Способ разделения рацемической смеси (его варианты) и способ отделения хирального продукта от ахирального предшественника

 

Использование: в фармацевтической промышленности для получения оптически чистых биологически активных соединений. Сущность изобретения: разделение рацемической смеси осуществляют путем контактирования двух несмешивающихся потоков водного и органического на мембране с иммобилизованным ферментом. Первый поток, содержащий рацемическую смесь, подают к одной стороне мембраны, а второй поток - к противоположной стороне той же мембраны. Образовавшийся хиральный продукт выделяют из второго потока, а непрореагировавший стереоизомер - из первого потока, либо из первого потока выделяют как стереоизомер, так и образовавшийся хиральный продукт. ХиральныЛ.г продукт отделяют от ахирального предше-г ственника путем контактирования двух несмешивающихся потоков (водного и органического) на мембране с иммобилизованным ферментом. Первый поток, содержащий предшественник, подают к одной стороне мембраны, а второй поток - к противоположной стороне мембраны. Целевой продукт выделяют из второго потока. 3 с. и 33 з. п. ф-лы, 4 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОЛИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

:,х а. т 1)ЩДЯ

Н, . „д.., ця, К ПАТЕНТУ (86) РСТ/US 88/01098 31.03.88) (21) 4742278/13 (22) 29.09.89 (46) 30.06.93. Бюл, М 24 (31) 033962 (32) 01,04.87 (33) US (71) Сепракор, Инк, (US) (72) Стефен Л.Мзтсон (US) (56) Патент США М 4565782, кл. С12 P 17/12, 1986, (54) СПОСОБ РАЗДЕЛЕНИЯ РАЦЕМИЧЕСКОЙ СМЕСИ (ЕГО ВАРИАНТЫ) И СПОСОБ

ОТДЕЛЕНИЯ ХИРАЛЬНОГО ПРОДУКТА ОТ

АХИРАЛЬНОГО ПРЕДШЕСТВЕННИКА (57) Использование: в фармацевтической промышленности для получения оптически чистых биологически активных соединений.

Сущность изобретения: разделение рацемической смеси осуществляют путем контактирования двух несмешивающихся

Изобретение особенно пригодно при проведении ферментативного разделения и хирального синтеза соединений, которые плохо растворяются в воде или которые об-. разуются о реакциях с ингибированием продукта. Рацемические смеси, которые можно обрабатывать по способу настоящего изобретения, оключают смеси иэомеров хиральных органических спиртов, кислот, сложных эфиров, аминов, амидов и других соединений. Гидролитические ферменты наиболее подходящие в способе настоящего изобретения, включают липазы. карбоксилэстеразы и амидазы. Ахиральные предшестоенники, когорые по способу настоящего изобретения можно биотрансформирооать в ценные хирапьные продукты, включают гидантоины и аминонитрилы, ко,, Я2,, 1825378 А3 (я)5 С 12 P 41/00, 13/06, 17/12 потоков водного и органического на мембране с иммобилиэованным ферментом, Первый поток, содержащий рацемическую смесь, подают к одной стороне мембраны, а второй поток — к противоположной стороне той же мембраны, Образовавшийся хиральный продукт выделяют из второго потока, а непрореагировавший стереоизомер — из первого потока, либо из первого потока выделяют как стереоизомер, так и образовавшийся хиральный продукт. Хиральный-,.продукт отделяют от ахирального предшественника путем контактирования двух несмешивающихся потоков (водного и органического) на мембране с иммобилизованным ферментом. Первый поток, содержащий предшественник, подают к одной З стороне мембраны, а второй поток — к противоположной стороне мембраны, Целевой продукт выделяют иэ второго потока, 3 с. и 33 з. и. ф-ли, 4 табл. нн торые можно стереоселективно превратить СО в столь ценные продукты как аминокислоты, ) (например, Д-аминокислоты и метилдопа) и аминодмиды.

С целью органиэации описания способа настоящего изобретения желательно обсуждать процессы в "многофазных" и "экстрахтивных мембранных реахторах отдельно, так как конкретные применения изобретения попадают в эти две категории.

В том смысле, как использовано здесь, процесс в мембранном реакторе описывается как "многофазный", если ключевой реагент подают в виде несмешивающейся с водой органической фазы — и как нэкстрактивный" — если один или более из ключевых реагентов подают в виде водного раствора. Однако конструкции и работа этих "многофазних" и

1825378

"экстрактивных" мембранных реакторов и способы разделения (синтеза) стереоизомеров идентичны в большинстве важнейших аспектов.

Мембрана вктивированная ферментом в многофазных мембранных реакторных процессах настоящего изобретения обычно состоит из пористой и гидрофильной (то есть смачиваемой водой) мембраны, которую соответствующим образом активируют, вводят соответствующий фермент внутрь или на одну или более из ее поверхностей различными способами. Одну из поверхностей такой ферментативно активированной мембраны помещают в контакте с первым обрабатываемым потоком, сырьевым потоком, причем этот поток обычно содержит плохо растворимый в воде (т. е, не смешивающийся с водой) на органической основе сырьевой поток, может содержать только реагент в виде чистой органической жидкости или может состоять из плохо растворимого в воде, но растворимого в органике реагента, растворенного в несмешивающемся с водой органическом растворителе, который служит в качестве носителя-жидкости.в этом сырьевом потоке могут также присутствовать другие сорастворители, Одновременно, вторая поверхность ферментативно активированной мембраны . находится в контакте с водным обрабатываемым потоком, причем этот поток служит одной или более из следующих целей: подает или удаляет воду в реакцию (или из реакции); обеспечивает средства для контроля за рН реакции (и в некоторых случаях доходит до фермента, содержащегося в мембране); обеспечивает средства для удаления растворимых в воде продуктов реакции. При соответставующей работе: граница раздела органической и водной фаз будет находиться на поверхности смачиваемой водой активирован ной ферментом мембраны, то есть в контакте с сырьевым несмешивающимся с водой потоком органики, и практически водное окружение будет обеспечено для работы фермента в гидрофильной, смачиваемой водой мембране. Два.поступающих (т. е. сырьевых) и два отходящих (т. е. продуктовых) потока будут таким образом подаваться и выходить из процесса изобретения, соответственно, и поэтому мембранный модуль реактора должен иметь такую конфигурацию, чтобы в нем было два входных и два выходных отверстия. Одна пара входного (выходного) отверстия предназначена для подачи и удаления потока органической фазы, тогда как другая пара предназначена для подачи и удаления водного потока.

55 качестве разделителя органической) водной фаз и в качестве пограничного биокаталиэатора, Помещая гидрофильную мембрану на границу между несмешивающимися водным и органическим потоками в мембранном модуле, характеризующемся высокой

Для гидрофильных или смачиваемых водой активиронанных ферментами мембран такой органический поток предпочтительно подают под небольшим положительным давлением относительно водного потока в контакте с противоположной поверхностью мембраны. Такая небольшая разность давлений между органическим и водным потоками через мембрану служит для предотвращения ультрафильтрационного потока части водного потока через мембрану. В то же время при работе таким образом будет предотвращаться проникновение органической фазы в поры смачиваемой акти"5 вированной ферментом мембраны за счет капиллярных сил, действующих на поверхности мембраны в контакте с ней.

Здесь в практике изобретения плохо растворимый в воде, предпочтительно растворимый в органике реагент подают в мембранный реактор в несмешивающемся с водой органическом потоке, где он контактирует с первой поверхность ферментативно активированной мембраны. Молекулы реагента последовательно диффундируют к поверхности раздела вода/органика расположенной на первой поверхности мембраны, где они разделяются в водные участки мембраны и претерпевают катализируемое

30 ферментом превращение в продукты. Если по крайней мере один из продуктов реакции обладает значительной растворимостью в воде, и особенно, если он растворим гораздо лучше реагента, такой вид продукта бу35 дет диффундировать сквозь мембрану и выходить в водный поток. контактирующий со второй поверхностью ферментативно активированной мембраны, будет затем удален из реактора и, наконец, выделен с

40 высокой степенью стереохимической частоты. Непрореагировавшая часть в сырьевом потоке (например, растворимые в органике энантиомеры и рацемической сырьевой смеси по отношению к которым фермент не проявляет активности) остаются в органической фазе. и эа счет этого отделяются от воднорастворимых продуктов ферментативной реакции, Ферментативно-активированные мемб50 раны в таком непрерывном многофаэном биореакторном процессе играют тройную роль: а именно, в качестве агента, осуществляющего контакт органической (водной фаз с большой площадью поверхности, в

182537S плотностью упаковки поверхности мембра-. ны, можно обеспечить большую площадь поверхности контакта органика (вода и жидкость) / мембрана, что исключает необходимость диспергирования одной несмешивающейся фазы с другой, как это приходится делать в обычной практике.

Таким образом, многофазный мембранный реактор снимает ограничения систем с

10 дисперсными фазами, связаннными с их непредсказуемостью, слабой надежностью и работой в малых масштабах, Более того, процесс в. многофазных и экстрактивных мембранных реакторах позволяет избежать трудности, которые возникают при работе с эмульсиями и с необходимостью непрерывно разделять три несмешивающиеся фазы (т. е. органическую, водную и твердую, друг

15 от друга перед выделением продукта и/или рециклизацией реагента. Следующим преимуществом процесса в мембранном реакторе является то, что гораздо легче

20 осуществлять непрерывный процесс (в противоположность периодическому процессу).

Еще одним важным аспектом настоящего изобретения является то, что оно предоставляет средства для напосредственного контакта между содержащей реагент органической фазой и содержащей фермент твердой фазой беэ

30 пересечения с объемной водной фазой, которая присутствует в обычных конструкциях реакторов с дисперсными фазами, В частности, значительные ограничения массового переноса водной фазы, которые порочат обычные каталитические реакторы с дисперсной фазой, удается избежать, и при этом повысить продуктивность и эффективность каталитического превращения. Кроме того, претерпевшие превращения нерастворимые в воде и растворимые в органике реагенты побочные и совместно оплучае35

40 мые продукты, а также нереагирующую римые в воде и нерастворимые в органике продукты реакции можно выделить во втором потоке. Это является отделением воднорастворимого продукта от остальных лиофильных компонент реакционной системы. И наконец, эа счет контроля за скоростью потока или соотношениями фаз водного и органического потока, часто оказывается возможным провести обогащение продуктом реакции, удаляя растворимую в водной фазе часть продукта в концентрации более высокой, нежели концентрации его в предшественнике, в органической фазе или реагента в сырьевом потоке.

55 часть можно выделить в поток органики не- 45 смешивающийся с водой, тогда как раствоОбычно иммобилизованный на мембране фермент, используемый в способе настоящего изобретения, стереоселективно превращает один реактивный стереоизомер в рацемической (R и S) сырьевой смеси нерастворимых в воде изомеров в сырьевом потоке в водно растворимый иэомер в потоке продукта (R или S) изменившегося химического состава. Этот воднорастворимый иэомер в продуктовом потоке покидает реактор с ферментативной мембраной с водным потоком, тогда как непрореагировавший нерастворимый в воде реагентный изомер (S или R) в рацемическом сырьевом потоке покидает реактор в потоке органики. Полный эффект приводит к тому, что эти два вида изомеров с различнымии стереоконфигурациями отделяются друг от друга и поэтому, по крайней мере, частично оптически обогащаются. Таким образом, разделение рацемической сырьевой смеси на оптические изомеры мо кно осуществить в многофазном мембранном реакторе. Таким же образом в процессе действия многофаэного ферментативного мембранного реактора можно получить и параллельно выделить воднорастворимый органический целевой стереоиэомер в водном технологическом потоке, покидающем мнотофазный мембранный реактор, из растворимого в органике, относительно нерастворимого в воде, вхирального предшественника, который остается в органическом технологическом потоке.

Процесс изобретения в экстрактивном мембранном реакторе аналогичным образом пригоден для разделения рацемической смеси и ферментативного синтеза хиральных продуктов иэ ахиральных предшественников. Этот вариант способа практически соответствует по ситуации тому, что ферментативная реакция ингибируется либо кинетически, либо термодинамически малыми концентрациями продукта, или тому, что продукт реакции ограничен химической стабильностью в условиях реакции. В особенности. экстрактивный мембранный реактор адресуется к ограничениям малой конверсии и производительности катализатора. которые связаны с термодинамически невыгодными биосинтетическими реакциями катализируемыми ферментами, ингибирующими продукт, и контролирующими обратный поток.

Активированные мембраны в экстрактивном мембранном реакторном процессе обычно должны быть гидрофильными и микропористыми, что имеет место в варианте многофазного мембранного реакторного .процесса изобрвтения, и их исполхзуют

1825378

45

55 аналогично, пока они контактируют на противоположных сторонах с практически несмешивающимися водным и органическим технологическими потоками. Так, активированная ферментом мембрана в обоих вариантах — экстрактивном и многофазном мембранном реакторном процессах — служит как для обеспечения большой площади поверхности контакта между этими несмешивающимися технологическими потоками, так и для их разделения.

Однако, в случае экстрактивных мембранных реакторных процессов, либо ахиральный предшественник, либо стереоизомеры в рацемической сырьевой смеси, попавшие на активированную ферментом мембрану, обычно бывают предпочтительно воднорастворимыми, в противоположность растворимым в органике, как в случае варианта многофазных мембранных реакторов процесса.

Соответственно, сырьевой поток, подаваемый в экстрактивный мембранный реакторный процесс, должен быть скорее водным, нежели органическим. Хиральные продукты ферментативной реакции, образующиеся в экстрактивном мембранном реакторном процессе обычно скорее лучше растворимы в органике, нежели в воде, и поэтому, они будут разделяться на большую часть в органический технологический поток и выносится из реактора в этом потоке.

При работе экстрактивного мембранного реактора, по крайней мере, один предпочтительно воднорастворимый, нерастворимый в органике реагент (например, стереоизомер в рацемической смеси или ахиральный предшественник) подают на активированную ферментом мембрану в водном технологическом потоке. Этот образовавшийся в воде реагент затем диффундирует в гидрофильную смачиваемую водой мембрану, где он захватывается ферментом, который стереоселективно катализирует его превращение в продукт возможно в связи с другими сореагентами. По крайней мере, один из полученных таким образом продуктов реакции демонстрирует значительную растворимость в органической фазе. Так, этот вид будет диффундировать к поверхности раздела вода/органика, который расположен на поверхности мембраны активированной ферментом в контакте с органической фазой, где он будет предпочтительно разделяться в не смешивающийся с водой органический технологический поток для последующего удаления из реактора.

За счет селективного удаления растворимого в органике и ингибирующего и/или нестабильного продукта реакции в органи5

35 ческий технологический поток экстрактивного мембранного реакторного процесса, ферментативную реакционную систему делают более продуктивной. В экстрактивном мембранном реакторе ингибирующие или нестабильные продукты реакции получают в непосредственной близости к органическому экстрагирующему агенту. Сводя к минимуму расстояния диффузии, мембранный процесс повышает эффективность экстракции продукта по сравнению с обычной ситуацией в известных ранее способах в реакционных системах с дисперсной фазой.

