 1825376 А3
НОЙ ДНК PS GHIIC2, КОДИРУЮЩЕЙ ГОРМОН РОСТА ЛОСОСЯ, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ГОРМОНА
РОСТА ЛОСОСЯ (57) Изобретение относится к генетической инженерии и касается получения кДНК, кодирующей гормон роста рыбы. получение рекомбинантных плаэмидных ДНК, кодирующих данный гормон, в также способа получения полипептидного гормона роста рыб с использованием микроорганизма. Сущность изобретения; информационную PHK извлекают иэ гипофиэа лосося, после чего синтезируют ДНК, комплементарную иРНК (кДНК). Получают пробу ДНК, соответствующую последовательности аминокислот. Nконца гормона роста лосося, после чего клонируют ген гормона роста лосося путем отбора кДНК, которая гибридизуется с пробой ДНК, и определяют последовательность оснований ДНК. Описана экспрессия и накопление в питательной среде гормона роста лосося в результате культивирования микроорганизма, содержащего рекомбинантную плаэмидную ДН К, в которую введена кДНК, кодирующая гормон роста лосося.
4 з. и. ф-лы. зой, для выделения РНК, имеющую полиаденилировую кислоту (поли (А) PHK). Двунитевую ДНК, используя поли (А) РНК в качестве матрицы и ревертазы. Рекомбинантную ДНК синтезируют, используя ln
vitro технологию рекомбинантной ДНК, вставляя синтезированную ДНК в векторную ДНК, трансформируют полученными
ДНК штамм Escherlchla coll.
Ниже подробно поясняется способ получения ДНК и рекомбинантной ДНК изобретения.
1825376
У пойманных лососей удаляют гипофиз, который сразу же замораживают в жидком азоте, К замороженному гипофизу добавляют тиоцианат гуанидина, после чего гипофиэ размельчают и солюбилиэуют, Затем солюбилизованный гипофиз помещают в слой раствора CSCI и подвергают ультрацентрифугированию для получения в качеств осадка полной цитоплаэмической
РНК, Или же к солюбилизованному материалу добавляют в месте с тиоцианатом гуанидина LICI для выделения в качестве осадка только РНК.
Выделенную PHK растворяют в изотоническом растворе NBCI или KCI (например, 0,5 моля) и пропускают через колонку, заполненную олиго (дТ) целлюлозой, с адсорбированием в колонке иРНК, имеющей полиаденилированную кислоту (поли (А)), Вымывание проводят водой или гипотоническим солевым раствором, например 10 мМ буферной смеси (трис-HCI) c выделением иРНК, имеющей поли (А).
Синтезируют векторную затравку, Вектор, например, рСОИ, обрабатывают Kpn I в соответствующем растворе, например, растворе, содержащем буфер трис-НCI (например, рН 7.5, 10 мМ), MgCI2 (например, 6 мМ), NaCI (íàïðèìåð, 10 мМ). для удаления
pC0VI на участке Kpnl. ДНК инкубируют с концевой дезоксинуклеотидилтрансфераэой при подходящей температуре (например, 37 С) в течение подходящего периода (например, 20 мин) в растворе, содержащем буфер трис-HCI (например, рН 6,8, 30 мМ), кокодилат натрия (например, 140 мМ), CoClz (например, 1 мМ), дитиотреитол (например, 0,1 MM), дТТФ (например, 0,25 MM) для присоединения около 60 остатков тимидина на обоих 3 -концах векторной ДНК. Затем ДНК обрабатывают в растворе, содержащем буфер трис-HCI (например, рН 7,5; 10 MM), MgClq (например, 6 мМ), NaCI (например, 100 мМ). Раствор фракционируют с помощью низкотемпературного гелевого электрофореза на геле агарозы (в дальнейшем сокращено называемом методом НТТ) с целью выделения фрагментов ДНК примерно в 3,1 кВ. Затем ДНК растворяют в гипертоническом растворе NaCI или KCI (например, 0,5 М) и пропускают через колонку, заполненную поли (дА) целлюлозой с адсорбированием в колонке только молекул векторной затравки, имеющей поли (Т), Вымывание проводят водой или гипотоническим солевым раствором, например буфером трис-HCI, для выделения молекул только векторной затравки с поли (Т).
