Способ получения рекомбинантного активированного белка с человека

 

Использование: генетическая инженерия , получение рекомбинантной ДИК, кодирующей активный белок С. Сущность изобретения: способ получения рекомбинантного человеческого белка С предусматривает культивирование штаммов-реципиентов , трансформированных рекомбинантной плазмидной ДНК, причем данный вектор экспрессии состоит из последовательности ДНК, которая кодирует аминокислотную последовательность, где данная последовательность включает (начиная от концевой аминогруппы до концевой кзрбоксигруппы): сигнальный пептид и пропептид у-карбоксилированного белка; легкую цепь человеческого белка С; дипептид лизин-аргинин, лизин-лизин или аргининаргинин; последовательность расщепления для ассоциируемой с клеткой протеазы, активированную тяжелую цепь человеческого белка С; промотор, расположенный таким образом, что приводит к экспрессии указанной последовательности, с последующим выделением и очисткой целевого продукта. 2 табл. ё

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)ю С .12 N 15/52, 15/84

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ

К ПАТЕНТУ

Сд

О

О

00 (21) 4613088/13 (22) 02.12.88 (31) 129027 (32) 04. 12.87 (ЗЗ) US (46) 23.07;93. Бюл. М 27 (71) Эли Лилли Энд Компани (Щ

f72) Нильс Ульрик Банг (0$), Хармут Джозеф

Эрлих(08)„Брайан Вилльям Гриннел и

Стэнли Ричард Яскунас (US) (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО АКТИВИРОВАННОГО БЕЛКА С ЧЕЛОВЕКА (57) Использование: генетическая инженерия, получение рекомбинантной ДНК, кодирующей активный белок С. Сущность изобретения: способ получения рекомбинантного человеческого белка С предусматривает культивирование штамИзобретение относится к области генетической инженерии, в частности к получению рекомбинантной ДНК, кодирующей активный человеческий белок С.

Известные ранее способы получения белка C предполагают продуцирование неактивной формы белка С (профермент) с последующей обработкой высокими концентрациями тромбина или тромбина и тромбомодулина или другими дорогостоящими ферментами активации.

Способ продуцирования активированного белка С исключает этап активации за счет того. что векторы экспрессии белка содержат ДНК кодирующую точку протеолитического расщепления в последовательности белка С, что приводит к прямой

i. 5lJ«, 1830081 А3 мов-реципиентов, трансформированных рекомбинантной плазмидной ДНК, причем данный вектор экспрессии состоит из последовательности ДНК, которая кодирует аминокислотную последовательность, где данная последовательность включает (начиная от концевой аминогруппы до концевой карбоксигруппы): сигнальный пептид и пропептид карбоксилированного белка; легкую цепь человеческого белка С; дипептид лизин-аргинин, лизин-лизин или аргининаргинин: последовательность расщепления для ассоциируемой с клеткой протеазы, активированную тяжелую цепь человеческого белка С: промотор. расположенный таким образом, что приводит к экспрессии указанной последовательности, с последующим выделением и очисткой целевого продукта.

2 табл. экспрессии активированного белка С в ре«омбинантн ых клетках реципиентах.

Белок С синтезируется как неактивная молекула, пробелок С. Пробелок С претерпевает сложные процессы, приводящие к образованию ряда различных неактивных молекул. Активация белка С происходит в крови в реэультате реакции, в которой участвует комплекс тромбомодулин-тромбин, Активированный белок С вместе с кофактор- (гд ным белком S является антикоагулянтом, играющим очень важную физиологическую роль.

Активированный белок С может предотвращать внутрисосудистый тромбоз и препятствовать распространению имеющихся сгустков.