В этих системах прототипов, когда ферменты были иммобилизованы на частичках носителей, существенное сопротивление переносу масс, связанное с подачей большого объема водной фазы, может уменьшить эффективность удаления продукта реакции из фазы фермента в органический экстрагирующий аген. Тот факт, что продукт ингибирующий реакцию, образуется в мембране активированной ферментом в непосредственной близости к органическим экстрагирующим агентом, повышает эффективность экстракции продукта (за счет минимизации расстояния диффузии его водной фазы) по сравнению с обычными реакционными системами с дисперсными фазами, где фермент иммобилизован на частицах носителя. 3а счет стереоселективности катализатора-фермента по крайней мере один из продуктовых потоков отводимых из процесса будет обогащен конкретным стереоизомером и выделен в значительной степени от других стереиэомеров. ахиральных предшественников и/или ахиральных сореагентов и побочных продуктов.

Таким образом, многофазный и экстрактивный ферментативный мембранный реактор можно испольэовать для эффективного получения стереохимически чисты или обогащенных оптическими изомерами продуктов из рацемических и оптически неактивных сырьевых смесей или из ахиральных предшественников, даже в тех случаях, когда ограниченная растворимость в воде реагентов или продуктов. ингибирующих ход реакции, препятствует эффективной работе в известных ранее способах ферментативного разделения.

Способ разделения рацемической смеси включает подачу в первый поток рацемической смеси, содержащей по крайней мере первый и второй стереоизомеры, к одной стороне активированной ферментом мембраны. причем указаннный фермент, который активирует мембрану, является катализатором реакции превращения пер1825378

10 активирует указанную мембрану, катализи- 50 рует реакцию превращения указанного ахирального предшественника в хиральный продукт; подачу в протиеотоке BTopoFо Ао тока практически несмешивающегося с первым потоком к противоположной стороне 55 укаэанной активированной ферментом мембраны, причем указанный хиральный продукт преимущественно диффундирует в указанный второй поток иэ укаэанной активированной ферментом мембраны, в ревого стереоизомера в хиральный продукт с измененным химическим строением; подачу о противотоке второго потока, практически несмешиваемого с указанным первым потоком, к противоположной стороне указанной актиоированной ферментом мембраны, за счет чего рацемическую смесь отделяют от указанного хирального продукта эа счет преимущественной диффузии его е указанный второй поток из указанной активированной ферментом мембраны, так что указанный второй поток, в основном, содержит указанный хиральный продукт, а укаэанный первый поток, в основном, содержит указанный второй стереоизомер.

Предлагаемый способ разделения рацемической смеси включает также подачу рацемической смеси, содержащей по крайней мере первый и второй стереизомеры, в первый поток к одной стороне активированной ферментом мембраны, где указанный фермент, который указанную мембрану, каталиэирует реакцию превращения первого стереоизомера е хиральный продукт, имеющий измененный химический состав и второй продукт, и подачу е протиоотоке второго потока практически несмешиеаемого с указанным первым потоком, к противоположной стороне указанной активированной ферментом мембраны, причем указанный хиральный продукт преимущественно диффундирует в указанный первый поток из указанной активированной ферментом мембраны, а указанный второй продукт преимущественно диффундирует ео второй указанный поток, За счет чего происходит разделение указанной рацемической смеси, причем указанный первый поток содержит указанный второй стереоизомер, и указанный химически отличающийся хиральный продукт.

Кроме того, в изобретении предложен способ получения хирального продукта иэ ахирального предшественника, включающий подачу первого потока, содержащего ахиральный предшественник, к одной стороне активироеанной ферментом мембраны, где укаэанный фермент, который зультате чего второй поток содержит укаэанный хиральный продукт, Более конкретно, изобретение относится к использованию описанных процессов в многофазных и экстрактивных ферментативных мембранных реакторах для стереоселективного синтеза или разделения рацемических смесей хиральных органических кислот, спиртов, аминов. сложных эфиров, амидов. нитридов, гицантоинов и других хиральных соединений, в которых мембраны являются носителями, или в них включены, или они каким-либо образом содержат фермент, способный стереоселективно катализировать реакцию превращения одного изомера или ахирального предшественника в химически отличающееся оптически активное соединение, Ферменты хорошо подходят на роль стервоселективных катализаторов, поскольку они содержат асимметричные каталитический сайты, с которыми могут связываться синте-зируемые или претерпевающие превращения молекулы. Так как эти активные сайты ферментов сами асимметричны, они обеспечивают различное воздействие на два энантиомера данного рацемического субстрата, и приводят к возможности образования хиральных продуктов иэ ахиральных и редшествен ников.

Так, например. существуют многие ферменты, которые эффективно катализируют гидролиэ или конденсацию сложноэфирных и амидных функциональных групп. Многие из этих ферментов, но не все, принадлежат либо к одному, либо к двум основным классам ферментов известных как гидролазы или лиаэы, что определено в рекомендациях комиссии по биохимической номенклатуре.

Термин Е. С. с последующими. цифрами, как он использован здесь, обеспечивает идентификацию в соответствии с рекомендациями этой комиссии.

Конкретные примеры таких ферментов

5 включают, но не ограничиваются, такими ферментами, как трипсин, химотрипсин, термолиэин, ренин, пепсин, папаин, карбоксипептидаэа, аминопептидаэа, пенициллин и цефалоспоринацилаэа, ацетилхолинзстераза. холестеролэстераза и пакреатик липазы и пептидазы млекопитающихся.

Так, например, обычно предпочтительным источником липазы (Е. С. 3. 1, 1. 3) является Candlda СуИпбгасеа (С. fugosa), и типичные предпочтительные эстеразы включают химотрипсин (E. С. 3. 4, 21. 1) и Y (Е, С. 3. 4. 21. 14) из-эа их доступности, высокой стереоселективности и широкого . круга подходящих субстратов. Другие мик5

1825378

12 зы". Эти названия не имеют официального статуса, но широко используются в текущей литературе. "Нитрилгидратаэе" был присвоен регистрационный номер Chemical

Abstracts (82391 — 37-5), а "нитрилазе" был присвоен регистрационный номер (902490 — 2). Следует учитывать, что они также включены о объем настоящего изобретения

55 робиологические источники включают (на не ограничиваются ими): Pseudomonas

aeruglnosa, Pseudomonas flourecens.

Rhizopus arrhlzus, Rhlzopus delemar, Rhlzopus nivens, Rhlzopus oryzae, Rhizopus

japonlcus, Chromobacterium viscosum, Geotrlchlum candldum, Aspergillus niger, Asperglllu s

so)ae, Asperglllus oryzae, Mucor nuehei, Penicillium

wqaeforti, Penlclllium cyclopium, Achromobacter

Ilpolyticum, Alcallgenes sp„Thermomyces 10

lanuginosus, Pylomyces niteus, Arthrobacter

sp., Fusarlum oxysporium, Candlda lipolytica, and Humlcola lanuglnosa. Панкреатик-липа- зы от различных видов млекопитающих и липазы, полученные и зародышей пшеницы, 15 также можно использовать. Другие эстераэы, полученные от млекопитающихся. включают (но не ограничиваются ими) карбоксилэстеразу (Е. С, 3. 1. 1, 1). карбоксипептидазу А (Е, С. 3. 4. 17. 1), ацетилхоли- 20 нэстразу (Е, С, 3. 1. 1. 7) пепсин (F, С. 3. 4.

23, 1) и трипсин (Е. С. 3, 4. 21, 4}. Другие микробные источники включают Bacillus

thermoprofcolyticus (для термолизина)

Bacillus amylol! grefacicus u Streptomyces 25

griscus также папаин (Е. С. 3. 4, 22. 2), полученный из Paperya latex.

В зависимости от источника липазы и зстеразы имеют рабочий интервал рН 2—

10, причем оптимальное значение рН 5,0 — 8,5. 30

Температурный интервал для большинства ферментов охватывает 15-70 С, причем ферменты работают обычно более эффективно о интервале температур 20—

45 С, 35

Как было указано ранее, изобретение относится та же к использованию мембран1 ных биореакторов для разделения рацемических смесей хиральных органических нитрилов. Ферменты, подходящие для этой 40 цели, должны катализираоать гидролиз нитрильной функции, либо до соответствующего амида, либо непосредственно до соответствующей карбоновой кислоты. Эти ферменть могут принадлежать (но не обяза- 45 тельна этим ограничиваются) к основному классу ферментов известных как гидролазы.

Обычно ферменты. которые трансформируют нитрил в амид, называют "нитрил гид,ратазы", а ферменты, которые 50 трансформируют нитрил непосредственно в карбоновую кислоту, называют "нитриладля использования "нитрилгидратазной" активности наряду C "амидазной" активностью для трансформации нитрила в соответствующую карбоновую кислоту.

Ферменты, которые используют в изобретении для трансформирования нитрильных функциональных групп обычно, но не исключительно, находят в микроорганизмах. Микроорганизмы, в которых была обнаружена "нитрилгидратазная" активность, принадлежат (но не ограничиваются ими) к следующим родам: Acromonas, Arthrobacter, Brevlbacterium, Pseudomonas. Микроорганизмы, в которых обнаружена "нитрилаэная" активность, принадлежат (но не ограничиваются ими) к следующим родам:

Arthrobacter, Aspergillus. Bacillus.

Bactridlum, Corynebacterlum, Fusarluttf, К!еЬз1еИа, Micrococcus Nocardia. Одна или

obe иэ этих активностей наблюдались также в родах: Agrobacterium, Achromobacter, Rhodotorulla, Paracoccus, ЛсетоЬас1вг и Escherichia.

Стереоспецифический гидролиэ рацемических гидантоинов аминокислот да получения оптически активных карбамоиламинокислот катализируется ферментамн, принадлежащими к категории дигидропиримидиназ (Е. С, 3. 5, 2, 2), известных также под менее формальным названием "гидантоиназы". Дигидропиримидинаэы можно получить от млекопитающихся. включая (но не ограничиваясь этим) бычью печень или микробных источников, включая бактерии, актиномицеты, плесень, дрожжи и дейтеромицеты. Примерами бактериальных источников ферментов могут служить:

Achromobacter, Aегоbacter, Aегоmonas, Agrobacterlum, Alcaligenes, Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterlum, Corynebacterlum, E nte rob aeter, E rwlnla, E sc herlchla, Klebslella, Mlcrobacterlum, Mlcrococcus, Protaminobacter, Proteus, Pseudomonas, Sarclna, Serratla u Xanthomonas. Примерами актиномицетов являются Ас0поаусез, Actinopianes. Mycobacterlum, Nocardla u

Streptomyces. Плесени включают

Asperglllus, Paccllomyces u Penicilllum.

Дрожжи включают Candida, Rhodotorula, Pichia u Torulopsis.

Хотя широкие рабочие интервалы рН и температур, в которых активны гидантоиназы, грубо соответстуют интервалам, указанным ранее для других гидролитическмх ферментов, их оптимальные значения рН обычно выше, т. е. около 7-9.

В дополнении к выделенным и очищенным ферментам следует заметить, что способы изобретения можно также вести, используя относительно "грязные" и/или

1825378

55 смешанных родов ферментные препараты, такие как те, которые получают из клеточных эстрактов, клеточных лизатов и частично очищенных изолятов ферментов, что приводит к некоторому снижению активности ферментов, связанных с активированными ферментами мембранами.

Действительно, ферменты, содержащиеся в целых клетках, независимо живых или нет, можно также использовать в практике изобретения, и соответственно, термин "фермент" в том смысле, как он здесь используется, подразумевает широкое включение биокаталитических ферментов во всех этих формах.

Типы ферментативных реакций, пригоднь х в практике изобретения, включают, но не ограничиваются ими, следующие категории: гидролиз сложных эфиров до кислот и спиртов; образование сложных эфиров (т. е. этерификация) иэ кислот и спиртов; трансэтерификация, т, е. взаимодействие сложного эфира со спиртом или кислотой до образования другого сложного эфира и другого спирта или кислоты; трансаминирование (например, взаимодействие между альфакетокислотой и аминокислотой); гидролиз амидов (включая пептидные связи и

N--ацилсоединения) до получения кислот и аминов; образование амидов (включая пептиды) из кислот и аминов (или аминокислот); гидролиз гидантоинов аминокислот до получения карбамоиламинокислот и аминокислот и гидролиз нитрилов до получения соответствующих амидов и карбоновых кислот (в частности, гидролиз аминонитрилов до аминоамидов и аминокислот).

Конкретные хиральные соединения и предшественники или их производные, которые по способу изобретения желательно получить либо хиральным (т, е. асимметричным) ферментативным синтезом и/или ферментативно разделить рацемическую смесь химически полученных энантиомеров, включают (но не ограничиваются ими) следующие: напроксен или 2-(6-метокси-2-наф-тил)пропионовую кислоту; ибупрофен или

2-(-4-изобутилфенил)-пропионовую кислоту; кетопрофен или 2-(3-бензоилфенил)пропионовую кислоту; флурбипрофен или 2-(2фтор-4-бифенилил)пропионовую кислоту;

S-бензоил-бета-меркаптоизомасляную кислоту; 2-бромпропионовую кислоту и ее сложные эфиры; 2-хлорпропионовую кислоты и ее сложные эфиры; парагидроксифенилглицин и фенилглицин;

2-амино-2,3-диаметилмасляную кислоту и 2амино-2.3-диметилбутирамид; аминокислоты, включая 1 -допа и метилдопа; бета-меркаптоизомасляную кислоту; глици5

45 дол и глицидилбутират; молочную кислоту; карнитин; виннокаменную кислоту; 2-бромфенилмасляной кислоты; этиловый сложный эфир; пептидов, включая "аспартам" и

"элитам", арилоксипропаноламины. включая пропранолол и 1-ацетокси-2-арилоксипропионитрилы, включая 1ацетокси-2-альфанафтилоксипропионитри лы; альфа-арилоксипропионовые кислоты и их сложноэфирные производные, включая

2-феноксипропионовую кислоту, бутил-2(4)(5-)-трифторметил(-2-пиридинил)окси ) феноксипропаноат, метил-2+4)(5-)трифторметил(-2-пиридинид)окси(фенокси)пропаноат, метил-2-(4-)2,4-дихлорфенокси(фенокси)пропионат и метил-2-(4-гидроксифенокси) пропионат; 5-эамещенные гидантоины и тиогидантоины; пиретроидные инсектициды, включая циперметрин и флувалинат; 2-(na ра-хлорфенокси)-пропионовую кислоту; цианогидрины, включая альфа-циано

3-феноксибензиловый спирт; 4-гидрокси-Эметил-2,2 -пропинил-2-циклопентенон; 4амино-3-гидроксимасляную кислоту;

1-метокси-2-гидроксипропан; 4-атил-2-пиперидинкарбоновую кислоту; N-(2-гидрокси-2-)3-формамидо-4-гидроксифенил))-1фенил-3 в ; N-(1-карбоксиэтил-3фенилпропил)-2-аминопропионовую кислоту; 2-индоленкарбоновую кислоту;

2-амино-2-метил-3-(3,4-дигидроксифенил)пропионитрил и 2-амино-2-метил-3-(3-метокси-4-гидроксифенил)пропионитрил; метил-2-амино-3-гидрокси-3-(4-нитрофенил)пропионат; 2-((1-карбамоил-1,2-диаметилпропил)-карбамоил)-никотиновую кислоту и

2-((1-циано-1,2-диметилп ропил) карбамоил)никотиновую кислоту; и й-(3-фенил-1-карбоксипропил)-2-аминопропионовую кислоту и ее сложные эфиры.