Затем синтезируют связующую ДНК.
Например, pLI ДНК обрабатывают Pstl в подходящем растворе например, растворе, содержащем буфер трис-HCI (например, рН
7,5; 10 MM), МдС1р (например, 6 мМ), NaCI (например, 50 мМ) для удаления pL1 на участке pstl, Затем ДНК обрабатывают так же, как при синтезе векторной затравки, эа тем исключением. что вместо дТТФ добавляют дСТФ и вводят примерно 15 цепей олиго (дГ). Обрабатывают ДНК с помощью Hind Ill в подходящем растворе, например, растворе, содержащем буфер трис-Н С1(например, рН 7,5; 10 мМ), МдС! (например, 6 мМ), NaCI (например. 60 мМ). Фрагмент ДНК примерно в 0,5 кВ фракционируют электрофорезом на геле агароэы и выделяют на ЕАЕ-бумаге.
Тем самым получают связующую ДНК.
Полученные поли (А) РНК, векторную затравку и связующую ДНК используют для синтеза кДНК, который заключается в сле20 дующем, Поли (А) PHK и векторную затравочную ДНК вводят в реакцию с ревертазой при подходящей температуре (например, 37 С) и в течение подходящего периода времени (например, 40 мин) в растворе, содержащем буфер трис-HCI (например, рН 8,3;
50 MV), MgCI2 (например, 8 мМ), КС! (например, 30 мМ) дитиотреитол (например, 0,3 мМ), дАТФ, дТТФ, дЦТФ и дГТФ (например, каждого по 2 мМ). Примерно 15 олиго30 (дЦ)-цепей присоединяют к 3 -концам полученной РН К-ДН К двойной нити в тех же условиях, что и в случае присоединения (дТ)цепей к векторной затравке. за исключением того, что вместо дТТФ применяют дЦТФ.
35 В подходящем растворе, содержащем буфер трис-НС1 (например, рН 75; 10 мМ), MgClq (например, 6 мМ), NaCI (например, 60
MM), ДНК обрабатывают Hind III. Ранее полученную связующую ДНК смешивают с ДНК
40 и приготовленную смесь инкубируют ДНКлигазой Е.coll при подходящей температуре (например, 12 С) в течение подходящего периода времени (например, 16 ч) в растворе, содержащем буфер трис-HCI (например, рН
45 7,5; 20 мМ), МдС!р (например,,4 мМ), (NH<)ISO< (например, 10 мМ), KCI (например, 0,1 MM) и Р-никотинамидадениндинуклеозид (j3-НАД) (например, 0,1 мМ) для приготовления кольца кДНК и связующей
50 ДНК. К реакционному раствору добавляют
40 мкМ (конечная концентрация) каждого: дАТФ, дТТФ, дГТФ м дЦТФ, Для замещения PHK-части ДНК и получения рекомбинантной плазмиды, содержащей
55 двунитевую кДНК, добавляют ДК-лигаэу, ДНК-полимеразу 1 и рибонуклеазу Н.
E scherichia coll.
Штамм Escherlchla coll, например, ЕзсЬerlchia соИ с 600 SFB, трансформируют
1825376
55 тельнее 7-8), 2-20, предпочтительнее 5 — 10 мМ М9О2, 0,1-10 мМ, предпочтительнее
0,5-2 мМ, АТФ и 1-50 мМ, предпсчтительс помощью полученной рекомбинантной плаэмиды. Поскольку в укаэанной плаэмиде имеется ген устойчивости к ампициллину, трансформант Escherlchla coll также устойчив к амплициллину, Отбор штамма микроорганизма, несущего новую рекомбинантную плазмидную
ДНК с геном, комплементарным иРНК гормона роста рыб, из устойчивых к ампициллину (Ап) проводят следующим образом.