1830081 l0

15 фактора Х в фактор Ха примерно на пять порядков величины. Активированный белок

С действует на гидролиз, приводя к протеолитическому: расщеплению, и необратимо 55 разрушает кофакторы свертывающей системы крови Va и ИШа, активированные формы неактивных факторов свертывающей системы крови V и Vill, В противоположность этому; факторы свертывающей системы

Тромбомодулин образует плотный сте- . хиометрический комплекс с тромбином, Тромбомодулин, образующий комплекс с тромбином, полностью изменяе1 функциональные свойства тромбина. Тромбин обычно сгущает фибриноген, активирует кровяные пластинки и превращает кофакторы свертывания крови V u Vill и их активированные формы Ча и Villa. Тромбин активирует белок С, но лишь очень медленно и неэффективно. 8 противополжность этому, тромбин, образующий комплекс с тромбомодулином, не сгущает фибриноген, не активирует кровяные пластинки и не превращает кофакторы свертывания V и ИИ в их активированные контрпары Va и Villa, а действительно становится очень эффективным активатором белка С, Константа скорости активации белка С под действием трамбомодулина-тромбина в 1000 раз больше константы скорости активации одного лишь тромбина, Система коагуляции представляет собой цепную реакцию, включающую последовательную активацию проферментов в активные протеаэы серина. Эта цепная реакция в конечном итоге приводит к образованию ферментного тромбинв, который в результате ограниченного протеолиза превращает фибриноген кровяной плазмы в нерастворимый гелевый фибрин. Основными результатами данного коагуляционного каскада являются превращение фактора свертывающей системы крови Х в фактор свертывающей системы крови Ха посредством фактора свертывающей системы крови

tXa и превращение протромбина в тромбин посредством фактора сверты вающей системы крови Ха. Обе эти реакции происходят на поверхностях клетки, главным образом на поверхности кровяной пластинки, и для обеих реакций требуются кофакторы. Основные кофакторы, факторы V и Vill, в данной системе циркулируют как относительно неактивные предшественники, но при образовании нескольких первых молекул тромбина тромбин делает обратную петлю и активирует кофакторы за счет ограниченнОго протеолиза. Эти активированные кофакторы, Va и VHla; ускоряют как конверсию протромбина в тромбин, так и конверсию

30 крови V u Vill являются очень слабыми субстратами для активированного белка С, Очень важным кофактором активированного белка С является белок S, другой зависящий от витамина К белок плазмы. Белок S значительно повышает регулируемый активированным белком С гидролиз факторов Va u Villa (в 25 раз).

Активированный белок С является новым противотромбическим средством с более широким терапевтическим индексом, чем существующие антикоагулянты, такие как гепарин и вводимые орально антикоагулянты типа оксикумарина. Ни проферментный белок С, ни активированный белок С не проявляет эффективность до тех пор, пока не образуется тромбин, поскольку тромбин должен превращать факторы свертывающей системы крови V и ИИ соответственно в факторы Va и Villa; активированные формы этих двух кофакторов являются предпочтительным субстратом для активированного белка С. Тромбин также необходим для активации проферментного белка С, поскольку без комплекса тромбомодулин — тромбин профермент белка С не превращаешься в его активную контрпару.

Активированный белок С является, согласно требованию, антикоагулянтом, поскольку активированный белок С действует за счет инактивирующих кофакторов Va u

Иllа. Поскольку тромбин необходим для превращения факторов V и ИН в их активированные контрпары Va и Villa, то белок

С действует лишь как антикоагулянт после образования трамбина. Обычные антикоагулянты, в противоположность активированному белку С, сохраняют постоянное антикоагулянтное состояние в течение

scего срока, пока их дают пациенту, ввиду чего значительно повышается риск кровотечения по сравнению с белком С или активированным белком С. Таким образом, активированный белок C по требованию является антикоагулянтом.широкого клинического полезного действия, который может использоваться как замена гепарина и оксикумарина.

Г1ри некоторых заболеваниях, таких как наследственная .белковая недостаточность (дефицит белка С), профермент белка С имеет очень важное терапевтическое значение.

Хотя проферметичные формы белка С очень полезны для терапевтических целей, некоторые заболевания могут лечиться более эффективно путем приема пациентами активированной формы белка С, Так, например; при таких заболеваниях, как инфаркт миокарда или глубокий еенный тромбоз (особенно в случаях после хирургической

1830081 щихся тромбов.