Химическая природа (например, идентичность функциональных групп) многих конкретных реагентов и продуктов будет яс- . на иэ приводимых списков категорий реагентов, реакций и продуктов. Иэ этих списков будет видно, что основная часть этих реакций попадает в один из двух классов: либо (1) практически нерастворимые в воде и растворимые в органике реагенты превращают в растворимые в воде продукты, либо (11) растворимые в воде, практически не растворимые в органике реагенты превращают в растворимые в органике продукты. Такие типы реакций особенно пригодны для проведения многофазных и экстрактивных мембранных реакторных процессов, соответственно. В качестве примера реакций первой категории можно привести реакцию, в которой сложные эфиры, которые едва растворимы в воде, можно эф15

1825378

16 фективно гидролизовать до соответствуюЩих воднорастворимых кислот в процессах в многофаэном мембранном реакторе. Соответствующий спиртовой одновременно получаемый продукт мажет быть преимущественно растворим либо в водной, либо в органической фазе. И наоборот, кислоты, которые хорошо растворимы в воде, но недоста1очно растворимы в органических растворителях, благодаря их электрическому заряду, можно эффективно превращать в сложные эфиры в процессах в экстрактивных мембранных реакторах, где сложные эфИры нэ деле демонстрируют заметную растворимость в органических растворителях, что облегчает их удаление из зоны реакции благодаря их селективной экстракции в растворитель. В этом случае спиртовой сореагент можно подавать в экстрактивный мембранный реактор, либо в 20 водном, либо в органическом технологическом потоках, в зависимости от характеристики растворимости спирта.

В способе с многофазным и экстрактивным мембранным реактором стереоселективную ферментэтивную реакцию можно вести либо, используя рацемическую форму самого целевого соединения в качестве смешанного реагентэ, либо используя его простое химическое производное в. качестве .смеси реагента, В частности, ферментэтивное разделение хирэльных кислот или хиральных спиртов можно вести целым рядом способов в мембранных реакторах; двэ предпочтительных процесса в мембранных 35 реакторах включают (i) стереоселективный ферментативный гидрализ рацемичечкой смеси сложноэфирных производных целевого продукта в многофазном мембранном реакторе, и (II) стереоселективную фермен- 40 тативную этерификацию хи ральной кислоты или спирта в экстрэктивном мембранном реакторе. В обоих случаях выбор кислотного или спиртового фрагмента, используемого для получения сложноэфирного производ- 45 ного с целевым хиральным спиртом или хиральной кислотой, важно для эффективной работы процесса в мембранном реакторе, Так, например, эти соединения можно выбирать, чтобы регулировать растворимость 50 в воде сложноэфирных производных,а также максимизировать ферментную активность и стереоселективность относительно этих производных. Спирты, пригодные для этерификэции хиральных кислот, такие как 55 напрексен и ибупрофен включают, но не ограничиваются ими, соединения, представленные формулой RCHzOH, где R является атомом водорода, алкильной группой, содержащей от 1 до 18 атомов углерода, -CN, - CCb, - СН2С, - СНН02СНз, - С = СН.СН = СН2, - СОСНз, - СОО-алк или СН20-алк, где алкильная гоуппа "алк" содержит от 1 до

4 атомов углерода, Кислоты для этерификации хирэльных спиртов таких как глицидол или ментол. включают, но не ограничиваются ими, соединения представленные

RCOOH, где R является алкильной группой, содержащей от 1 до 18 атомов углерода или

CHzCH2C00H. В этом плане подходящими являются фосфатные сложные эфиры хирэльных спиртов, Так, например, предпочтительные хиральные сложные эфиры, рацемические смеси которых можно разделить по способу изобретения, включают глицидилбутират и метил-2(4-гидроксифенокси)п ропионат.

Можно также предвидеть, что изобретение можно будет использовать для разделения рацемических смесей хиральных сложных эфиров, выбранных из группы, состоящей из этилового сложного эфира 2-бромфенилмасляной кислоты, S-бенэоил-бетамеркаптоизомасляной кислоты (тиоловый эфир), бутиловых и метиловых сложных эфиров 2(4-)(5-)трифтор метил(-2-пи р иди н ил)о к си(фенокси)пропионовой кислоты, метил-2-(4, 2,4-дихлорфенокси(фенокси)пропионата, альфа-циано сложного эфира пиретроидов. включающих циперметрин и флувалинат, метил-2-эмина-3-гид рокси-3-(4-нитрофенил)пропионат и 1-ацетокси-2-арилоксипропионитрилы, включая 1-ацетокси-2-альфанафтилоксипропионитрил.

Предпочтительные хирэльные кислоты, рацемические смеси которых можно разделить по способу настоящего изобретения, включают напроксен, и бупрофен, кетопрофен и флурипрофен; S-бензол-бетам еркатоизомасляную кислоту; 2-гэлоидпропионовые кислоты, включая 2хлорпропионовую кислоту и 2-бром-пропионовую кислоту; аминокислоты, включая допа, фенилглицин и парагидроксифенилглицин, альфаарилоксипропионовые кислоты, включая 2-феноксипропионовую кислоту, 2-(пара-хлорфенокси)-пропионовую кислоту и 2-(4-гидроксифенокси)пропионовую кислоту, Можно также предсказать, что способ настоящего изобретения можно использовать для разделения рацемических смесей хиральных кислот, выбранных на группы, состоящей иэ бета-меркаптоизомасляной кислоты; метилдопа; пептидов, включая аспартам и элитам; 2-ацетиламино2,3-диметилмасляную кислоту; карнитинмолочную и виннокаменную кислоты;

2-бромфенилмэсляную кислоту 2-(4-)(5)трифторметил(2-пиридинил)окси(фенокси)пропионовой кислоты; 2-(4-)2.4-дихлорфенок1825378

17 си(фенокси)пропионовой кислоты; хризантемовой кислоты и их производных; 4-амино-3-гидроксимасляной кислоты;

4-этил-2-пиперидин-карбокси кислоту N (1карбоксиэтил-3-фенилпропил)-2-аминопропионовую кислоту; 2-индоленкарбоновую кислоту; 2-амино-3-гидрокси-3-(4-нитрофенил)пропионовую кислоту и N-(3-фенил-1карбоксипропил)-2-аминопропионовую кислоту, Такие хиральные кислоты можно разделять, непосредственно подавая рацемические их смеси непосредственно в процессе с многофазным или экстрактивным мембранным реактором. В другом варианте, рацемические смеси сложноэфирных или амидных производных хиральных кислот можно сначала получить при взаимодействии этих рацемических кислот со спиртами или аминами, соответственно, а затем, подавая указанную рацемическую смесь сложноэфирных или амидных производных в мембранный реакторный процесс для осуществления разделения исходной смеси рацемических кислот косвенным образом.

В другом предпочтительном варианте настоящего изобретения рацемические смеси хиральных спиртов разделяют, если хиральный спирт является глицидолом, карнитином, цианогидриновыми спиртами, включая альфа-циано-3-феноксибензальдегид или 4-гидрокси-Ç-метил-2,2 -пропинил2-циклопентенон. Можно также предсказать, что в практике настоящего изобретения хиральный спирт следует выбирать из группы, состоящей из арилоксипропаноламинов, включая пропранолол; аминокислот, содержащих в боковых цепях гидроксильные группы, включая пара-гидроксифенил глици н; бета-меркаптоизомасляную кислоту (короче говоря,тиол);

4-амино-3-гидроксимасляную кислоту; 1метокси-2-гидроксипропан; N-(2-гидрокси2-)3-фам а мидо-4-гидр о ксифе н ил)-1-фе н иламинобутан; 2-амино-2-метил-З-(3,4-гидроксифенил)пропионитрил и 2-амино-2-метил3-(3-метокси-4-гидроксифенил)пропионитрил; и 2-амино-3-гидрокси-3-(4-нитрофенил)пропионовую кислоту и ее сложный метиловый эфир.

С одной стороны, рацемические смеси таких хиральных спиртов можно разделить, подавая смесь рацемического спирта непосредственно в процессе ферментного

55 способом. мембранного реактора настоящего изобретения. С другой стороны, рацемическую смесь производных хиральных сложных эфиров можно вначале получить, подвергая

И наконец, можно также предположить, что изобретение будет использоваться для разделения рацемических смесей рээличвзаимодействию смесь рацемического ных хиральных нитрильных соединений, выспирта с кислотой, а затем подавая эту ра- бранных из группы содержащей

50 цемическую сложноэфирную смесь в мембранный реактор для проведения разделения смеси рацемического спирта косвенным образом.

Предпочтительные хиральные амиды, рацемические смеси которых можно подавать в способ с мембранным реактором, описанный здесь, и разделить в нем, включают 2-амино-2,3-диметилбути рамид, 2-ацетиламино-2,3-диметилмасляную кислоту и пептиды, включая аспартам и алитам. Следует также предвидеть, что настоящее изобретение можно использовать для разделения рацемических аминокислот, содержащих амидные группы в боковых цепях и к 2-((1-карбамоил-1,2-диметилпропил)карбоил)никотиновую кислоту.

Предпочтительным хиральным амином, рацемические смеси которого можно разделить в процессе с использованием рассматриваемого мембранного реактора, является фенилглицин, причем стереоселективная ферментативная реакция включает альфааминогруппу. Можно также предвидеть, что настоящее изобретение можно применить к разделению рацемических смесей, выбранных иэ группы, состоящей из 2-амино2, 3-д и м е т и л б у т и р о н и р и л а;

2-амино-2,3-диметилбутирамида; аминокислот, включая допа и парагидроксифенилглицин, пептиды, включая аспартам и элитам; арилоксипропаноламины, включая и ропанолон: 4-амино-3-гидроксимасляную кислоту; 4-этил-2-пиперидинкарбоновую кислоту; N-(1-карбоксиэтил-3-фенилпропил)-2-аминопропионовую кислоту; 2-амина-2-метил-З-(3,4-дигидроксифенил)пропионитрил и 2-амино-2-метил-3-(3-метокси-4гидроксифенил)п ропионитрил: и 2-амино-3гидрокси-3-(4-нитрофенил)п ропионовую кислоту и их сложные метиловые эфиры.

С одной стороны, рацемические смеси таки хиральных аминов можно разделить, подавая рацемическую смесь аминов непосредственно в способ с использованием мембранного реактора. В другом варианте, рацемическую смесь хиральных производных амида можно вначале получить, осуществляя взаимодействие рацемической смеси амина с кислотой, а затем разделяя полученную рацемическую смесь амида в процессе с ферментативным мембранным реактором. В результате, исходную рацемическую смесь амина разделяют косвенным

1825378

40

2-амино-2,3-диметилбутиронитрил; 1-ацетокси-2-рилоксипропионитрил ы, включая 1ацетокси-2-альфа-нафтилоксипропионитр ил; 2-амина-2-метил-3-(3,4-дигидроксифенил)пропионитрил и 2-амино-2-метил-3-(3метокси-4-гидроксифенил)пропионитрил; и

2-((1-циано-1,2-диметилпропил)карбамоил)никотиновая кислота.

Различия в рэстворимостях ключевых реагентов и продуктов в многофазных мембранных реакторных схемах, как будет видно, обычно возникают эа счет превращения относительно неполлрных и/или незаряженных функциональных групп (например, сложноэфирные или амидные связи) в более полярные и/или заряженные функциональные группы (например, карбоксильные группы), тогда как обычно бывает справедливо обратное (т. е. полярные) заряженные функциональные группы превращаются в относительно неполярные (незаряженые группы) в процессах в экстрэктивных мембранных реакторах.

Обычно, но не обязательно, коэффициенты разделения, т, е. отношения концентраций веществ в органической фазе к одной фазе в условиях равновесия, или отношения концентраций в водной.-к-органической фазе, будут превышать двойку для ключевых реагентов и продуктов, и предпочтительно .распределение отношений ключевых компонентов будет превышать около 10 для ог.гимальных режииоо процессов в многофазных и экстрактивных реакторах. В идеальных условиях отношения коэффициентов разделения могут превышать 100 и более, чем приводит к очень эффективной работе реактора и разделению стереоизомеров реагент-продукт, но столь черезвычайно высокие различия в растворимости вовсе не требуются для осуществления настоящего изобретения на практике.

Абсолютные растворимости реагентов и продуктов в водных и органических фазах гораздо менее важны для практики изобретения, причем как многофазные так и экстрэктивные мембранные реакторные процессы успешно функционируют в условиях, когда концентрации либо реагентов, либо продукта в одной или более из фаз бывают порядка микромолей на литр или ниже. В противоположном случае, нерастворимые в воде реагенты, которые представляют собой жидкости при температурах ферментативных реакций, можно подавать непосредственно в виде чистых жидкостей, при весьма высоких концентрациях, в процессе в миогофазных мембранных реакторах. В другом варианте, когда плохо растворимый в воде реагент представляет

35 собой твердый продукт или весьма вязкую жидкость, удобно растворить его в органическом растворителе, таком чтобы полученный раствор оказался несмешивающимся с водой. Растворители, которые, как было показано, пригодны для этой цели, включают (но не ограничиваются ими) алифатические и ароматические углеводороды, такие как гексан и толуол; такие хлорированные растворители как метиленхлорид и хлороформ; не смешивающиеся с водой спирты, такие как амиловый спирт, октэнол и деканол, такие сложные эфиры как амилацетат; и такие кетоны, как метилизобутилкетон. При выборе растворителя для применения в процессе в многофазных и экстрактивных мембранных реакторах, важно учитывать его совместимость с мембранным материалом и ферментом, а также его токсичность, вязкость, растворимость и смешиваемость, а также способность легко отделять его от других компонентов реакции.

Активированные ферментом мембраны, пригодные для практики изобретения, следует выбирать, учитывая несколько аспектов. а именно химию, морфологию и тип активации фермента, Что касается первого, то материал мембраны должен быть таким, чтобы на него не оказывал вредного действия (т. е. не способствовал набуханию или химическому взаимодействию) ни один иэ ингредиентов в системе реактора, в частности органические реагенты, продукты и/или растворители. Хотя мембраны, состоящие из неорганических материалов (например, керамики) можно испольэовать в практике настоящего изобретения, предпочтительными вариантами являются полимерные мембраны, В частности, для проведения рассматриваемых процессов весьма подхо дят мембраны, изготовленные из устойчивых к растворителям полимеров. Типичные полимерные материалы, иэ которых можно изготовить подходящие мембраны для практики настоящего изобретения, включают но не ограничиваются ими, регенерированную целлюлозу, сложные эфиры целлюлозы (и особенно предпочтительны неполный ацетат и нитратный сложный эфир), полиакрилонитрил и его сополимеры) особенно гидрофильные, включающие, но не ограничивающиеся ими, сополимеры с акриламидными, акрилэтными, и/или метакрилэтными функциональными группами), полиуретаносодержащие сополимеры, полиарилсульфоны и полиарилэфирсульфоны (включающие полисульфон, полиэфирсульфон и смеси его с такими гидрофильными сополимерами как полиэтиленоксид, полигидроксиэфиры, полиэтиленгликоль, пол21

1825378

22 ивиниловый спирт, полиакрилонитрил, поликап ролактон, и полиэпигалогеногидрины), поливинилиденфторид, политетрафторэтилен, поливиниловый спирт, алифатические и ароматические полиамиды, полиимиды, полиэфиримиды, сложные полиэфиры, поликарбонаты, полиолефины и полипропилен и поливинилхлорид, полибенэимидазол и полибензимидазолон.