Полученный трансформант фиксируют на фильтре иэ нитроцеллюлоэы и с ним гибридизируют искусственную пробу, имеющую
ДНК-последовательность, которая была задана последовательностью аминокислот известного полипептидного роста лосося, с целью отбора трансформанта, проявляющего повышенную гибридизацию. Пробу ДНК синтезируют обычным триэфирным методом. Рекомбинантную плазмиду, комплементарную иРНК гормона роста лосося, идентифицируют вышеуказанным методом.
Полученными таким способом рекомбинантными плазмидами являются pS GH1 и
pSGH14, Плаэмиды используют в качестве источника ДНК, кодирующей гормон роста лосося.
Способ получения полипептидного гормона роста лосося экспрессией ДНК, кодирующей гормон лосося, в микроорганизме состоит в следующем;
ДНК, кодирующую гормон роста лосося, отсекают от плаэмиды, несущей ДНК, и вставляют в векторную ДНК. Полученной рекомбинантной ДНК трансформируют микроорганизм и трансформант культивируют с целью накопления в питательной среде полипептидного гормона роста лосося. Затем из культуры выделяют гормон роста лосося, Примерами плазмид, содержащих ДНК, кодирующую гормон роста лосося, являются плазмиды pSGHCI и pSGH14, Применяют векторные ДНК, в которые встраивают чужеродную ДНК в рамке считывания от подходящего промотора, например, тгр-промотора, вас-промотора или
Pz-промотора, и длину между последовательностью Шайн-Дальгарно(далее обозначается как последовательность ЩД) и инициирующим кодоном (АТГ) устанавливают, например, в 6-18 основных пар, Предпочтительно использование векторной ДНК вЂ” pGELI.
Рекомбинацию ДНК, кодирующей полипептид, и векторной ДНК осуществляют общеизвестными и р 1емами.
Получают Mboll-5 з!! фрагмент, кодирующий гормон роста лосося, Sall-BamHI фрагмент, а также н им ill- Вал Н! фрагмент
40 плаэмиды pGELI, содержащий триптофвновый промотор. Искусственную линкерную
ДНК получают по приведенной схеме
Hind И кап
5 АССТТАТСАТАСАААААС ГЗ
Э ATACTATCTTТТТ 5
Met I1е 01а А Sn р З.
Фрагменты ДНК и линкерную ДНК сшивают с помощью Т4-ДНК-лигаэы получают рекомбинантную плазмиду pSGH1B2, которая кодирует зрелый гормон роста лосося.
Из pSGH1 отдельно получают Mbo IIPVU И фрагмент, кодирудющий область вблизи N-конца зрелого пептида гормона роста лосося, и РЧО II-Hind II фрагмент, содержащий оставшуюся кДНК и векторную часть. С другой стороны линкерную ДНК получают по приведенной схеме.
Нind П кап
5 (АССТТАТССААААС 3
3 .АТАССТТТТ 5
Met GtU А5й
Фрагменты ДНК и линкерную ДНК связывают с помощью Т4-ДН К-лигаэы и получают рекомбинантную плаэмиду pSGH11B9.
Затем иэ плазмиды pSGH11B9 получают
Hind III-Bam Hl фрагмент, содержащий зрелый пептид гормона роста лосося, а из рСЕ1! получают Hind III-Bam HI фрагмент, содержащий триптофановый промотор. Оба фрагмента связывают с помощью Т4-ДНКлигазы для получения плазмиды pSGH11C2.
Обработку ДНК ресктриктазами прово-. - дят следующим образом: 0,1-2 мг ДНК с
0,1-100 единицами, предпочтительно с 1-3 единицами рестриктазы на 1 мг ДНК в смеси
2 — 200 мМ; предпочтительно 10 — 40 мМ, трисHCI (рН 6-99,5, предпочтительно рН 7 — 8), О- 00 мМ NaO и 2-30 мМ, предпочтительнее 5-10 мМ, MgCI2 при 20-70 С (оптимальная температура зависит от применяемого ограничивающего фермента) от 15 мин до
24 ч. Прекращают реакцию обычно нагреванием до 55-75 С в течение 5 — 30 мин или же инактивацией фермента с помощью такого реагента, как фенол или диэтилпирокарбонат.