Нуклеотидная последовательность зарождающегося человеческого белка представлена ниже:

10 20 30 40

ATG TGG CAG CTC АСЛ AGC СТС СТС CTG ТТС GTG GCC АСС TGG GGA АТТ

ИЕТ TRP GLN LEU THR SER LEU ЬЕ0 LEU РНЕ VAL АЬЛ THR TRP GLY ILE

5 10 15

50 60 70 80 90

ТСС GGC ЛСЛ CCA GCT ССТ СТТ GAC ТСА GTG ТТС ТСС AGC AGC GAG CGT

SFR GLY THR PRO AI.Ë. PRO LEU ASP SER VAL PHE SER SER SER GLU ARG

20 25 30

100 110 120 130 140

GCC СЛС CAG GTG CTG CGG АТС CGC AAA СОТ ГСС AAC ТСС ТТС CTG GAG

ALA HIS GLN VhL LEU ARG ILE ARG LYS ARG ALA ASN SER PHE LEU GLU

35 40 45

150 160 170 180 190

GAG СТС ССТ САС AGC AGC CTG GAG CGG GAG TGC АТА GAG GAG АТС TGT

СЬЦ IEU ARG 1ЦБ SER SER LEU GLU ARG GLU CYS ILE GLU GLU ILK CYS

50 55 60

200 210

САС ТТС GAG GAG GCC AAG GAA АТТ ТТС

ASP PIIE GLU GLU ALA LYS GLU ILE PHE г

6 70

Ф 250 260

GCC TTC TGG ТСС ЛАС СЛС &ТС САС CGT

hLA PIK TRP SER LYS IIIS VAL ASP GLY

290 300 310 320 330

TTG GAG CAC CCC ТСС GCC ЛОС CTG TGC TGC GGC САС GGC ACG TGC ATC

ЬЕ0 GLU HIS PRO CYS ALA SER LEU CYS CYS GLY HIS GLY THR CYS ILE

100 105 110

340 350 360 370 380

GAC GGC ЛТС GGC AGC ТТС AGC TGC GAC TGC CGC AGC GGC TGG GAG GGC

ASI GLY ILE GI.Y SER PHK SER CYS hSP CYS ARC SER GLY TRP GLU GLY

115 120 125

390 400 410. 420 . 430

CGC TTC TGC CAG CGC GAG GTG AGC TTC СТС AAT TGC TCG CTG GAC AAC

ARG PHE CYS GLN ARG GLU VAL SER PHK LEU ASN CYS SER LEU ASP ASN

130 135 140 операции нижних конечностей), пациенты имеют нормальные концентрации профермента белка С, недостаточные для активированного белка С; для предотвращения образования тромбов или удаления имею220 230 240

CAA AAT GTG GAT GAC АСА CTG

GLN ASN VAL ASP ASP THR LEU

75 80

270 280

GAC CAG TGC TTG GTC TTG CCC

ASP GLN CYS LEU VAL LEU PRO

90 95

1830081

440 450 460 470 480

GGC GGC TGC ACG САТ TAC TGC CTA GAG GAG GTG GGC TGG CGG CGC ТСТ

С1Л GLY CYS THR АРПБ TYR CYS LEU GLU GLU VAL GLY TRP ARG ARG CYS

145 150 155 160

490 500 51О 520

AGC TGT GCG CCT GGC ТАС AAG CTG GGG САС GAC СТС CTG CAG TGT CAC

SER CYS ALA PB0 GLY TYR LYS LEV GLY ASP ASP LEU LEU GLN CYS HIS

165 17о 175

530 540 550 560 570

CCC ССА GTG AAG ТТС ССТ TGT ССС AGG ССС TGG AAG CGG АТС GAG AAG 20 PRO ALA VAL LYS РНЕ PRO CYS GLY ABG PRO TRP LYS АВС.ИЕТ GLU LYS