Ферментный компонент активированной ферментом мембраны обычно функционируют более эффективно преимущественно в водной среде, и поэтому предпочтительно, чтобы мембрана была смачиваемой водой или гидрофильной. Некоторые из вышеперечисленных полимеров для мембран являются по происхождению гидрофильными (например, целлюлозы, многие полиакрилонитрильные сополимеры и полиамиды). Однако. даже те из них, которые по своей природе не являются гидрофильными, могут стать подходящими для целей изобретения за счет соответствующей химической или физической обработки поверхности (например путем получения производных или присоединения гидрофильных функциональных групп или просто путем контактирования с соответствующим поверхностно-активным агентом), путем нанесения покрытия на поверхность пористых стенок гидрофобных полимеров с гидрофильными материалами, или просто заполнения объема пор асимметричной микропористой мембраны гидрофильным ферментом в виде геля с высоким содержанием воды.

Мембраны, пригодные для использования в качестве подложки для ферментов, могут иметь одну из нескольких морфологий. В частности, они могут быть микропористыми мембранами такого типа, который обычно используют в процессах микрофильтрации, когда размерь пор варьируются от нескольких сотых микрона до нескольких микрон, а свободный объем пор варьируется в интервале от нескольких процентов до

90;ь и более, Такие микропористые мембраны могут быть изотропными (т. е. без заметных различий в размерах пор в направлении от одной внешней поверхности к другой), или же они могут демонстрировать некоторую степень анизотропии.

Ультрафильтрационные мембраны также пригодны для использования в практике настоящего изобретения. Обычно они в высокой степени асимметричны и отличаются очень тонкой оболочкой с эффективным размером пор в интервале 1-20 нм, причем в верхней части находятся участки гораздо болеетонкие, но более пористые, с большим

50 ограничиваются ими) заключение в объемы пространства пор асимметричных (т. е. с оболочкой) и микропористых мембранных структур, адсорбцию на поверхностях пориразмером пор. Кроме того, мембраны для диализа типа гелей (например. мембраны из регенерированной целлюлозы такого типа, который используют в гемодиализе) также могут быть использованы, особенно, если фермент расположен на поверхности мембраны. Такие мембраны могут быть активированы на поверхности либо за счет ковалентного присоединения фермента к внешней поверхности, или эа счет образования динамического ферментного гель-поляризованного слоя "вторичной мембраны" на одной поверхности.

В-предпочтительном варианте мембрана является, в основном, микропористой, характеризующейся относительно тонким слоем мелкопористого губчатого субстрата с большим объемом пор, но у нее есть оболочка ультрафильтрационного типа с одной внешней поверхностью. Такая морфология мембран обеспечивает большой обьем загружаемого фермента, и облегчает периодическую замену фермента. Использование микрофильтрационных мембран с оболоч-. кой с такой предпочтительной морфологией описывается далее в отношении типов ферментной активации.

Геометрия используемых мембран в практике изобретения является вторичной, и могут использоваться как мембраны в форме плоских листов, трубок (предпочтительно большого диаметра, так и полые волокна различных диаметров, Так как существенно, чтобы мембранный модуль имел два входных и два выходных отверстия, для упаковки мембран в виде плоских листов предпочтительны устройства кассетного типа (пластинка в рамке) по сравнению со спиральными патронами, тогда как мембраны с полыми волокнами и трубчатые мембраны эффективно упаковывать в цилиндрические мультитрубчатые или мультиволокнистые мембранные модули, конструкции, которые напоминают конструкции трубчатых в кожухе теплообменников. Мембраны в форме модулей с полыми вол хнами позволяют плотно и экономично упаковывать мембраны с большими поверхностями.

За счет помещения, закрепления или иммобилизации фермента внутри мембранной фазы любые утечки фермента из мембраны в потоки либо водной либо органической фаэ можно практически предотвратить. Подходящие средства для введения ферментов включают (но не

1825378

35

45

50 стых стенок, захват или псевдокапсулирование в полимерных гелях в мембранных порах, ковалентное связывание с пористыми стенками мембраны, и сшивку фермента либо внутри объема пор, либо адсорбцию на поверхностях пористых стенок мембран.

Более конкретно, существует ряд альтернативных вариантов для активации мембраны ферментом, Наиболее непосредственный подход включает ковалентное связывание фермента с внешней или внутренней (т. е. со стенками пор) поверхностями мембран за счет любых обычных средств иммобилизации ферментов, разработанных химиками для присоединения биокатализаторов на немембранных носителях (См:

Zaborsky О,R. Immobilized Enzymes, CRC

Press> Clevelend, ОН (1973); Weetal Н,Н. immobilized Enzymes Antlgens, Antibodies and

Peptides: Enzymology vol 1, Marcel Dekker

N.Y. (1975); Emerg. А. et al Biotechnoi.

Bioeng. 16: 1359 (1974)).

Ферменты можно также сшить в пористых мембранах (Thomas, 0 and SR Caplan.

351 — 398 in Membrane Separation Processes, Р meares ed Elsvier, Amsterdam (1976)) заключить в мембранные или (Blaedel.W.J, et. а1. Anal, Chem. 41: 2030 (1972)), псевдокапсулировать или адсорбировать на мембранах или внутри мембран эа счет ионообменных или других специфических или неспецифических взаимодействий про.Ъ, теин-поверхность. Можно также предвидеть, что в практике изобретения в некоторых случаях будет эффективно комбинировать описанные методики, Так, например, фермент можно вначале адсорбировать на внешней поверхности мембраны или на поверхностях пористых стенок, а эагем закрепить сильнее за счет сшивки адсорбированных слоев фермента уже на месте.

В предпочтительном варианте фермент должен быть обратимо заключен в микропористой мембране с оболочкой. Такие мембранные структуры, представленные на рис.

4, способны захватывать фермент между двумя границами, которые он не может пересечь в обычных условиях работы мембранного реактора. Эти два барьера состоят иэ поверхностного слоя "оболочки" активированной ферментом мембраны, который содержит поры, которые достаточно малы и не могут предотвратить транспорт и утечку макромолекул фермента из пористой поверхности мембраны в водный технологический поток контактирующий с ним, и границы водной (огранической фаз с противоположной поверхности мембраны, которая эа счет нерастворимости большинства ферментов в органических растворителях, предотвращает фермент от проникновения внутрь, и таким образом, не позволяет ферменту просачиваться из мембраны в органический технологический поток, Такую мембрану можно активировать ферментом путем ультрафильтрации через нее водного раствора этого фермента, причем таким образом в пористые мембраны происходит включение значительного количества активного фермента. Дополнительным преимуществом такого способа активации ферментом является его обратимость, т, е. деактивировать фермент можно просто удалив его иэ мембраны операцией обратной промывки, за счет чего облегчается периодическое обновление ферментного катализатора.

Альтернативным предпочтительным подходом к активации мембран ферментом для использования в процессах с многофазными и зкстрактивными мембранными реакторами является подход, OGHOBGHHblA на образовании динамических фермент-гельполяриэованных мембран наверху поверхности ультрафильтрационных мембран или мембран гельного типа, которые используют, например, для гемодиализа и гемофильтрации.

Мембраны для диалиэа (ультрафильтрации состоят из регенерированной целлюлозы или гидрофильных полимеров на основе полиакрилонитрила или гидрофильных полимепов и сополимеров на основе полиакрилонитрила; и они являются наиболее предпочтительными. Хотя такие мембраны являются мелкопористыми и следовательно, водно-проницаемыми, причем эффективный размер поверхности пор, пригодный для использования, слишком

° мал, чтобы вместить фермент. Однако было продемонстрировано, что такие мембраны можно эффективно покрывать ферментами, просто проводя ультрафильтрацию водного раствора фермента через мембрану, при этом остается слой концентрированного ферментного геля на поверхности мембранной пленки или волокна. Если теперь привести в контакт органический технологический поток с поверхностью активированной таким образом мембраны, слой ферментного геля будет иметь тенденцию оставаться на месте, на поверхности мембраны, поскольку фермент практически нерастворим в органических растворителях, При модерниэации этой методики мы дополнительно стабилизировали поверхностный слой фермента или "динамически сформированную мембрану" химической сшивкой протеина фермента, 25

1825378

50

При работе многофаэного и экстрактивного мембранного реактора по способу изобретения, два технологических потока, один водный (или первый поток) и другой состоящий из несмешивающейся с водой органической жидкости или раствора (или второй жидкости) приводят в контакт с противоположными поверхностями активированной ферменто л мембраны. Обычно бывает предпочтительным, чтобы активированная ферментом мембрана была гидрофильной, и поэтому смачивалась бы водной фазой, которая с ней контактирует. так как ферменты обычно более эффективны в водном окружении, нежели о органических растворителях.

Если мембрана в действительности, смачивгется водой, поток жидкости на каждой из сторон мембраны, предпочтительно поддерживают при слегка различных давлениях, так что небольшая положительная разность в давлениях существует поперек мембраны, причем органическая фаза поддерживается при (большем давлении) например, с помощью регулятора обратного давления или с помощью какого-либо другого устройства регулирующего давление).

При такого рода работе граница водной/органической фаз будет расположена на поверхности мембраны, с которой контактирует органический технологический поток, и это положение будет стабильным.

Ультрафильтрация водного раствора через мембрану будет предотвращаться разностью давлений (то есть органика — водная фаза), но гидрофильность активированной ферментом мембраны обеспечит предпочтительное смачивание мембраны водной фазой. Основным ограничением величины разности давлений органики к водной фазе (отличным от требований к механической прочности мембраны) является ограничение, чтобы она не превышала интрузионного давления для проникновения в поры мембраны несмачивающей органической фазой, причем укаэанное давление интрузии P оценивается из уравнения Янга-Лапласа следующим образом:

P = (2 х у/Каор) х cos 0„ где у- межфазное натяжение между органической и водной фазами:

Rqpp эффективный радиус flop, а 4 углом контакта между тремя фазами (между материалом мембраны и контактирующими с ней потоками жидкостей), Обычно размеры пор мембран выбирают так. чтобы давление интрузии было. по крайней мере, несколько пси, предпочтительно по крайней мере 10 пси, для того, чтобы обеспечить удобное рабочее окно давления и обеспе5

45 чить стабильную работу активированной ферментом мембраны и ее роль в качестве сепаратора фаз.

Сырьевой поток, который несет исходные реагенты в мембранный модуль, и в контакт с вктивированной Ферментом мембраной, может быть либо органическим и несмешиввющимся с водой по природе (s этом случае процесс обычно называют

"многофазным" мембранным реакторным процессом). или он может быть водным (и в этом случае процесс обычно называют "экстрактивным"). Скорость сырьевого потока предпочтительно устанавливается таким образом, чтобы достичь нужной степени ферментативного превращения ключевого реагента (например, одного из стереоизомеров в рацемичвской сырьевой смеси, или ахирального предшественника целевого изомерного продукта). Скорость потока на противоположной стороне мембраны предпочтительно устанавливают так, чтобы обеспечить отведение одного из продуктов реакции ферментации в соответствующей концентрации.

Так. например, в многофазном мембранном процессе, когда реегент едва растворим в воде. но продукт реакции хорошо растворим, желательно поддерживать скорость продуктового потока относительно низкой для максимально возможной концентрации продукта в водной фазе. При работе в таком режиме можно достичь обогащения продукта, т. е. отводить растворенный в водной фазе продукт при урОвне концентрации более высоком, нежели уровень концентрации предшественника в водной фазе. Это сводит к минимуму трудности любой из стадий последующего концентрирования и/или очистки продукта, которые могут оказаться необходимы ли. И наоборот, в экстрактивных мембранных реакторHblx системах, когда ключевой реагент растворим в воде, и необходимо удалять ингибирующие или нестабильные растворимые в органике продукты реакции путем экстрагирования их в органический растворитель, может оказаться желательным, чтобы органический технологический поток проходил активированную ферментом мембрану с относительно высокой скоростью.

Работа в таком режиме облегчает быстрое и эффективное удаление продукта иэ зоны ферментации. так что высокая скорость органического потока приводит к низким концентрациям продукта. Таким образом. выход и производительность реакции ферментации оказываются улучшенными.

Соотношение между скоростями технологических потоков водной и органической

1825378

5

35

45

55 фаэ также приводит к важному эффекту стереохимической чистоты продуктов, удаляемых иэ процесса. Так, например, в случае процессов в многофазных мембранных реакторах подавали рацемическую смесь нерастворимых в воде, растворимых в органике стереоизомеров, устанавливая скорость подачи органического потока так, чтобы очень высокая конверсия одного иэ стереоизомеров в рацемате обеспечила получение оптически чистого противоположного изомера (т, е. нереагирующего) в отходящем технологическом потоке. Кроме того, устанавливая скорость водного технологического потока такой, чтобы обеспечить значительное обогащение растворимого в воде продукта, достигают оптической чистоты этого водного потока, так как любой противоположный относительно малореакционноспособный изомер, который растворяется в водной фазе, не будет пси этом концентрироваться, Рециклизация по крайней мере одного из двух потоков, существующих в ферментном мембранном реакторе, может быть указана для обеспечения рацемизации нежелательного или "ненужного" изомера, Так, например, непрерывный процесс (например, получение оптически чистой кислоты или спирта из рацемического,сложного ,эфира), малярная скорость подачи рацемического реагента, подаваемого в процесс и молярная скорость удаления оптически очищенного продукта обычно равны в стационарных условиях работы, а скорость потока внутренней рециклизации будет обратно пропорциональна конверсии эа цикл целе ареоизомера. В частности. скорость рециклизуемого потока должна быть установлена такой, чтобы конверсия за цикл реакционноспособного стереоизомера учитывала молярную скорость подачи в реактор целевого стереоизомера в объединенном обрабатываемом и рециклиэуемом потоках, была равна молярной скорости удаления превращенного, очищенного стереоизомера в продуктовом потоке, В периодических процессах сырьевую смесь рацемического реагента загружают в систему однажды и рециклизуют в ферментативном мембранном реакторе и оборудовании для рацемизации (при необходимости) до тех пор, пока реакционноспособный материал (как начальный реакционноспособный стереоизомер и полученный из последующей рацемизации непрореагировавший изомеры) не исчерпается, Если стереоселекгивность фермента не абсолютна, тогда час-о возникает противоречие между стереохимической чистотой продукта и степенью рециклизации сырьевого материала. Так, например, чем более оптически чистый продукт будет получен при низких реакторных конверсиях, если ферменты демонстрируют активности (хотя и на различных уровнях) относительно обоих стереоизомеров в рацемическом сырье, то работа при низких конверсиях эа цикл обычно предусматривает высокие скорости внутренней рециклизации и значительную стоимость рацемизации и/или получения химических производных и технологического оборудования.

Для проведения рацемизации были разработаны и опубликованы конкретные процедуры для рацемизации (т. е. случайной конверсии вокруг хиральных атомов углерода)и эпимеризации (r. е. специфической инверсии хирального центра для создания

R-центра вместо S-центра, и наоборот) для многих хиральных соединений, и их обычно используют без существенных модификаций в способах многофазных и экстрактивных ферментных мембранных реакторов.