Очистку фрагментов ДНК, образующихся в результате гидролиэа рестриктазами, проводят методом НТГ или электрофорезом на полиакриламидном геле.
Связывание фрагментов Д Н К и роводят с помощью Т4-ДН-лигазы (0,3-10 единиц) в смеси 2-200 мМ, предпочтительнее
10-40 мМ, трис-НО (рН 6,1 — 9,5, предпочти1825376
55 нее 5-10 мМ, дитиотреитола при 1-37 С, предпочтительнее при 3 — 20 С, от 15 мин до
72 ч, предпочтительнее в течение 2-20 ч.
Полученную рекомбинантную плазмиду
ДНК вводят вб Escherlchla coll.
Выделение рекомбинантной плазмидной ДН К E scerichia coil осуществляют мето,дом, описанным в примере 1, Плазмиду ДНК гидролизуют 1 — 10 аидами эндонуклеаз, места расщепления изучают с помощью электрофореза на геле агарозы или на полиакрилоамидном геле. В случае необходимости, последовательность оснований ДНК определяют методом
Makam-Gilbert или методом Sanger.
Штамм Escericha со!! К-12 НВ101 трансформируют с помощью плазмид pSGH11C2 и pSGH1B2, после чего штамм Escherichia соИ, несущий pSGH11C2 или pSGH182, отбирают из устойчивых к ампициллину колоний. Штамм Escherichia coli, несущий
pSGH1B2 или pSGH11C2, культивируют в питательной среде с получением а клетках культуры полипептидного гормона роста рыб.
В качестве питательной среды используют искусственную или естественную среду, если только она подходит для выращивания Escherichla cali или для производства полипептидного гормона роста, рыб.
В качестве источника углерода используют глуюкозу, фруктозу, глицерин, маннит, сорбит и т. д.
В качестве источника азота используют
NH4CI, (NH4)2S04, казаминокислоты, дрожжевой экстракт, полипептон, мясной экстракт, бактотриптон, зерновой экстракт и т. д
Кроме того, используют питательные вещества как KzHP04, KHzPOq, NaCI, МАЗО !, витамин В1 и MgClz, Культивирование проводят при рН 5,58,5 и.18 — 40 С при аэрации и перемешивании.
В результате культивирования в течение 5 — 90 ч в культуральных клетках накапливается полипептидный гормон роста лосося. Собранные клетки обрабатывают лизозимом, разрушают неоднократным замораживанием и оттаиванием и подвергают центрифугированию. Полученную таким образом надосэдочную жидкость подвергают экстрагированию обычным методом экстракции полипептидов с целью их выделения.
Детектирование полипептида проводят растворением при нагревании в буфере
Saelmmli и действием НДС на полиакриламидном геле и окрашиванием реактивов
Coomassle Brilliant голубым.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. 2 r замороженного гипофиза лосося (от 30 особей) разрушают и гомогенизируют в 10 мл раствора, содержащего 4 M тиоцианатэгуанидина, 0,5 саркозила, 5 мМ цитрита натрия (рН 7) и 0,1 М В-меркаптоэтанола. Гомогенат пропускают через инжектор на 18 G и помещают в слой 5,7 М CSCI и 0,6 М ЭДТА (рН 8) по
1,2 мл каждого раствора в ул ьтрацентрифужных пробирках. PHK осаждают центрифугированием при 35000 об/мин в течение
15 ч, Осадок PHK растворяют в растворе трис-HCI (10 мл, рН 8), содержащем 1 мМ
ЭДТА, экстрагируют смесью фенол: хлороформ и осаждают этанолом. 1 мг полученной
PHK растворяют в 1 мл 10 MM трис-HCI (рН
8) и 1 мМ ЭДТА, инкубируют при 65 С в течение 5 мин, добавляют 1 мл 5 М NaCI.