1ВО 185 190

580 590 600 610 620

AAG CGC AGT САС CTG AAA CGA GAC ACA GAA GAC САА GAA САС САА GTA

25 1ЛБ ABG SER HIS LEU LYS ARG ASP ТНВ GLU ASP GLH GLU ASP GLN VAL

195 200 205

6Зо 640 650 660 670

GAT CCG CGG СТС ATT GAT GGG AAG ATG ACC AGG CGG GGA GAC AGC ССС

ASP PRO ARG LEU ILF. ASP GLY LYS ИЕТ ТНВ ARG АВС GLY АБР SER PRO

210 215 220

68О 69о 7оо 710 720

TGG CAG GTG GTC СТС CTG GAC ТСА AAG AAG AAG CTG GCC TGC GGG ССА

TRP GLN VAL VAL LEU i.EU ASP SEP. QYS LYS LYS LFU ALA CYS .GLY ALA

225 гзо 235 240

730 740 750 760

GTG CTC АТС CAC CCC ТСС TGG GTG СТС ACA GCG GCC CAC TGC ATG GAT

VAL LEU ILE 1ПБ PRO SEP. TRP VAL LEU THR ALA ALA HIS CYS ИЕТ ASP

245 250 255

770 780 790 800 810

45 GAG TCC AAG AAG СТС СТТ СТС AGG СТТ GGA GAG ТАТ GAC CTG CGG CGC

GLU SER LYS LYS 1.Е11 LEU VAJ ARG LEU GLY GLU TYR ASP LEU ARG ARG

260 265 270

820 830 840 850 860

TGG GAG AAG TGG GAG CTG GAC CTG GAC ATC AAG GAG GTC ТТС GTC САС

5 TRP GLU LYS TRP С1Л LFU ASP.LEU ASP ILE 1.УБ GLU VAL PRE VAL ffIS

275 280 285

1830081.

870 880 890 900 910

ССС АЛС ТАС ACC AAG AGC АСС ACC GAC ААТ GAC АТС GCA CTG CTG САС

10 PR0 ASN TYR SER LYS SER THR THR ASP ASN ASP ILK ALA LEU LEU HIS

290 295 300

920 930 940 950 960

CTG GCC CAG ССС GCC ACC CTC TCG CAG АСС АТА GTG ССС АТС TGC СТС

LEU ALA GLN PRO ALA THR LEU SER GLM THR ILE VAL PRO ILE CYS LEU

305 310 315 320

970 980 990 1000

CCG ChC AGC GCC СТТ GCA GAG CGC GAG СТС ААТ CAG GCC GGC CAG GAG

20. PR0 ASP SER GL> LEU ALA GLU ARG GLU LEU ASN GLN ALA GLY GLN GLU

325 330 335

1010 1020 1030 1040 1050

ACC СТС GTG ACG GGC TGG GGC ТАС .САС AGC AGC CGA GAG AAG GAG GCC

ТЖ LEU VAL THR GLY TRP GLY TYR HIS SER SER ARG СЫ 2УБ GLU ALA

340 345 350

1060 1070 1080 1090 1100

AAG AGA AAC CGC ACC ТТС CTC СТС ААС ТТС ЛТС AAG АТТ ССС GTG GTC

3O LYS ARG ASN ARG THR РНЕ VAL LEU ASN PHE ILE LYS ILE PRO VAI VAL

355 360 365

1160 1170 1180 1190 1200

ЛТС CTG TGT GCG GGC ЛТС СТС GGG GAC ССО CAG GAT GCC TGC GAG GCC

KT LKU CYS ALA СЬУ ILE LEU GLY ASP ARG GLN ASP ALA CYS GLU GLY

385 390 395 400

1210 1220 1230 1240

GAC AGT GGG GGG ССС ATG GTC GCC ТСС ТТС CAC GGC АСС TGG ТТС CTG

ASP SER GLY GLY PR0 ИЕТ VAL ALA SKR PHK HIS GLY THR TRP PHE LEU

405 410 415

1250 1260 1270 1280 1290

GTC GCC CTG GTG AGC TGG GGT CAG GGC TCT GGC CTC СТТ;САС AAC ТАС

VAL GLY LEU VAL БЕК TRP GLY GLU СЫ CYS GLY LEU LEU HIS ASN TYR

420 425 430

1300 1310 1320 1330 1340

GGC GTT TAC ACC AAA GTC AGC CGC ТАС СТС GAC TGG АТС CAT GGG САС

GLY ЧАЕ TYR ТНВ LYS ЧЛ2. SER ARG TYR LEU ASP TRP ILE HIS GLY HIS

435 440 445

1350 1360 1370 1380

АТС AGA GAC AAG GAA ССС ССС CAG AAG AGC TGG GCA ССТ TAG

ILE ARG ЛБР LYS GLU ALÀ PRO GLN IYS SER TRP ALA PRO ?2?