Так, например, многие хиральные соединения можно рацемиэовать за счет нагревания (например, подвергая их кипячению с обратным холодильником), либо в водном растворе, в виде чистых органических жидкостей или растворенных в органических растворителях. Скорости рацемиэации мож-, но часто повысить либо за счет использования неорганических и органических кислот (например, минеральных кислот, уксусного ангидрида и т. д.), либо оснований (например, КОН или триэтиламина), В тех случаях, когда здесь используют термин "рацемиэация" он означает, что включены процессы как случайной рацемизации, так и эпимеризации.

Потоки водного и органического технологических потоков могут двигаться либо в одном направлении, либо в противотоке, и способ с мембранным реактором можно вести либо в периодическом режиме (при желании с рециклизацией одного или обоих технологических потоков), либо в непрерывном режиме, либо в полупериодическом режиме, Детали конфигураций потоков могут влиять на ряд вторичных аспектов характеристик процессов с мембранными реакторами, включая чистоту продукта, конверсию реагента, фазовое разделение и регулирование рН. Нежелательно направлять поток органического или водного технологических потоков через активированную ферментом мембрану; скорее предпочтительно конвективный поток этих несмешивающихся технологически:; потоков направлять вдоль внешних поверхностей мембран. Реагенты

1825378

ЗО ральных продуктов, которые в них получа- ра ют. Так, например, если пптинески а подают, а продукты отводят, из активированной ферментом мембраны эа счет процессов диффузии в соответствии с их локальными концентрационными градиентами и в соответствии с их характером разделения водной/органической фаз.

Температуру мембранного реактора и водного и органического технологических потоков, подаваемых в реактор, следует поддерживать в интервале оптимальном для активности фермента и его стабильности. это же относится и к рН раствора. Там, где последовательные технологические процессы одного или обоих потоков, выходящих из мембранного реактора, диктуют это (например, для осуществления рацемизации в линии, или других химических реакции "посторонних" или нежелательных иэомеров в рацемической смеси стереоизомеров для осуществления возможности их рециклиэации в процесс) температуры, рН, и другие характеристики технологического потока, можна устанавливать вне пределов, необходимых для эффективной работы ферментов. В этом случае такие потоки следует возвращать к их исходным условиям рН или температур перед подачей обратно в сам мембранный реактор. Это проиллюстрировано в способе с экстрактивным мембранным реактором, где исходный органический технологический поток, содержащий R-напроксеновый сложный эфир, подвергают контактированию с водным раствором основания, что облегчает рацемизацию и химический гидролиз сложного эфира, причем получаемый водный поток, содержащий изомеры рацемической напроксеновой кислоты, затем подкисляют и рециклизуют.

В идеальных условиях "ненужный" изомер в рацемической смеси спонтанно рацемиэуется в условиях ферментативной реакции, и в этом случае можно избежать дополнительных стадий процесса и установки дополнительного оборудования для рацемизации и рециклизации, Так происходит в процессах получения оптически очищенных аминокислот и аминоамидов; здесь предшественники гидантоина и аминонитрила рацемизируются спонтанно.

Дополнительные технологические стадии (например, повторное проведение процесса с мембранным реактором, рециклизацию рацемической смеси жидкости и очистку непревращенных реагентов и/или продуктов (могут улучшить эффективность процессов с многофазными) зкстрактивными мембранными реакторами, и химическую и сте реохимичес кую чистоту хи5

55 разделенный продукт покидает многофазный ферментный мембранный реактор в виде водного раствора соли карбоновой кислоты, (например, напроксен) этот водный технологический поток можно прокачивать в резервуар, подкислять минеральной кислотои для осаждения кислоты из раствора в чистом виде. В другом варианте, подкисленный поодукт можно экстрагировать в органический растворитель в результате обычных операций экстракции растворителем, причем кислоту затем выделяют и очищают, испаряя летучий органический растворитель и проводят кристаллизацию полученной разделенной кислоты. Если оптически очищенный растворимый в органике продукт существует в мембранном реакторе в органическом технологическом потоке в форме чистоты органической жидкости (например, R-глицидилдбутирата) или в виде раствора в летучем органическом растворителе, продукт можно далее очистить перегонкой или испарением растворителя. Далее, выделяются небольшие количества R-глицидилбутиратных примесей в водном технологическом потоке, покидающем многофазный мембранный реактор, где водный поток подвергают экстракции растворителем для разделения и выделения предпочтительно растворимого в органике сложного эфира бутирата иэ больших количеств имеющихся воднорастворимых изомеров глицидола.

В том случае„когда оптически чистые материалы, получаемые в ферментном мембранном реакторе, являются промежуточными соединениями, а не целевым финальным продуктом, могут понадобиться последующие химические реакции и стадии очистки продукта. Промежуточные продукты соответственно подвергвют кислотному гидролизу для выделения целевой Д аминокислоты в химическом и стереохимическом чистом виде.

В применении изобретения к разделению рацемических смесей воднонерастворимых реагентов фермент, заключенный или каким-либо образом иммобилизованный на мембране или внутри нее, выбираю так, чтобы он демонстрировал максимальную стереоселективность в биоконверсии одного или более, но не всех конкретных оптических изомеров, присутствующих в сырьевой смеси. Взаимодействие плохо растворимых в воде иэомеров по крайней мере с одним существенно более воднорастворимым продуктом реакции катализируется ферментом внутри мембраны, и этот створимый в воде продукт отводят затем водном технологическом потоке с относи31

1825378

55 тельно высокой степенью оптической чистоты, В то же время, сырьевал смесь изомеров обедняется этим конкретным оптическим изомером, что служит в качестве лучшего субстрата для стереоселективнога фермента, и таким образом, отходящий органический сырьевой поток может быть одновременно оптически очищен и обогащен нереакционноспосабным изомером со стереоконфигурацией, противоположной стереоконфигурации продукта в водной фазе.

В итоге смесь R u S оптических изомеров в органической фазе разделяется на два технологических потока, один из которых, то есть органический поток продукта, содержит непревращенный лиофильный изомер, присутствующий в исходном сырьевом потоке, тогда как водный поток содер>кит относительно растворимый в воде продукт реакции ферментации, характеризующийся обратной стереохимической конфигурацией. Таким образом, сырьевой поток, содержащий смесь как R так и $ оптических изомеров, обрабатывают таким образом, что получают два "продуктовьх" потока, один из которых обогащен материалом с R (или $) конфигурацией, тогда как другой oGoгащен материалом с S (или R) конфигурацией. Полные выходы целевых энантиомеров продукта можно далее увеличить путем рацемизации материала в одном из отходящих потоков, с последующей рециклизацией его к началу процесса разделения, На практике применения многофазного мембранного реактора изобретения для стереохимической очистки хирального сложного эфира или кислоты, в мембрану вводят предпочтительно, липазу или эстеразу, причем с противоположных сторон с мембраной контактируют подаваемые в противоположном направлении потоки водного раствора, (обычно содержащего низкие концентрации буфера) и органического растворителя, содержащего рацемическую смесь плохо растворимых в воде стереоизомеров реагента — эфира. Так как органическая кислота достаточно растварима в водном растворе, но не в органическом растворителе, и так как характеристики растворимости органического сложного эфира полностью противоположны, оптически очищенный продукт — кислота может быть удален из многофазного мембранного реактора в водном технологическом потоке. предпочтительно в высокой концентрации (например, используя малую скорость водного потока), тогда как относительно нереакционно способный стереоизомер рацемической сложноэфирнай сырьевой смеси будет преимущественно оставаться в органическом потоке. Выделение и обогащение продукта осуществляются при рабате реактора с органическими растворителями, которые обеспечивают оптимальную селективнасть разделения между реагентами и продуктами, и высокими отношениями органика/водная фаза, что облегчает концентрирование продукта в водном технологическом потоке.

С одной стороны, если этот менее ферментативно реакционно-способный сложный эфир имеет "верную", т, е. биологическиактивную/стереохимическую конфигурацию, его можно отводить из процесса в органической фазе и выделять; если нужна кислотная форма изомера, оптически очищенный сложный эфир можно химически гидролизовать до полученил оптически очищенной кислоты s виде целевого продукта. Тем временем, полученную карбоновую кислоту (и спирт) в водной фазе, обедненную материалом с целевой стереохимической конфигурацией и поэтому обогащенной ненужным материалом, можно необязательно реэтерифиаировать и создать условия для рацемизации да рециклизации в процесс, С другой стороны, если "правильную" стереохимическую конфигурацию имеет более ферментативно ре-. акционноспособный сложный эфир, целевой продукт будет в форме оптически очищенной кислоты, которую можно выделить и химически снова превратить в соответствующей оптически-очищенное сло>кноэфирное производное, при желании, в условиях ре-этерификации без рацемизации.

Итак, в описанном многофазном мембранном реакторе разделяется смесь R u S сложных эфиров в органичекой фазе, причем органический поток, содержащий непревращенный стереоизомер лиофильного сложного эфира, присутствует в исходном сирьевом потоке, а водный поток, содержащий относительно растворимый в воде изомер кислоты, обладает противоположной стереахимическай конфигурацией. Таким обаазом, сырьевой поток, содержащий смесь как 8-, так и S-сложных эфиров, обрабатывают так, что получают два продуктовых" потока, один из которых обогащен материалом с R конфигурацией, тогда как другой обогащен материалом с S конфигурацией. Если фермент активен относительно $ формы сложного эфира и если

R-изомер является целевым продуктом, тогда ан будет выделен из атходягце;-о органического техH0логичесKî а пот; а, либо

1025378

34 непосредственно в форме R сложного эфира, либо косвенно в виде R-кислоты, после химического гидролиза. Если нужен S изомер, тогда материал с этой стереохимической конфигурацией можно выделить из водного технологического потока либо непосредственно в виде S-кислоты, либо косвенно, в виде S-сложного эфира, с последующей ре-этерификацией разделенной кислоты в условиях. не приводящих к рацемизации, что позволяет сохранить его стереохимию, 8 процессе с многофазным ферментным мембранным реактором для разделения рацемических сложных эфиров и кислот хирэльный центр находится в кислотном фрагменте, Однако многофазный ферментный мембранный реактор такого типа можно также испольэовать для оптического разделения рацемических сложных эфиров и спиртов в том случае, когда хиральный атом углерода находится в спиртовом фрагменте; в этих ситуациях спирт может быть предпочтительно растворим либо в водной фазе, либо в органике. Когда спирт является хиральным спиртом и растворим преимущественно в органике, тогда разделение рацемического сложного эфира (R-глицидилбутирата), когда спиртовая компонента является хиральной, но премущественно воднорастворимой.

В процессах с экстрактивным ферментным мембранным реактором для разделения рацем ической сырьевой смеси воднорастворимых кислот и сопутствующего получения потоков оптически очищенных водной кислоты и органического, содержащего сложный эфир, хиральный центр остается скорее в кислотном фрагменте, а не.в спиртовом. При работе стереоселективный фермент, способный катализировать реакцию этерификации (например, липаза или эстераза), заключен внутри или иммобилизован на разделяющей фазы мембране, причем ее противоположные поверхности контактируют с двумя противоположными потоками, причем первый является водным сырьевым раствором. содержащим рацемическую смесь растворимых в воде и не растворимых в органике кислот, а второй поток является не смешивающимся с водой органическим растворителем, способным экстрагировать сложноэфирный продукт реакции. Скорость органического экстрагирующего потока поддерживает достаточно высокой с тем, чтобы сохранить концентрацию в водной фазе ингибирующего сложного эфира весьма низкой. Таким образом, неблагоприятную с точки зрения термодинамики ингибирующую продукт биоконвер5

15

40

55 сию кислоты b сложный эфир 8 водной среде можно вести с высокой конверсией и с разумной производительностью.

В зависимости от стереоселективности фермента (т. е. является ли фермент более активным при синтезе R или $-формы сложного эфира) либо R (либо S) сложный эфир преимущественно удаляют из экстрактивного ферментного мембранного реактора е органическую фазу. Этот органический продуктовый поток содержит относительно мапо S (или R) материала за счет R (или S) стереоселективности фермента и за счет слабой растворимости в органической фазе кислотных стереоизомеров. В то же время, водный продуктовый поток обедняется R (или S) кислотой, которая была ферментативно превращена в сложный эфир, и этот водный поток поэтому соответствующим образом оптически обогащен S (или R) стереоизомером кислоты. Кэк объяснялось более подробно в связи с описанием варианта многофазного мембранного реактора изобретения, представляется одинаковая воэможность для функционирования экстрактивного мембранного реактора в режиме этерификации, используя фермент с либо R либо S селективностью, с тем, чтобы получить либо S- либо R-форму хиральной кислоты, спирта или сложного эфира. Это сопровождается объединением процесса с экстрактивным мембранным реактором с соответствующими химическими превращениями: получением производных, гидролизом, рацемизацией и/или выделением продукта как было подробно описано ранее.

Аналогичные эктрактивные мембранные реакторные процессы можно аналогичным образом применить к разделению или асимметричному синтезу хиральных соединений отличных от кислот, спиртов и сложных эфиров.

И, наконец, процессы с многофаэным и экстрактивным мембранным реактором, но без наличия нереакционноспособных стереоизомеров в сырье, можно также использовать для осуществления селективного превращения ахиральных органических соединений в очищенные стереоизомеры, особенно если ахиральный предшественник и хиральный продукт реакции ферментации растворимы в раличных фазах.

Если ахиральный предшественник плохо растворим в воде, его можно подавать в многофазный ферментный мембранный реактор, либо в виде чистой жидкости, либо в несмешивающемся с водой органическом растворе, который подлежит стереоселективному превращению при контакте с активированной ферментом мембраной в

1825378 преимущественно растворимый в воде продукт. Конкретное применение такого типа процессов с многофазными мембранными реакторами относится к стереоселективному гидролизу нерастворимых в воде симметричных диэфиров в хиральные растворимые в воде сложные эфиры кислот, что катализируется эстеразой свиной печени, В этом . применении ахиральный диэфирный реагент нужно подавать в многофазный мембранный реактор в органической фазе, а хиральный и оптически очищенный сложный эфир кислоты отводить в водной фазе с противоположной стороны, разделяющей фазы мембраны.

Если ахиральный предшественник преимущественно растворим в воде, и хиральный продукт растворим в органике, ахиральный реагент можно подавать в эктрактивный ферментативный мембранный реактор в виде водного раствора в контакте с одной поверхностью, активированной ферментом мембраны, Полученный растворимый в органике продукт реакции последовательно экстрагируют в поток органического растворителя в контакте с противоположной поверхностью мембраны, и его удаляют из реактора в органическом потоке. Примером применения такого типа системы экстрактивного мембранного реактора является асимметричный синтез растворимого в органике продукт реакции последовательно экстрагируют в поток органического растворителя в контакте с противоположной поверхностью мембраны. и его удаляют из реактора в органическом потаке. Примером применения такого системы эктсрактивного мембранного реактора является асимметричный синтез растворимого в органике Д-мгнделонитрила из ахирального предшественника, а именно, чистого бензальдегида и водного метанального раствора цианистого водорода, используя Д-оксинитрилазу (Е. С, 4. 1. 2, 10) в качестве биакатализатора, Этот фермент катализирует асимметричное стереоселективное присоединение HCN через карбонильную двойную связь бенэальдегида.