Смесь хроматографируют на олиго-дТ целлюлозе (производство P-L Biochemicals объем колонки 0,5 мл). Абсорбированную на колонке РНК, содержащую поли (А), вымывают раствором 10 мМ трис-НС! (рН 7,5) и 1
MM ЭДТА, порциями по 0,2 мл с получением примерно 10 мг иРНК (3 — 5 фракции).
Пример 2, Синтез кДНК и конструирование рекомбинантной плазмиды.
400 мкг ДНК плазмиды pCDVI добавля.-. ют к 300 мл раствора, содержащего 10 MM трис-НС! (рН 7,5), 6 мМ MgClz и 10 мМ NaCI, и затем 500 единиц Крп! (производство
Takava shuzo Со, все использованные ферменты являются продуктом Takava shuzo Со, если нет особых указаний добавляют. Реакцию проводят при 37 С 6 ч. После эктрагирования смесью фенол; хлороформ ДНК осаждают этанолом.
200 мг ДНК, гидролизованной рестриктазой Kpnl; добавляют к 200 мл раствора, приготовленного добавлением 0,25 мМ дТТР к буферу (далее упоминаемого просто как буфер) содержащему 40 мМ какодилата натрия,30 мМ трис-НС!(рН 6,80), 1 мМ CaCIz
« 0,1 мМ дитиотреитола (далее обозначаемого как ДТТ), Затем добавляют 81 единицу концевой дезоксинуклеотидилтрансферэзы (далее обозначаемой КаК КдТ) и реакцию ведут 11 мин при 37 С, Таким образом, к 3 концам рСОИ, расщепленной с помощью
Kpnl, присоединяют около 67 поли (дТ) цепей. Экстрагируют смесью фенола с хлороформам, из раствора выделяют в результате осаждения этанолом примерно 100 мкг рСОИ ДНК, связанной с поли (дТ) цепями.
Полученную ДНК добавляют к 150 мл буфера, содержащего 10 MM трис-HCI (рН 7,5), 6 мМ MgClgи 100 мМ NaCI. Затем добавляют
1825376
10
100 единиц ECORI и в течение 2 ч при 37 С проводят реакцию. Продукт реакции подвергают НТГ для получения фрагмента ДНК примерно в 3,1 кВ, который представляет собой примерно 60 мкг pCDVI с поли (дТ) цепями. Полученную ДНК растворяют в 500 мл раствора. содержащего 10 мМ трис-НС! (рН 8) и 1 мМ ЭДТА. Приготовленный раствор инкубируют 5 мин при 65 С, после чего при охлаждении льдом добавляют 50 мл 5 M раствора NaCI. Полученную смесь подвергают колоночной хроматографии на олиго (дА) целлюлозе с адсорбированием на колонке
QHK, имеющей достаточное количество поли (дТ)-цепей, Вымывание проводят раствором, содержащим 10 мМ трис-НС! (рН 8) и
1 1М ЭДТА, с получением 27 мкг рСОИ с поли (дТ) цепями (далее называемый векторной заправкой).
Затем описанным способом получают линкерную ДН К.
Примерно 14 мкг pLI добавляют к 200 мл буфера, содержащего мМ трис-НС! (рН 7,7), 6 мМ МцС!2 и 50 MM NaCI. Затем добавляют
50 единиц Pstl и для отсечения pLI ДНК в области Pstl 4 ч при 37 С ведут реакцию.