450 455 460

15 1 120 1120 1 130 1140 1150

CCG САС ААТ GAG TGC AGC GAG GTC ATG AGC AAC ATG GTG ТСТ GAG AAC

35 РВО Н1$ АБМ СЫ СУБ БЕК ОЬУ-ЧАЕ ИЕТ БЕК АБН ИЕТ VAL SER GLU ASN

370 375 380

1830081 т.е, соответственно 3 и 5 концы кодирующей нити данного белка, Плазмиду рН 7 выделяют иэ штамма E. coI(K12 йй1/рНС7, который хранится в Северной региональной 35 научно-исслвдоеательской лэборатории (NRRI), Пеория. Иллинойс, под номером

NRRI 8-15926..

Зарождающийся белок С также может быть представлен схематически кэк показа- 40 но ниже:

42 43 197 198 199 200 2 t1.212 А61 рге-pro .С KR АР АНС с — ъ пре-про-аминокислотные группы 1-42 за- 45 рождающегося белка С кодируют сиг11щьнцй 1вптия 11 npppoA711$ чюдявечбящО

6jisirs 5, ачй11ь, важный для 11фправэй нщй сварен Ц 1кар@щсилюрйвэния фул1 э (.;.

LC -. эминркиалотныв группы 43-197 зарождающегося белка С ловле посттрансляционной модификации создают легкую цель

М)

KR — аминокислотные группы 198-199 э»рождающегося белка C удаляются, йо всей вероятности. в ходе д11ухэтапйого nðoцвсс», включающего первое расщвплвНюв (либо мв)кду остаточными груйпами 197198. либо между остаточ11ы И группами

199-200) с последующим воздействием карРЮЮ ЮЮ белок С

Указанная выше последовательность

ДНК получена из клонов с ДНК, полученных от мРНК (информационной PHK), которая кодирует человеческий белок С. При построении клонов сДНК концы кодирующей беhок С сДНК застраива ртся 5 поли С последовательностью. 3 поли С последовательностью. э также последовательностью, узнаваемой эндонуклеээой 5 и 3 Pet 1. Оба эти сДНК клона служат для построения молекулы ДНК, включающей как кодирук щую последовательность зарождающегося человеческого белка С. так и части ДНК, кодирующие нетранслированную мРНК в 5 и 3 концах данной кодирующей зоны, Зтрт фрагмент ДНК клонируют в сайт Pat 1 плазмиды pBR322, в результате чего получается плазмида рНС7. Таким образом, пламиээ рНС7 включает указанную кодирующур последовательность и дополнительные последовательности:

5 — С ТОС АСС GGG GGG GGG GGG GQG

GGG СТО TCA TGG CGG CA@ @AC GGC САА

СТТ GCA ОТА ТСТ ССА CGA ССС GCC ССТ

АСА GGT 6СС AGT GCC ТС А9А — 3 и .5 — CGA ССС ТСС CTG CAG GGC TQG

GCT ТТТ GCA TGG CAA TGG ATG GGA CAT тАА А66 мС ATG тАА CA/ GCA САС Ссс

ССС ССС ССС ССС ССС СС ССС ССТОСА6- 7, 12 боксипвптидаэы или аминопептидээы с образованием белка С.

AP — эминокислотные группы 200-211 зарождающегося белка С составляют экти5 вэционный пептид. который удаляется иэ проферментных форм белка С с образованием активировэнного белка С.