Другие многофазные и зкстрактивные ферментные мембранные реакторы, основанные на стереоселективности ферментов аммиаклазы и трансаминазы. пригодны для синтеза оптически очищенных аминокислот иэ ахиральных предшественников, таких как транс-коричная кислота и аммиак (т. е, ахиральных предшественников Z-фенилаланина) и альфа-кето кислот, особенно, если комплексующие агенты используют для lloвышения растворимастей в органической фазе получаемых аминокислот. При получении фенилаланина с катализатором аммиаклазой, аммиак асимметрично и стереоселективно присоединяют через углерод-углерод двойную связь тран-коричной кислоты.

5 Поэтому изобретение обеспечивает эффективные средства для ферментативного разделения или ферментативного синтеза хиральных амидов., кислот, спиртов, аминов, нитрилов, гадантоинов и других ценных

10 хиральных соединений в многофазных и зкстрактивных мембранных ферментативных реакторных системах. Вышеприведенное описание работы этих ферментативных мембранных реакторов и следующее далее

15 описание примеров предлагают только широту потенциального применения настоящего изобретения при получении стереохимически чистых соединений, и они никоим образом не ограничивают объем на20 стоящего изобретения или тип работы, предназначенный для этих многофазных и эктрактивных реакторных процессов.

Далее приводятся примеры применения изобретения и его элементов (буква,и, 25 если использована одна или в качестве приставки, означает "микро").

Пример 1. Подготавливают многофазный биореактор, используя 0,85см обычного мембранного модуля, устойчивого к

30 растворителю, изготовленного из полиакрилонитрила; проводят ультрафильтрацию полых волокон из гемофильтра Асахи Медикал

Компани PAN-200. Фермент, липаэа, полученная из Candlda cyllndracea была эакуп35 лена в Geuzyme Corporation, специфическая активность 10500 ед/мг/1 ед - 1 мкмоль жирной кислоты, высвобождаемой из оливкового масла за счет при 37 С и рН 7,7). Как известно, этот фермент гидролизует стере40 оселективно сложные эфиры напроексана (2 (6-метокси-2-фатий)пропионовой кислоты).

3 r липазы растворяют в%00 мл-дистиллированной воды; этот раствор рециркулируют ультрафильтрацией иэ оболочкИ в

45 отверстие и обратно в резервуар в течение

30 мин, Затем ультрафильтрат собирают до опустошения резервуара, и метилизобутилкетон (M18K) прокачиеают затем в оболочку и рециркулируют со скоростью 400-450

50 мл/мин при давлении 5-7 пси со стороны оболочки для полного удаления остатков раствора фермента из оболочки. Образец ультрафильтрата анализируют на триацетин, и он демонстрирует менее 5 остатка ферментативной активности по сравнению с исходным раствором, 200 мл калийфовфатного буфера (25 мМ, рН 8,5) рециркулируют через оболочку со скоростью 350-400 мл/мин.

Синтезируют метиловый сложный эфир рацемического Напроксена, Следует отме37

1825378

38 тить, что растворимость в воде этого сложного эфира приблизительно 0,1 — 0,2 мМ, тогда как его растворимость в MIKB около 1.5

М. 42 r твердого сложного эфира Напроксена медленно добавляют к MIKB для достижения окончательной концентрации 0,75 М при полном объеме органического вещества примерно 225 мл рН устанавливают при

8,5 "=0,01, причем используют 0,25 M NaOK в виде Вгйгпап Dosimat 665-рН-$тат, Реакцию ведут, периодически отводя водный поток и определяя концентрацию

Напроксена спектрофотометрически (Езго-1250). Средняя скорость в первые 45 мин составляет 35 мк моль/ч. Гидролитическая скорость для следующих 36 ч находится в интервале от 9 до 14 мкмоль/ч, Пример 2, Реактор подготавливают по способу примера 1 (для Напроксена), используя практически такую же загрузку фермента, 3 г липаэы Candida (Genzyme

Corporation) ультрафильтруют из оболочки в отверстие, затем фермент промывают 2-3 л дистиллированной воды и 1 л калийфосфатного буфера (0,10 М, рН 7,7). Затем содержимое модуля сливают, Синтезируют сложный трифторэтиловый эфир рацемического Ибупрофена (2-)4изобутилфенил(-пропионовой кислоты).

Растворимость в воде этого сложного эфира примерно 0,4 мМ. 265 r жидкого сложного эфира Ибупрофена закачивают в оболочку реактора и рециркулируют со скоростью

400-450 мл/мнн при давлении на выходе реактора 5-8 пси. Органический растворитель не нужен, так как субстрат уже является несмешивающейся с водой жидкостью.

Фосфатный буфер немедленно прокачивают в отверстие и рециркулируют со скоростью 400-450 мл/мин. Водный объем составляет около 650 мл, и рН регулируют при 7,7 0,01 1,0 М NaOH, 3а реакцией следят по получению кислоты на основании данных по титрованию гидроксида. Средняя гидролитическая скорость в первые 60 минут составляет 160 мкмоль/мин. Водый буфер заменяют через

76 мин и подкисляют до рН 2 концентрированной HCI в присутствии около 200 мл хлороформа. Этот хлороформ промывают насыщенным раствором натрийхлорида и сушат сульфатом магния. Раствор ибупрофена выпаривают досуха и выделяют 2,13 r неочищенного ибупрофена. За следующие

76 ч средняя скорость гидролиза составляет

21 мкмоль/мин по данным титрования. Это соответствует около 9,8% конверсии кислоты. За это время водный резервуар обновляют 6 раз, получая около 15 r ибупрофена.

Этот материал перекристаллизовывают иэ

55 лочку в течение 3 ч. Через 3 ч оболочку и отверстие промывают несколькими обьемами дистиллированной воды. Оболочку заполняют 275 мл оливкового масла и рециклизуют со скоростью 340 мл/мин при гексана, Fro температура плавления 5153 С (литературное значение для (Я)-Ибупрофена 50-52 С, а для рацемичэского

Ибупрофена 75-77 С). Удельное оптическое вращение этого материала (а) =+ 55.0 (с=1, С2Н5ОН).

Пример 3. Реактор приготавливают с использованием гемофильтра Асахи Медикал Компани (модель PAN l50), содержащего 1 м площади мембраны, В качестве фермента используют Candlda суНМгасеа линазу (Сигма Кемикал Ко, удельная активность 700 ед/мг). Как сообщают, этот фермент" не имеет позиционной специфичности; следовательно, он должен гидролизовать такие триглицериды как оливковое масло, до свободных кислот и глицерина. Раствор фермента приготавливают, растворяя 5 г липазы Candlda в 1 л дистиллированной воды. Этот раствор рециркулируют ультрафильтрацией из оболочки в отверстие и обратно в резервуар 90 мин, Затем ультрафильтрат заменяют гексаном, чтобы вытеснить остатки воды из оболочки, и гексан смывают из оболочки несколькими объемами оливкового масла (VVeloh. Holmes and Clark Со.), и отверстие промывают 400 мл дистиллированной воды.

Оливковое масло рециркулируют через оболочку со скоростью 250 мл/мин при давлении на входе 8-12 пси, а полный объем составляет около 250 мл. Водную фазу рециркулируют со скоростью 80 мл/мин при полном объеме 270 мл. Весь модуль и оба резервуара погружены в водяную баню при

37 С.

Образцы масла периодически отбирают, и анализируют на содержание свободных жирных кислот путем титрования 50 мМ этанолъной гидроокиси натрия. После 24 ч работы без эмульсии определяют содержание в масляной фазе 3,45 ммолей кислоты на Г, что соответствует около 97 $ конварсии триглицерида. рН водной фазы постепенно падает эа цикл от 6,4 до 5,7 и окончательная концентрация глицерина со ставляет около 8 Я, flo данным рефрактометрии.

Пример 4. Реактор подготавливают, как описано в предшествующем примере. используя практически ту же процедуру загрузки, эа исключением того, что используют 3,8 r Candlda липвэы. Затем этот фермент сшивают в мембране за счет рециркуляции

2.5 % раствора глютаральдегида через обо39

1825378

20

55 давлении на входе 8 пси, Обьем водной фазы составляет 275 мл, и ее рециркулируют со скоростью 80 мл/мин.

Через 22 ч безэмульсионной работы при комнатной температуре образец органической фазы содержит 1,16 мМ свободной жирной кислоты на грамм, что соответствует 33 конверсии оливкового масла, Пример 5. Реактор подготавливают. используя регенерированную целлюлозу, полые волокна почки поставляемые Асахи

Медикал Ко (модель AM100L), содержащие

0,9 м площади мембраны. Раствор липазы

СапбЫа приготавливают, растворяя 3 г фермента в 500 мл 0,1 M натрийхлорида. Раствор фермента рециркулирует через отверстие обратно в резервуар со скоростью 70 мл/мин, а пермеат собирают из оболочки до тех пор, пока не опустошается резервуар. Фермент отторгается мембраной (молекулярный вес отторгаемого примерно 1000) и собирается на мембране в виде слоя геля. Затем этот фермент сшивают, используя 2,57 глутаральдегид, как описано в вышеуказанном примере

Спустя 3 ч глутаральдегид с лывают несколькими обьемами дистиллированной воды. Затем отверстие промывают несколькими объемами оливкового масла для удаления остатков воды. Оливковое .масло рециркулирует в отверстие со скоростью 40 мл/мин при давлении на входе 8 пси, и полный объем составляет около 200 мл. Водная фаза рециркулирует со скоростью 20 мл/мин при полно л объеме 200 мл.

Спустя 4 ч безэ лульсионной работы определяют содержание в масле 0,35 мМ кислоты на 1 г, что соответствует 10 Д конверсии оливкового масла.

Пример 6. Приготавливают раствор фермента, растворяют 50 г липазы Candid (мол м. 100000; Сигма Кемикал Со Кат. М

1754) в 1,25 л воды, а затем фильтруя этот раствор для удаления нерастворимого материала. Известно, что этот фермент гидролизует большое количество органических сложных эфиров, и среди них метиловый эфир феноксиацетата и амилацетат.

Фермент загружают в обычный мембранный модуль с поверхностью 0,85 м, устойчивый к растворителям, изготовленный иэ анизотропных полиакрилонитрильных (ПАН) полых волокон, взятых из гемофильтра PAN-200 (Асахи Медикал Ко). Морфология этой мембраны такова, что ее можно описать как асимметричное гидрофильное полое волокно с внутренней оболочкой, характеризующееся 90 (, удерживания протеина с мол. м. более 50000, Раствор фермента рециркулирует со стороны оболочки в сТорону отверстия и обратно в резервуар для раствора в режиме ультрафильтрации. Во время процесса загрузки фермента разность давлений между отделениями оболочки и отверстия поддерживают 8 пси, устанавливая соответствующую скорость ультрафильтрации (обычно между 200 и 20 мл/мин), Процедура заканчивается за 1 ч.

Исходная и окончательная активности раствора приведены в табл, 1.

После загрузки фермента в реактор начинают рециркуляцию 1140 мл сложного метилового эфира феноксиацетата на сторону оболочки, Растворимость этого эфира в воде приблизительно 25 мМ. Скорость рециркуляции составялет 150 мл/мин, а среднее давление на отделение оболочки поддерживают 6,5 пси, регулируя дроссельную заслонку со стороны оболочки. Со стороны отверстия рециркулируют 2 л 0,1 М МаНСОз со скоростью 300 мл/мин. рН водного резервуара поддерживают 7,8, добавляя 50

МаОН. Реактор функционирует непрерывно в течение пяти дней с ежедневной заменой буферного раствора и раствора продуктов реакции в резервуаре с водной фазой. В течение всего эксперимента ферментный анализ содержимого буферного резервуара не дает определяемой активности фермента в водной фазе.

За ходом реакции и ее скоростью следят по расходу каустика и наблюдению за уровнем органической фазы в резервуаре. В начале эксперимента скорость гидролиза сложного эфира составляет 3000 мкмолей/мин, а в конце — 1500 мкмолей/мин, Полученную в водном резервуаре феноксиуксусную кислоту затем выделяют, подкисляя до рН 1 концентрированной HCI u фильтруют твердый осадок, После сушки твердую часть титруют и получают 96,3 7 кислоты. Образец высушенного твердого продукта растворяют в смеси хлороформа и воды с последующей сушкой/выпариванием хлороформовой фазы. Оставшуюся твердую часть с этой стадии очистки титруют и определяют содержание 90,5 чистоты; Т. пл. 98 — 103" С (точка плавления феноксиуксусной кислоты 98 — 100 С). Полное количество выделенной феноксиуксусной кислоты

0,953 кг, Пример 7. Используя мембранный модуль, описанный в примере 6, и оставив фермент в мембране, проводят гидролиз амилацетата. Растворимость этого сложного эфира в воде приблизительно 13 мМ. Рециркуляцию 400 мл амилацетата со стороны оболочки начинают как раньше, скорость рециркуляции 150 мл/мин. а среднее давление в отделении оболочки подл;.рживают

4!!

82537В

6,5 пси. регулируя дроссельную заслонку на выходе со стороны оболочки. Со стороны отверстия рециркулирует 1 л 0,05 М йаНСОз со скоростью 300 мл/мин. рН водного резервуара поддерживают 7,8, добавляя 5.57

М NaOH, Скорость гидрозила амилацетата определяют 250 мкмолей/мин. После измерения скорости гидролиза амилацетата реакцию останавливают и систему промывают водой как со стороны отверстия, так и со стороны оболочки. Затем реактор промывают в обратном направлении в течение !5 ч отфильтрованной водопроводной водой, которую подают со стороны отверстия, а отводят со стороны оболочки со скоростью 50

MR/ìèH, Таким же образом как и водопроводную воду в обратном направлении подают 2 л мочевины, и затем оба отделения промывают 4 л дистиллированной воды.

Скорость гидролиза амилацетата в реакторе измеряют точно также, как описано, за исключением того, что используют 25 мМ

NaOH, Скорость реакции составляет 6,8 мкмолей/мин, что соответствует 3 исходной активности, Пример 8. После завершения процедуры регенерации мембраны, как описано в примере 7, в мембранный модуль загружают 20 г Candlda липазы (того же типа и в такой же концентрации, что и в примере 6).

В качестве субстрата используют амилацетат, и реактор работает в таком же режиме, который описан в примере 7. Скорость реакции определяют в 70 мкмолей/мин.

Пример 9. Подготавливают раствор фермента, растворяя 10,8 мл препарата эстеразы свиной печени (мол. м. 150000, 11 мг/мл, Сигма Кемикал Ко, Кат М Е 3128) в

300 мл 0,2 М фосфатного буфера, рН 8. Этот фермент, попадающий в категорию зстераз, гидролиэует этилбутират растворенный в воде, т. е. реакция является гомогенной и не требует наличия границы раздела органика/вода.

Фермент загружают в тот же самый мембранный модуль, что описан в примере

6, рецир кули руя раствор фермента со стороны оболочки в сторону отверстия и обратно в резервуар для раствора в режиме ультрафильтрации.

8о время процесса загрузки разность давлений между отделениями оболочки и отверстия поддерживают 9,5 пси, устанавливая скорость ультрафильтрации (обычно между 200 и 20 млlмин). Процедура завершается эа 1 ч. Исходная и окончательная активности раствора фермента указаны в табл. 2.

После загрузки фермента в реактор начинают рециркуляцию 500 мл этилбутирата

55 со стороны оболочки, Растворимость этого сложного эфира в воде составляет 59 мМ.