Продукт реакции подвергают экстрагированию смесью фенола с хлороформом и осаждению этанолом с получением 13 мкг р
ДНК, усеченной в Pstl-области. Примерно
13 мкг полученной ДНК добавляют к 50 мл
КдТ буферу, содержащему 0,25 мМ (конечная концентрация) дГТФ. Затем добавляют
54 единицы КдТ и инкубируют 13 мин при
37 С с присоединением примерно 14 (дГ) цепей у С -концах pLI, усеченной с помощью
Pstl. Выделяют ДН К экстрагированием смесью фенола с хлороформом и осаждением этанолом. Полученную ДНК добавляют к
100 мл буфера, содержащего 10 мМ трисHCI (pH 75), 6 MM Mg Clz и 60 MM NaCI. Затем добавляют 80 единиц Hind III и инкубируют
3 ч при 37 С с целью удаления pLI ДНК в
Hind II-области, Продукт реакции фракционируют электрофорезом на геле агарозы, после чего выделяют фрагмент ДНК примерно в 0,5 кВ, используя метод с ЕАЕ-.бумагой, Полученная ДНК является связующей ДНК с олиго (дГ) цепями (далее называемая связывающей ДН К).
Примерно 2 мкг поли (А) РНК и примерно 1,4 мкг векторной затравки, полученной указанным способом, растворяют в 22,3 мл раствора, содержащего 50 мМ трис-HCI (рН
8,3), 8 MM Mg С!2, 30 MM KCI, 0,3 мМ ДТТ, 2 мМ дНТФ (дАТФ, ДТТФ, дГТФ и дЦТФ) и 10 единиц рибонуклеазного ингибитора. 3атем добавляют 10 единиц релертазы и инкубируют 40 мин при 37 С с целью получения
ДНК, комплементлрной РНК. Продукт реак20
55 ции экстрагируют смесью фенола с хлороформом и осаждают этанолом с выделением векторэ-затравки ДНК, связанной с двойной нитью PHK-ДНК. ДНК растворяют в 20 мл КдТ-буфера, содержащего 66 мкМ дЦТФ и 0,2 мкг поли (А). Затем добавляют четырнадцать единиц КдТ и е течение 8 мин при
37 С проводят инкубирование с присоединением к 3 -кольцам кДНК 12 (дЦ)-цепей.
Продукт реакции подвергают экстракции смесью фенола с хлороформом и осаждению этанолом с выделением кДНК-векторазатравки ДНК. связанной с (дЦ) цепями, Полученную ДНК растворяют в 400 мл раствора, содержащего 10 мМ трис-HCI (рН 7,5)
6 мМ MgClz и 60 мМ NaCI. Добавляют 20 единиц Hind III и инкубируют 2 ч при 37 С с отсечением ДНК в Hind-ill-области. Продукт реакции экстрагируют смесью фенола с хлороформом и осаждают этанолом с получением 0,5 пмоля кДНК-вектора-затравки ДНК, связанной с (дЦ) цепями. Затем 0,08 пмоля
ДНК и 0,16 пмоля упомянутой связующей
ДНК добавляют к 40 мл раствора. содержащего 10 мМ трис-НС! (рН 7,5), 0,1 М NaCI u
1 мМ ЭДТА, и инкубируют при 65 C. 42 С и
0 С в течение соответственно 10. 25 и 30 мин. Реакционный раствор доводят до 400 мл (полный объем) раствора. содержащего
20 мМ трис-НС! (рН 7,5) 4 мМ MgClz, 10 мМ (NH4)2SO4, 0,1 M KCI и 0,1 мМ р-НАД. К реакционному раствору добавляют 10 единиц ДНК-лигазы Escherlchla coll è инкубируют в течение 1 сут при 11 С. Реакционный раствор доводят до раствора, содержащего
40 мкМ дНТФ и 0,15 мкМ /3-НАД. Затем добавляют пять единиц ДНК-лигазы
Esherlchia coll, 2 единицы рибонуклеазы Н
Escherichia coll è 7 единиц ДН К-полимеразы
1 Eschtricla coll и инкубируют сначала 1 ч при 12 С и затем еще 1 ч при 25 С. Приведенной реакцией осуществляют циклиэацию рекомбинантной ДНК, содержащей кДН К, и ричем часть двуните вой P Н К-ДН К замещается ДНК, в результате чего образуется рекомбинантная плазмида, содержащая полную двунитевую ДНК, Пример 3. Escherichia coll 600JF8 трансформируют, используя рекомбинантную плазмиду, полученную в примере 2.