АНС вЂ” эминокислотные группы 212-461 зарождающегося белка С, которые после

10 лосттрансляционной модификации состав-. ляют активированнук1 тяжелую цепь (АНС) активного белка С;

HC — тяжелая, цепь. двухцепной формы проферемент» белка С, которая после по15 сттрансляционной модификации образует эминокислотные группы 260-461. AP и АНС.

Ограниченнйй протволиз включает расщепление и удаление пре-пропептида, со. стоящего из.вминокислотных групп 1-42, в

20 ходе внутриклеточного процесса и секреции зарождающегося полипептида иэ клетки и удаления эмииокислотных групп 198 и 199 с образованием двух цаплей. Активация проферментэ в активную протеазу серина

25 включает протволитическов расщепление пептидной связи ARQ- Е и (группы 211 и

212). Это последнее расщепление высворождает додекапептид(группы 200-21f), ко, торый .составляет концевую аминогруппу

30 большей (тяжелой) цепи двухцепной молекулы профермента, белок С в значительной мере гликолиэирован, этот созреэаий фермент содержит около 23ф углеводов; белок С также содер. жит ряд нвобычйых аминокислот; включая

} карбоксиглутаминовую кислоту и реасеасларэгиновую:кислоту:(эритро-):ф -оксиаспэрагэт), ) "КэрбокСигЩ(У»минов»я мислотэ (два) получается в результате карбоксилировению у глутэминэ иэ группы глутаминовой кислоты с помощью пвченвчной микросомной карбоксилаэы, для кбюрой в качестве кофактора требуется «итамин K.

Активация человеческого белка С также может. быть лредстэвлена схематически, как показано ниже.

" йрв-.прр-.gC-Ù P-АНС прст-.тран-.

50 сляциенная модификация,.т.е, ) кэрбоксилйрованив слвцифичвских rpynn глутаминощй кислоты, Р.гидрв-.

55 щ11щЮррв»НОВ Гру11Пь1 ррпарагиновр кислоты н гликозилиреванив

Секрет; удаление групп 1-42, которые моГут

1830081

Одно цепочечный профермент

10

Двухцепочечный профермент

S-S

АНС-АР ! LC

Активация тромбином-тромбомодулином

Активированный белок С

50 включать более чем одно протеолитическое расщепление

L С-KR-AP-АНС удаление групп

198-199, примерно

90 проферментного белка С, обнаруженного в человеческой крови, является двухцепной формой (S-З=дисул ьфидная связь) Я-S

AHI

Способ получения рекомбинатного человеческого белка С предусматривает культивирование штаммов — реципиентов трансформированием рекомбинантной плазмидой ДНК, причем данная ДНК состоит из Я последовательности ДНК, которая кодирует аминокислотную последовательность, где данная последовательность включает, начиная от концевой аминогруппы до концевой карбоксигруппы: (а) сигнальный пептид и про-пептид карбоксилированного белка; (Ь) легкую цепь человеческого белка С; (с) дипептид лизин-аргинин, лизин — лизин или аргинин-аргинин; (d) последовательность, расщепляющуюся ассоциированную с клеткой протеазой; (е) активированную тяжелую цепь человеческого белка С; (П) промотор, расположенный таким образом; что приводит к экспрессии указанной последовательности ДНК, ДН К включает кодирую щую последовательность дипептида L YS — ARG (KR), расположенную в трансляционной рамке считывания в непосредственном соседстве ниже кодирующей последовательности легкой цепи. Двухосновный дипептид, такой как L YS — ARG, располагается в зарождающемся белке между карбоксильной концевой группой данной легкой цепи и концевой аминогруп пой последовательности расщепления ассоциированной клеткой протеазы, Двухосновные дипептиды, такие как L YS-1

YS или ARG-ARG, эквивалентны дипептиду

L YS ARG согласно данному изобретению.

Непосредственно ниже кодонов дипептидов L YS — ARG находится последовательность, кодирующая последовательность протеолитического расщепления. У концевой карбоксильной группы дипептида L YSARG человеческого белка С располагается

12 аминокислотный пептид, активационный пептид, который удаляется путем протеолитического расщепления. В соединениях, которые используются в способе, последовательность активационного пептида заменена последовательностью, кодирующей последовательность протеолитического расщепления для протеазы, которая ассоциирована с клеткой (табл.1).