Скорость рециркуляции 500 мл/мин, а среднее давление в отделении оболочки поддерживают 6,5 пси, регулируя дроссельную заслонку на выходе иэ отделения оболочки.

Со стороны отверстия рециркулирует 1 л 0,2

М фосфатного буфера рН 8 со скорос ью 500 мл/мин. рН водного резервуара поддерживают 8 добавляя 6 М NaOH. Скорость гидролиза этилбутирата определяют 9600 мкмолей/мин. После определения скорости гидролиза этилбутирата, реакцию останавливают, и систему промывают водой как со стороны отверстия, так и со стороны оболочки, Фермент удаляют иэ реактора следующей процедурой: обратная промывка 6 л дистиллированной воды, поступающей со стороны отверстия и выходящей со стороны оболочки со скоростью 50 мл/мин; промывка с обоих сторон (оболочки и отверстия): 4л

1М NaCI; 500 мл 12 Я, (ИНф50д, 500 мл 8М мочевины; 2 л 1 M NaCI.

Скорость гидролиээ этилбутирата в реакторе определяют точно так же кэк описано ранее, эа исключением того, что используют 25 мМ NaOH, Скорость реакции определяют 30 мкмолей/мин, что соответствует 0.3 $ исходной активности в модуле.

Пример 10. Ферментный раствор химотрипсина (мол. м. 23000, Сигма Кемикал Ко Кат. М С 4129 (приготавливают, растворяя 0,5 г фермента в 1 л 0,1 М КгНРО!) 1

М NaCI, рН 7,8. Этот раствор рециккулирует со стороны оболочки 1 м Asahl PAN-150 гемофильтрэ (Асахи Медикал Ко) со скоростью 50 мл/мин в течение 1 ч. Так как поток ферментного раствора со стороны оболочки в сторону отверстия отсутствуег, фермент загружают в мембрану только в диффузионном режиме, После смачивания со стороны оболочки раствором фермента, начинают рециркуляцию 1 л силиконового масла (Petrarch Systems Ое.) со стороны оболочки, поддерживая давление в этом отделении 9 пси. 0,2 мМ раствор N-бенэоил-L-тирозин этилового сложного эфира (ВТЕ Е, Сигма Кемикал Ко) в О,! М К НРОя) 1 М NaCI pH 7,8 пропускают затем со стороны отверстия модуля со скоростью noroxa 1 л/мин. Активность модуля рассчитывают, измеряя количество БТ кислоты, которая присутствует в водном потоке, покидающем реактор.

Активность подуля определяют 80 мкмолей/мин. Затем иэ мембранного модуля сливают растворитель и буфер, и промывают в обратном направлении 10 л 0,1 М фосфатного буфера. Активность мембранного модуля измеряют так же, как было описано

1825378

После загрузки фермента в реактор начинают рециркуляцию 500 мл 40 мМ ВТЕЕ в н-октаноле (Алдрич Ко) со стороны оболочки. Скорость рециркуляции 500 мл/мин, а среднее давление в отделении оболочки поддерживают 6,5 пси, регулируя дроссельную заслонку на входе отделения оболочки.

Со стороны отверстий 1 л 0,1 M КгНРО /1 М

NaCI буфера рН 7,8 рециркулируют со скоростью 500 мл/мин. рН водного резервуара поддерживают 7,8, добавляя 1 M NaOH. Ha50 ранее, за исключением того, что ВТЕЕ раствор прокачивают в реактор со скоростью 53 мл/мин. Активность мембранного модуля составляет 4 мкмолей/мин, что соответствует 5 исходной активности. 5

Пример 11. Раствор фермента получают при растворении 100 мг того же химотрипсина, который был использован в. примере 10, в 500 мл 0,1 M фосфатного буфера, рН 7. Фермент загружают на 1 м AS "0

AHI РАН-150 гемофильтр, идентичный тому, который использовали в примере 10, рециркулируя раствор фермента со стороны оболочки в сторону отверстия и обратно в резервуар раствора в режиме ультрафильт- 15 рации. Процедуру завершают за 2,5 ч.

После загрузки в реактор фермента начинают рециркуляцию 1 л 10 мМ ВТЕЕ в амилацетате со стороны оболочки, Скорость рециркуляции составляет 10 мл/мин, à 20 среднее давление в отделении оболочки поддерживают 6,5 пси, регулируя дроссельную заслонку на выходе иэ отделения оболочки. Со стороны отверстия 200 мл 2 мМ фосфатного буфера, рН 7,8, рециркулирует 25 со скоростью 250 мл/мин. рН водного резервуара поддерживают 7,8, добавляя 1 М

Na0H. Начальная скорость гидролиза BTEE определена как 45 мкмолей/мин.

Пример 12. Для того чтобы увеличить 30 количество химотрипсина, которое удерживается полыми волокнами, использованными в примерах 6-11, мол. м, фермента повышают эа счет сшивки с бычьим сывороточным альбумином (Сигма Кемикал Ко), 35

Кат. М А 4503), используя глутаральдегид в соответствии с обычной схемой такой реакции. По данным гель-проникшей хроматографии более 80 коньюгата протеина имеет молекулярный вес более 100000, Ко- 4о нечный раствор фермента содержит 1 л 0,1

М КгНР04/1л NaCI рН 7,8сактивностью

ВТЕЕ 10 мкмолей/мин-мл. Фермент загружают на 1 м AS AHI PAN-150 гемофильтр идентичный фильтру примера 10, подавая в 45 режиме ультрафильтрации один раз раствор со стороны оболочки в сторону отверстия со скоростью потока 20 мл/ мин. чальная скорость гидролиэа ВТЕЕ определена 700 мкмолей/мин.

Пример 13. Рацемический сложный эфир октилохлорпропионата получают, подвергая взаимодействию 130 r (1 моль) н-октанола со 127 г (1 моль) 2-хлорпропионилхлорида в 240 мл пиридина и 50 мл тетрагидрофурана. Реакцию проводят эа 24, после чего раствор промывают 500 мл 1 н.

НС!; насыщенным раствором йаНСОз и насыщенным раствором NaCI. Органическую фазу сушат над MgS04. Полный вес полученного октилового сложного эфира 2-хлорпропионата составляет 210 r (0,96 моля).

Приготавливают раствор фермента, растворяя 30 г липазы Candlda (мол. м.

100000, Сигма Кемикал Ко Кат. М L 1754) в

0,75 мл воды, а затем фильтруя этот раствор для удаления нерастворимого материала.

Фермент загружают на 0,85 м иэготовленг ной обычным с особом мембраны устойчивой к растворителю иэ анизотропного полиакрилонитрильного (PAN) полого волокна, взятого из PAN-200 гемофильтра (АСАХИ Медикал Ко), Морфология этой мембраны такова, что ее можно описать как асимметричную гидрофильную внутри оболочки полого волокна, характеризующуюся

90 7; удержанием протеина с молекулярным весом более 50000. Ферментный раствор рециркулирует со стороны оболочки в сторону отверстия и обратно в резервуар раствора в режиме ультрафильтрации. Во время процесса загрузки разность давлений между отделениями оболочки и отверстия поддерживают 8 пси, регулируя скорость ультрафильтрации (обычно между

200 и 20 мл/мин). Процедура завершается за час.

После загрузки фермента в реактор начинают рециркуляцию 210 r (0,96 моля) рацемического сложного октилового эфира

2-хлорпропионата со стороны оболочки, Растворимость этого эфира в воде приблизительно 1,2 мМ. Скорость рециркуляции

400 мл/мин, а среднее давление в отделении оболочки поддерживают 6 5 пси за счет регулировки дроссельной заслонки со стороны оболочки. Со стороны отверстия рециркулирует 1 л 0,05 М КгР04 со скоростью

400 мл/мин, рН водного резервуара поддерживают 7 добавляя 1 M NaOH. Реактор работает непрерывно 6,8 дня.

За ходом и скоростью реакции следят по расходу каустика. В начале эксперимента скорость гидролиза сложного эфира составляет 186 мкмолей/мин, а в конце — 25 мкмолей/мин. Эксперимент завершают, когда гирролизуется 41 $ исходного сложного эфира. Оптическое вращение окончатель1825378

55 биорвакторе, ной смеси эфиров (а) э - - 0,41 (с - 50, СНС!з), Исходный субстрат сложного эфира, подаваемый в реактор, не имел оптического вращения, Пример 14. Рацемический N-бензоилтирозинэтиловый сложный эфир получают, растворяя 25 г N-бенэоил-L-тироэинэтилового сложного эфира (Сигма Кемикал Ко) в 400 мл сухого этанола и добавляя

400 мл этанола, в котором предварительно было растворено 5,6 г натрия. Этот раствор перемешивают в течение ночи в атмосфере аргона. Затем его смешивают с 1 л воды и эквивалентным количеством HCI. необходимым для нейтрализации образующегося

NaOH иэ Na. Затем этот раствор экстрагируют хлороформом, хлороформ промывают бикарбонатным буфером и сушат над

MgSO4, Затем хлороформ выпаривают, оставляя 14,2 г твердого продукта, с т. пл.

125-126 С, не обладающего оптическим вращением. Этот твердый продукт представляет собой рацемический ВТЕЕ (т, плавления для 1 ВТЕЕ 118-121 "С).

4 r Химотрипсина (Сигма Кемикал Ко) иммобилизуют в 1 M PAN-150 гемофильтра г (Асахи Медикал Ко) за счет адсорбирования фермента на полых волокнах, а затем сшивая фермент 2,5;(, раствором глутаральдегида в 0,05 M фосфатном буфере рН 7, После загрузки фермента в реактор, начинают рециркуляцию 1.13 л 29,8 мМ рацемического ВТЕЕ в растворе н-октанола со стороны оболочки. Скорость рециркуляции

400 мл/мин, а среднее давление в отделении оболочки поддерживают 6,5 пси с помощью дроссельной заслонки со стороны выхода. Со стороны отверстия рециркулирует 0,21 л 0,1 M КгРО со скоростью 400 мл/мин. рН водного резервуара поддерживают 7,8, добавляя NaOH, Реактор непреррывно функционирует 18 ч.

В заключении проводят анализ как органической, так и водной фазы, причем полученные результаты приведены в табл. 3.

fl р и м е р 15. 4 r Химотрипсина (Сигма

Кемикал Ко) иммобилизуют в 1 м PAN-150 г гемофильтра (Асахи Медикал Ко) за счет адсорбирования фермента на полых волокнах, а затем сшивают фермент 2,5 раствором глутаральдегида в 0,05 M фосфатном буфере с рН 7.

После загрузки фермента в реактор, начинают рециркуляцию 1л 2,86 MM рацемической АТЕЕ (Сигма Кемикал Ко) в н-октаноле со стороны оболочки. Скорость рециркуляции 400 мл/мин, а среднее давление в отделении оболочки поддерживают 6,5 flcH за счет дроссельной заслонки на выходе иэ него. Со стороны отверстия рециркулирует

0,15 л 0,1 М КгР04 со скоростью 400 мл/мин. рН водного резервуара поддерживают 7,8. добавляя NaOH. Реактоо работает непрерывно в течение ночи.

Зная количество расходуемого основания (1,43 ммоля) и коэффициент разделения между октанолом и водой (3) рассчитывают концентрации; результаты приведены в табл. 4.

Пример 16. 4 r Химотрипсина (Сигма

Кемикал Ко) иммобилизуют на 1 м PAN-150 гемофильтра (Асахи Медикал Ко) эа счет адсорбирования фермента на полых волокнах, а затем сшивают фермент 2,5 ф, раствором глутаральдегида в 0,05 М фосфатнсм буфере, рН 7.

После загрузки в реактор фермента начинают рециркуляцию 1,07л 37,7 мМ N-бензоил- L-тироэинэтилового сложного эфира (L-ВТЕ Е) в н-октаноле со стороны оболочки.

Скорость рециркуляции 500 мл/мин, а среднее давление в отделении оболочки поддерживают 6,5 пси с помощью дроссельной заслонки на выходе из него. Со стороны отверстия рециркулирует 0.19 л 0,1 М КгР04 со скоростью 500 мл/мин. рН водного резервуара поддерживают 7,8, добавляя

NaOH. За ходом реакции следят по расходу каустика, Попеременно отбирают образцы органической и водной фаз и проводят анализ на содержание ВТЕЕ и BT кислоты, Результаты эксперимента и выводы:

Полное время: 205 мин; начальная концентрация ВТЕЕ в органике 37,7 мМ; окончательная концентрация ВТЕЕ в органике

1,8 MM.

Полное количество гидролизованного

ВТЕЕ 38,41 ммоля.

Окончательная концентрация ВТ (продукт) в воде 187 мМ.

Полное количество ВТ (продукт) в воде:

35,5 ммолей.

Производительность реактора: 98 молей/ч - м .

В качестве контрольного эксперимента

1,1 л 40 мМ ВТЕЕ в октаноле смешивают с

0,11 л 1 M фосфатного буфера, рН 7,8, используя шетервнчатый насос для получения дисперсной фазы. Дисперсию эакачиввют в рециркуляционном режиме через отделение оболочки мембранного биореакторэ, причем со стороны отверстия поток отсутствует. Скорость потока дисперсии 500 мл/мин. Спустя 200 мин. Концентрация

ВТЕЕ в органической фазв составляет 19,4 мМ. Это соответствует 54 $ к оOнHвaеeр сc ии, которую достигают с тем же количеством времени в многофэзном мембранном

1825378

40

50

Пример 17, Приготавливают многофазный биореактор, используя 0,85 м обычz ного устойчивого к растворителю мембранного модуля, изготовленного иэ полиакрилонитрильных, ультрафильтрационных полых волокон PAN-200 гемофильтра (Асахи Медикал Ко). Фермент, липазу, полученную из свиной поджелудочной железы, закупают у Сигма Кемикал Ко (удельная активность 70 ед/г). Известно, что этот фермент гидролизует стереоселективно сложные эфиры глицидола (хирального спирта).

35 r липазы растворяют в 1 л дистиллированной воды. Фермент загружают в мембрану способом, описанным в примере 1.

Оболочку заполняют гексаном для удаления любых остатков воды. Отверстие заполняют

0,5 л калийфосфатного буфера (50 мМ, рН

7,8) и его рециркулируют со скоростью 250350 мл/мин.

Рацемический глицидилбутират синтезируют иэ бутирилхлорида и глицидола.

Растворимость в воде сложного эфира приблизительно 180 мМ. Гексан иэ оболочки сливают, и 425 жидкого сложного эфира закачивают в оболочку. Сложный эфир рециркулирует со скоростью 250/350 мл/мин при давлении на выходе 4 — 7 пси. рН буфера поддерживают 7,8 с помощью 9,93 М КОН.

Скорость реакции контролируют по расходу гидроокиси, Средняя скорость гидролиза для первых 36 мин 15300 мкмолей/мин, что соответствует 18,6 ( конверсии сложного эфира. Периодически отбирают образцы обоих фаз. Реакцию останавливают через 5,88 ч, что соответствует

74,7 конверсии. Средняя скоросгь гидролитической реакции за цикл составляет 6250 мкмолей/мин.