Среди примерно 10000 колоний, полученных по этой методике, 4800 колоний закрепилисв на нитроцеллюлозе. Отбирают восемь штаммов, накрепко гибридизирующихся при 40 С с пробой, причем Дi i К соответствует последовательности аминокислот от 23-ей и до 28-ой, начиная от N-конца гормона роста лосося, а именно
1 23456789 10 11 12 13 14 15 16 17
1825376
5 -А AAATG Т ТТА А C G А С ТТ (G) (С) (Т) (T) (3-е основание является А или С, 9-е — Т или С, 12-е — С или Т, 15-е — С или Т, и комбинацией укаэанных оснований получают 16 видов искусственных ДНК) помечают
Р, Методом Southern подтверждают, что 8 штаммов гибридизуются с упомянутой пробой, и искусственная ДНК-проба соответствует последовательности аминокислот вокруг С-конца:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
CACAAAGTAGAGAC (Т) (6) (Т) А () (С) (3-е основание является С или Т, 6-е — А или С, 9-е — А, Т, С или С, 12-е — С или А и комбинация оснований дает 32 года искусственных ДНК). Плазмиды, названные соответственно pSGHI, 3, 6, 8, 9, 10, 14 и 17 имеют ДН К-последовательность, заданную последовательностью аминокислот в известном гармоне роста лосося и, как полагают, содержат кДНК гормона роста, Пример 4. 8 плазмид, полученных указанным способом, гидролизуют различными эндонуклеазами, после чего определяют карты расщепления частей кДНК.
Плазмиды разбивают на три группы, а именно группу pSGH1, 6, 9, 10 и 17, группу pSGH3 и группу pSGH8 и 14 исходя из положения участков ограничивающей эндонуклеаэы, Полную последовательность нуклеотидов трансляционной области плазмид, которые хорошо гибридизуются с пробой искусственной ДНК (см, пример 3) и которые, как полагают, содержат почти полную кДНК, в особенности pSGH1, определяют по методу Sanger с использованием М13фага. Основания под номерами 1-66 кодируют сигнальный пептид, а 67 — 630 кодируют зрелый полипептид гормона роста лосося, Плаэмиды pSGH8 и pSGH14 отличаются друг от друга следующим образом, pSGH14 содержит более длинную кДНК почти полной длины. Последовательность основания а pSGH14 определяют по методу Sanger, используя М13-фаг.
Основания 1 — 66 кодируют сигнальный пептид, а под номерами 67-630 кодируют зрелый полипептид гормона роста лосося.
Полипептид, закодированный кДНК, полностью совпадает с полипептидом, закодированным с помощью pSGH1 в 22 аминокислотах сигнального пептида, но различается 12 аминокислотами зрелого пептида иэ 188 аминокислот. Далее, если речь идет о последовательности N-концевых 40 аминокислот, определенной в полипептидном гормоне роста лосося, то 5 аминокислот в ней явно отличны. Таким образом, считают, что кДНК, содержащаяся а
pSGH14, кодирует гормон роста рыб, отличный от pSGH1.
Пример 5. 5 мкг плазмиды pSGH1. кодирующей полипептидный гормон роста лосося, растворяют в 40 мл раствора, содержащего 20 мМ трис-HCI (рН 7,5), 10 мМ
MgzCtz и 10 мМ NaCI (далее называемый буферным раствором У-10). Затем добавляют 10 единиц рестриктаэы Mbo I I и в течение
3 ч при 37 С проводят реакцию гидролиза.
Затем концентрацию NaCI в растворе доводят до 175 мМ, после чего добавляют 10
15 единиц Salt. Снова проводят реакцию гидН е oII на а а АТС АТАСААА АCI . -317ner т А с т А т с T т т т (-o I2 r. хек g1е G to 4ï5
- Асстт
Две единичные нити ДНК в 17-mer u
12-mer синтезируют обычным триэфирным методом. Затем 17-mer и 12-mer ДНК по 12 пмолей каждой растворяют в 20 мл раствора, содержащего 50 мМ три с-НС((рН 7.5j- 10 ролиза в течение 3 ч при 37 С. Методом НТГ получают примерно 0,2 мкг фрагмента ДНК в 163 Ьр, соответствующего N-концевой области.