Органические образцы смешивают с простым эфиром, промывают бикарбонатом натрия, дистиллированной водой и натрийхлоридом, и сушат над сульфатом магния для удаления остатков масляной кислоты, глицидола и воды. Оптическое вращение конечного образца глицидилбутирола (a)p =

-25,2 (с-1, СНС!з), Пример 18. Рацемический бутил-2хлопропионатный сложный эфир получают при взаимодействии эквимолярных количеств рацемической 2-хлопропионовой кислоты с 1-бутанолом в присутствии кислоты и при непрерывном удалении воды аэеотропной перегонкой.

Раствор фермента приготавливают, растворяя 50 r липазы Candida (Сигма Кемикал Ко) в воде, а затем фильтруя раствор.

После этого фермент загружают в 0.85 м

2 обычного мембранного модуля устойчивого

5 10

35 к растворителю и аналогичного описанному в примере 1 способом, описанным в примере 13.

После загрузки фермента в реактор начинают рециркуляцию 500 г (3,03 моля) R, Я-бутил-2-хлорпропионатного сложного эфира со стороны оболочки. Скорость рециркуляции 300 мл/мин, а среднее давление в отделении оболочки поддерживают

6,5 пси, регулируя дроссельную заслонку на выходе иэ него. Со стороны отверстия рециркулирует 1 л 0,05 M фосфатного буфера рН 7 со скоростью 300 мл/мин. За ходом реакции следят путем титрования содержимого водного резервуара 10 и NaOH и поддерживая рН 7.

Реакцию останавливают после того, как

60 ь сложного эфира гидролизуется (10,5 ч).

Затем оставшуюся органическую фазу(эфир и бутанол) промывают равным объемом 1 М бикарбоната натрия. Определяют, что органическая фаза содержит 72,0 Д сложного эфира (вес/вес) (по данным высокоэффективной жидкостной хроматографии) и ее удельное оптическое вращения составляет (а) o+ 5,34 (с = 1, СНС!з).

Пример 19. Приготавливают экстрактивный биореактор, используя 1 м PAN-150 гемофильтр (Асахи Медикал Ко), содержащий полиакрилнитрильные ультрафильтрационные полые волокна, Фермент, Q-химотрипсин, закупают у Сигма Компани (Тип И, удельная активность 40 — 60 BTEE единиц на мг протеина).

3 г а-химотрипсина иммобилиэуют на волокнах за счет адсорбции фермента на волокнах, а затем сшивают фермент 2,5 раствором глутаральдегида в 0,05 М фосфатном буфере рН 7.

После загрузки фермента в реактор, оболочку заполняют 200 мл н-октанола для удаления остатков воды, Скорость рециркуляции 400 мл/мин при давлении на выходе

6 — 7 пси. Отверстие промывают фосфатным буфером, а 50 мл резервуар обновляют со скоростью рециркуляции 400 мл/мин. Затем в систему вводят 87 мл этанола. Затем начинают реакцию, заменяя водный резервуар раствором N-бензоил-L-тирозина (4,85 г, 17 ммолей ВТ в фосфатном буфере), рН 6, рН водного резервуара поддерживают при 6 0,5 М HCI.

За реакцией следят по расходу кислоты.

Спустя 120 ч расход кислоты выранивается и образец органики анализируют на содержание N-бензоил-7-тирозинэтилового сложного эфира (ВТЕЕ) по ферментному гидролизу а-химотрипсинсм. Концентрация ВТЕЕ в октановое составляет 8,7 мМ, что

1825378

50 соответствует 10 ф, конверсии в сложный эфир. Следует отметить, что беэ начилия экстрагирующего растворителя равновесная конверсия оценивается как менее чем

0,1, Отношение фаз/(органика: вода) повышают затем с 0 - 1 до Q - -4.5, добавляя

500 мл октанола и 84 мл этанола, Спустя еще

105 ч. концентрация BTEE в октаноле составляет 4,8 мМ, что соответствует 36 конверсии. Возрастание экстрактивности растворителя сдвигает равновесие конверсии, Пример 20. Экстрактивный биореактор приготавливают, используя 0,85 м обычного мембранного модуля, устойчивого к растворителю, изготовленного из полиакрилонитрильного ультрафильтрационного полого волокна из PAN-200 гемофильтра (Асахи Медикал Ко), Фермент липазу, полученную из Candlda cylindracea, закупают у

Genzyme corporation ее специфическая активность 10500 ед/мг. Известно, что этот фермент стереоселективно гидролизует сложные эфиры в Ибупрофен (2-)4-изобутилфенил)-пропионовую кислоту).

12 г липазы растворяют в 500 мл дистиллированной воды. Этот раствор рециркулируют через оболочку с избыточным давлением 3 — 5 пси. Ультрафильтрат собирают со стороны отверстия до тех пор пока резервуар не опустошается, и определяют остаточную активность. Заметной активности не оказалось.

1 л 1-пентанола йрокачивают в оболочку и рециркулируют со скоростью 300 мл/мин при давлении на выходе 5-8 пси. Этот пентанол действует и как донор спирта и как экстрагирующий растворитель. Отверстие промывают 250 мл калийфосфатного буфера (20 мМ, рН 5,5) 50 мл резервуар буфера заполняется и рециркулирует со скоростью

300 мл/мин.

Реакцию начинают, добавляя 41 г рацемического ибупрофена (растворенного в 100 мл пентанола) в органический резервуар.

Спустя 68 ч образец пентанола анализируют с помощью ИК-Фурье спектрометра

Николетт 5НХС. Сложный эфир идентифицируют по поглощению при 1735 см, что указывает на ферментативную этерификацию.

Пример 21. Приготавливают экстрэктивный биореактор, используя 0,85 м обычного мембранного модуля; устойчивый к растворителю, изготовленный из полиакрилонитрильных ультрафильтрационных полых волокон из PAN-200 гемофильтра (Асахи Медикал Ко), Этот тип экстрактивного реактора пригоден для демонстрации неl

55

Формула изобретения

1. Способ разделения рэцемической смеси с использованием иммобилизовэнногофермента,отличающийся тем,что осуществляют контактирование двух несмешивающихся потоков, водного и органического. разделенных мембраной с иммобилизованным ферментом, причем один поток, содержащий рацемическую смесь, направляют к одной стороне мембраны, э другой — к противоположной стороне мембраны, затем из второго потока выделяют образовавшийся хиральный продукт, а прерывной экстракции химически лабильного продукта в органическую фазу. Фермент липазу, полученную из

Chromobaterlum vlscosum закупают у Юнай5 тед Стейтс Биокемикалс Корпорейшн со специфической активностью 204000 ед/мг.

64 мг этого фермента растворяют в 250 мл 20 мМ калийфосфатного буфера (рН 6,5).

Этот раствор загружают в мембрану, как

10 описано в примере 2. Спектрофотометрический контроль фильтрата показывает, что примерно 50 $ фермента остается в мембране. Затем отделение оболочки заполняют 250 мл гексана для удаления остатков

15 воды. Гексан рециркулирует со скоростью

350-450 мл/мин при давлении на выходе

5-7 пси. 300 мл калийфосфатного буфера (20 мМ, рН 6,5) рециркулирует через отверстие со скоростью 350-450 мл / мин.

20 Синтезируют полиэфир янтарной кислоты и рацемический феноксибензальдегидцианогидрин. 1,4 гемисукцинатного сложного эфира растворяют в 20 мл 4ОС дистиллированной воды. рН устанавливают

25 6,4-6.6 1 М раствором двухосновного калийфосфата, до получения водного раствора натриевой соли сложного эфира. Реакцию начинают, добавляя раствор сложного эфира в отверстие. рН контролируют при 6,55

30 О,1 М NaH.

Ферментный гидролиэ гемисукцинатного сложного эфира, как известно, является стереоселективным, и в результате чего получают (S)-феноксибензальдегидциано35 гидрин. Цианогидрин непрерывно экстрагируется в гексан для минимизации химического гидролиза в ахиральный феноксибенэальдегид и цианид. После 2 ч реакции расход гидроокиси указывает нэ 48,ф

40 конверсии сложного эфира в цианогидрин и сукциновую «ислоту. Оптическое вращение конечной фазы гексана (линия Д натрия, 1 дм длина пути) составляет 0,042О. Оптическое вращение указывает на осуществление.

45 обогащения эпантиомера за счет ферментного гидролиза.

1825378

52 из первого потока — непрореагировавший стереоизомер, 2. Способ по и. 1, от л и ч а ю шийся тем, что используют гидрофильную микропористую мембрану.

3. Способ по и. 1, отличающийся тем, что используют гидрофобную микропористую мембрану и регулируют величину рН. в потоке в интервале 2-10.

4. Способ по и. 1, отличающийся тем, что рацемическая смесь содержит два иэомера сложного эфира, полученного при взаимодействии спирта с рацемической кислотой или кислоты с рацемическим спиртом, а хиральный продукт представляет собой карбоновую кислоту или спирт.

5. Способ по и. 1, от л и ч а ю шийся тем, что проводят процесс при 20-45ОС.

6. Способ поп.1,отлича ющийся тем, что используют мембрану, содержащую фермент микробиологического или животного происхождения.

7. Способ по и. 6, отличающийся тем, что используют мембрану с гидролитическими ферментами липазой, или карбоксилэстеразой, или химотрипсином.

8. Способ по и. 1, о тли ч а ю шийся тем, что используют мембрану, содержащую фермент, ковалентно связанный с поверхностью пор стенок мембраны, или адсорбированный пористой поверхностью стенок мембраны, или поперечно сшитый внутри объема пор мембраны, или заключенный в полимерный гель внутри пор мембраны.

9. Способ поп,1, отл ича ющийся тем, что используют мембрану в форме полого еолокна или трубки.

10. Способ поп. 1, отл ич а ю щи йся . тем, что используют мембрану иэ полиакрилонитрила или регенерированной целлюлозы.

11. Способ поп.1, отл ич а ю щи йс я тем, что рацемическую смесь непрерывно возвращают к мембране. 12. Способ по и, 1, отличающийся тем, что, в случае необходимости, выделенный непрореагировавший стереоиэомер подвергают рацемизации и полученную рацемическую смесь возвращают к мембране.

13. Способ поп.1, о тл ичэ ю щийс я тем, что величина соотношения объемометрических расходов первого и второго потоков после прохождения мембраны с иммобилиэованным ферментом составляет

2-10.

14. Способ разделения рацемической смеси с использованием иммобилизованного фермента, отличающийся тем, что осуществляют контактирование двух несмешивающихся потоков, водного и органического, разделенных мембраной с иммобилиэованным ферментом, причем один поток, содержащий рацемическую смесь, подают к одной стороне мембраны. а другой — к противоположной стороне мембраны и затем выделяют из первого потока образовавшийся хиральный продукт и непрореагировавший стереоизомер.

15, Способ по и. 14, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что используют гидрофильную микропористую мембрану.

16. Способ по и. 14, о т л и ч э ю щ и йс я тем, что используют гидрофобную микропористую мембрану и регулируют величину рН в потоке в интервале 2-10.

17. Способ поп.14, отл ича ющийс я тем, что рацемическая смесь содержит два изомера сложного эфира, полученного

20 при взаимодействии спирта с рацемической кислотой или кислоты с рацемическим спиртом, ахиральный продукт представляет собой карбоновую кислоту или спирт.

18. Способ по и. 14, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что проводят процесс при 20 — 45 С.

19. Способ по и. 14, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что используют мембрану, содержащую фермент микробиологического или животного происхождения.

20. Способ по и. 19, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что используют мембрану с гидролитическими ферментами липаэой, или карбоксилэстеразой, или химотрипсином.

21. Способ по и. 14, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что используют мембрану, содержа30

35 щую фермент, ковалентно связанный с поверхностью пор стенок мембраны, или адсорбированный пористой поверхностью стенок мембраны, или поперечно сшитый бра ны.

22. Способ по и. 1, отличающийся тем, что используют мембрану в форме полого волокна или трубки.

23, Способ поп. 1,отл и чаю щийся тем, что используют мембрану иэ полиакрилонитрила или регенерированной целлюлозы.

24. Способ по и. 1. отличающийся тем, что рацемическую смесь непрерывно возвращают в мембрану.

25. Способ пои 1, отл ич а ю щи йс я тем, что, в случае необходимости выделенный непрореагировавший стереоизомер подвергают рацемиэации и полученную рацемическую смесь возвращают к мембране.

26. Способ по и. 1, отличающийся тем, что величина соотношения обьемомет50

40 внутри объема пор мембраны, или заключенный в полимерный гель внутри пор мем53

1825378

Таблица f необходимого для поддержания рН при 7,8 в растворе 20 мл 0,2

М NaCI + 0,5 мл сложного метилового эфира феноксиацетата (Алдрич Ко) + 2,5 мл раствора фемента, /

Таблица 2

* Определяли, измеряя скорость добавления 20 мМ NaOH, необходимых для поддержания рН 8 в растворе 20 мл 0,1 М фосфатного буфера рН 8.0 + 0.2 г этилбутиратв (Алдрич Ко) + 1.0 мл раствора фермента. рических расходов первого и второго потоков после прохождения мембраны с иммобилиэованым ферментом составляет 2-10.

27. Способ отделения хирального продукта от ахирального предшественника с 5 использованием иммобилизованного фермента, отличающийся темчто, осуществляют контактирование двух несмешивающихся потоков, водного и органического, разделенных мембраной с 10 иммобилизованным ферментом, причем поток, содержащий ахиральный предшественник, подают к одной мембране, а второй поток — к противоположной мембране и затем иэ второго потока выделяют целевой 15 продукт.

28. Способ поп.27,отл и ча ющийс я тем, что используют гидрофильную микропористую мембрану.

29, Способ по и. 27, отл и ча ю щи й- 20 с я тем, что используют гидрофобную микропористую мембрану и регулируют величину рН в потоке в интервале 2-10, 30. Способ по и. 27 о т л и ч а ю щ и й- 25 с я тем, что проводят процесс при 20-45 С.

31, Способ по 27, отличающийся тем, что используют мембрану, содержащую фермент микробиологического или weвотного происхождения.

32, Способ по п.31, о тл и ч à ю щи йс я тем, что используют мембрану с гидрелитическими ферментами липазой, или карбоксилэстеразой, или химотрипсином.

33. Способ по и. 27, о т л и ч в ю щ и Ф с я тем, что используют мембрану. содержащую фермент, ковалентно связанный с по верхностью пор стенок мембраны, ил адсорбированный пористой поверхностьяв стенок мембраны, или поперечно сшитыми внутри объема пор мембраны, или заклю» ченный в полимерный гель внутри пор мем браны.

34. Способ по и. 27, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что используют мембрану в форме полого волокна или трубки.

35, Способпо и. 27, отл ич а ю щийс я тем, что используют мембрану иэ полиакрилонитрила или регенерированной целлюлозы.

36. Способ по п.27, отл и ч а ю щийс я тем, что величина соотношения обьемометрических расходов первого и второго потоков после прохождения мембраны с иммобилизованным ферментом составляет

2 — 10, 1825378

55

Таблица 3

П р и м е ч а н и е . Избыток энантиомера в органической фазе 98 ф . избыток энантиомера в водной фазе 99,8 $.

Таблица 4

П р и м е ч а н и е .-Избыток знантиомера органической фазы более чем 99 ; избыток энантиомера водной фазы 91 ф,.

Составитель О. Комарова

Техред M. Моргентал Корректор M. Самборская

Редактор

Производственно-издательский комбинат "Патент". г, Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 2232 Тираж Подписное

8НИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35. Раушская наб., 4/5