Затем 5 мкг pSGH1 растворяют в 40 мл раствора, содержащего 20 мМ трис-НС! (рН
7,5) 10 MM MgClz и 100 мМ NaCI (далее называемом буферным раствором У-100). Добавляют десять единиц Bam Hl, после чего в течение 3 ч при 37 С проводят реакцию гидролиза. Затем концентрацию NaCI в ре30 акционном растворе доводят до 175 мМ и добавляют 10 единиц Sall. Снова проводят в течение 3 ч при 37 С реакцию гидролиза. методом НТГ иэ реакционного раствора выделяют примерно 0,5 мкг фрагмента ДНК
35 900 Ьр, содержащего С-концевую область и
3 -нетрансляционную область.
Отдельно растворяют в 40 мл буферного раствора У-100 5 мкг pCbLI и добавляют Bam
Hl u Hind!1! по 10 единиц каждого, При 30 С
40 в течение 3 ч проводят реакцию гидролиза,,после чего из реакционного раствора выделяют примерно 1 мкг фрагмента ДНК в 2,7 кВ, содержащего триптофановый и ромотор.
С целью присоединения трансляцион45 ного инициирующего кодона АТГ, необходимого для экспрессии ДНК, кодирующей полипептидный зрелый гормон роста лосося, и для связывания векторной ДНК и вышеупомянутой ДН К, синтезируют липидную
50 ДНК по приведенной схеме.
1825376
55
Ф мМ MgClz, 10 мМ дитиотреитола и 1 мМ
АТФ. Добавляют шесть единиц Т4-полинуклеотидкиназы и при 37 С в течение 60 мин проводят реакцию фосфорилирования, Затем 0,1 пмоля МЬо !!-Sal i-фрагмента (163 ор) pSGHI, 0,06 пмоля $а! !-Bam Hlфрагмента (примерно 900 ор) pSGH1 и 0,02 пмоля Hind III — Bam Hl-фрагмента(примерно
2,7 Кв) pGELI, полученных вышеуказанными способами, растворяют в 30 мл раствора, содержащего 50 мМ трис-HCI (ðÍ 7,5), 10 мМ
М9С!2, 10 мМ дитиотреитола и 1 мМ АТФ.
Затем добавляют 5 мл раствора для осуществления реакции фосфорилирования искусственной ДНК, полученного вышеприведенным способом. К полученной смеси добавляют шесть единиц Т4-ДНК-лигаэы и при 4 С в течение 18 часов проводят реакцию связывания, Для получения Апг-колонии трансформируют Е.coli HB101. Из колонии выделяют плазмиду ДНК pSGH1B2 с помощью полиакриламидного геля и использованием
ДЕАЕ-бумаги. Выделяют примерно 0,05 мкг фрагмента ДН К размером 108 ьр, соответствующего N-концевой области.
Затем 5 мкг pSCH14 растворяют в 40 мл раствора, содержащего 20 MM трис-HCI (рН
7,5), 10 мМ MgCIz и 50 мМ NaCI (далее называемом буферным раствором У-50). Затем добавляют PVU II u Hind !!! по 10 единиц каждого и в течение 3 ч при 37 С проводят реакцию гидролиэа. Методом НТГ иэ реакционного раствора выделяют примерно 0,5 мкг фрагмента ДНК размером 3,3 кВ, содержащего С-концевой участок и 3 - нетрансляционный участок гормона роста, образованного из pSGH14 и части вектора.
Для присоединения трансляционного инициирующего кодона АТГ, необходимого для экспрессии ДНК, кодирующей полипептидный зрелый гормон роста лосося и для связывания. векторной ДНК и упомянутой
ДНК, синтезируют по приведенной схеме связующую ДН К. нлаш МЬоп
5е- LA C C T T A T C C A A A A C 3ý t4 п;ер