Таким образом. зарождающийся белок расщепляется у карбоксильной концевой группы легкой цепи (KR дипептид) и, кроме того, расщепляется у концевой.аминогруппы активированной тяжелой цепи. Следовательно, группы, находящиеся между дипептидом KR и точкой протеалитического расщепления (расположенной у концевой аминогруппы активированной тяжелой цепи) будут удаляться при обработке полипептида. Ввиду того. что эти две реакции протеолитического расщепления будут удалять все группы, находящиеся между концевой карбоксильной группой легкой цепи и концевой аминогруппой тяжелой цепи, последовательность протеолитического расщепления может содержать допонительные группы, не оказывая при этом нежелательного влияния на тип конечного продукта, активировэнного белка С, Таким образом, в данном способе могут использоваться последовательности расщепления более длинные, чем те, которые приведены в табл.1.

Хотя все приведенные выше последовательности расщепления содержат восемь групп, все эти восемь групп необязательны и. следовательно, могут использоваться более короткие последовательности, В трансляционной рамке считывания непосредственно ниже последовательности, кодирующей последовательность протеолитического расщепления, находится

1830081 l N-ИЕТ TRP GLN LEU THR SEB LEU LEU LEU PIK VAL ALA THR TRP GLY ILE

SER GLY THR PRO ALA РГО LEU ASP SER VAL РНЕ SER SER SER GLU ARG

ALA Н."S GLN VAL LEU АВН ILE ARG LYS ARG ALA ASN SER PHE LEU GLU

GLU LEU ЛВС HIS SER SER LEU GLU ABG GLU CYS ILE GLU GLU ILE CYS

ASP PHE GLU GLU ALA LYS GLU 1LE PHE GLN ASN VAL ASP ASP THB LEU

Л1.А PHE TRP SER LYS HIS VAL ASP GLY ASP GLN CYS LEU VAL LEU PRO

LEU GLU HIS РВО CYS ALA SER LEU СYS CYS GLY HIS GLY TlIB CYS ILE

ASP GLX 1LE GLY SER PlK SER CYS hSP CYS ARG SER GLY TRP GLU GLY

АВС P1K CYS GLN ARG GLU VAL SEB РНЕ LEU ЛБН CYS SER LEU ASP ASN

GLY GLY СУБ THR НIБ TYB CYS I.FU GLU GLU VAI. GLY TBP ARG ABG CYS

SER CYS hLh PBO GLY TYR LYS LEU GLY ASP ASP LFU LEU GLN CYÁ НIБ

РВО ALA ЧАI, LYS РНЕ PRO CYS GLY ABG PRO TRP LYS ARG tKT GLU LYS

LYS ЛВГ SEB HIS LEU LYS ARG PRO ABG PRO SER ABG LYS ARG ARG LEU

1LE ASP GLY ЕYS tKT TtIB ABG ARG GLY ASP SER PRO TRP GLN VAL VAL

I,EU ASl SFP, LYS LYS LYS LEU hLA CYS G1..Y ALA VhL ЕЕН ILE HIS

PRO SER TRP Vh1. FU ТНВ ALA ALA HIS CYS ИЕТ ASP GLU SER LYS LYS

LEU I.FU YAL ABG 1.ЕУ GLY GLU TYR ASP LEU АВС ARG TRP GLU LYS TRP

GLU LEU hSP 1,EU ASP ILE LYS GLU VAI. РНЕ VAL HIS PRO ASN TYR SER

1тБ БЕВ THB THB ЛБР ASN ЛБР ILE ALA LEU LEU НТБ LEU ALA GLN PRO

ALA THR 1.ЕУ БЕВ И,11 ТНВ 1ЕЕ ЧА!, PRO ILE CYS LEU PRO ASP SER GLY

IEU ALA GLU hPG GLU ЕЕН ASN GLN ALA GLY GLN GLU ТНВ LEU VAL THR

GLY TRP GLY TYR НIБ SER SER ARG GLU LYS GLU ALA LYS ABG ASN ARG

THR PHE VhL LFU hSN РНЕ ILF, LYS ILE PRO VAL VAL PBO HIS ASN GLU

CYS SFR GLU ЧАЕ tKT SER ASN ИЕТ VAL SER GIU ASN ИЕТ LEU CYS ALA

35 кодирующая последовательность активированной тяжелой цепи человеческого белка С, При этом активированная тяжелая цепь чело-. веческого белка состоит из групп с 212 по 461 зарождающегося человеческого белка С, Ниже представлена последовательность аминокислотных групп зарождающегося полипептида, транслированного от транскрипта мРНК, Данный полипептид начинается с препропептида человеческого белка С, за котарым следует легкая цепь человеческого белка С, эа которой следует дипептид И вЂ” АРС, за которым идет последовательность расщепления рецептора инсулина, с последую5 щей активированной тяжелой цепью человеческого белка С, Данный полипептид схематически изображен ниже:

20 prepro LC Кй IRS АНС

1п

0 Последовательность аминогрупп данного полипептида представлена ниже:

1830081

GLY ILE LEU GLY ASP ARG GLN ASP ALA CYS GLU GLY ASP SER GLY GLY

PRO НЕТ VAI. ЛЕА SER РНЕ HIS GLY THR TRP PHE LEU VAL GLY LEU VAL

SER TRP GlY GLU GLY CYS гЬт LEU LEU HIS ASM TYR GLY VAL TYR ТНН

LYS VAL SEP, ARG TYR LEU ASP TRP ILE ЩЯ GLY HIS ILE ARG ASP LYS

GLU ALA PRO GLH LYS SER TRP ALA PRO-СООН

Активированный человеческий белок получают при использовании кодирующей последовательности зарождающегося человеческого белка С, из которого была удалена эона.AP путем точечно-специфического мутагенеза. Эта последовательность, представленная схематически, имеет следующую структуру: пре-про 1 С KR АНС

Данную кодирующую последовательность встраивают в вектор экспрессии, полученный в результате вектор р1 АРС трансформируют в эукариотические клетки реципиенты. Полученные трансформанты дают стандартные количества двухцепочечного белка С. Плазмида pL АРС служит также в качестве исходного материала для построения других векторов. Принцип и порядок построения плазмиды pi APC из исходной плазмиды рНС7 описывается в примере 1. Плазмида рНС7 взята из коллекции культур Северного регионального научно-исследовательского центра (NRRL), Пеория, И 61604, Е . соП К12 RR1/ðÍÑ7 под номером регистрации NRRL 8 — 15926, Осуществляют экспрессию активированного белка С путем создания кодирующей последовательности, в которой . последовательность протеолитического расщепления встроена в кодирующую по-. следовательность белка С между кодирующей последовательностью АР и кодирующей последовательностью АНС, Точка протеолитического расщепления встроена с последовательностью протеолитического расщепления, образованной от рецептора инсулина. Таким образом, эта схематически представленная кодирующая последовательность имеет следующую структуру: пре про LC KR AP IRS АНС

Эта кодирующая последовательность встраивается в вектор pL АРС, в результате чего получают плазмиды pL PC-IRS. Однако эукариотические клетки-реципиенты, содержащие плазмиду pL РС-IRS, не обеспечивают получение активного белка С.

Способ прямого получения активированного белка С осуществляют после замены кодирующей последовательности AP кодирующей последовательностью IRS.

5 Полученная в результате кодирующая последовательность, показанная схематически, имеет следующую структуру: пре-про 1 С KR IRS АНС

Часть кодирующей последовательности

10 белка С, включающей кодирующую активационный пептид ДНК, выделяют из пламиды рНС7, вставляют в фаг М13 mp18 и затем видиоизменяют путем сайт-специфического мутагенеза. Затем эту кодирующую после15 довательность клонируют в эукариотический вектор, в результате чего получают плазмиду, обозначенную как pL APC-IRS, идентичную пламизде р АРС, за исключением вставки кодирующей последователь20 ности IRS между кодирующими последовательностями KR и АНС, Плазмида

pL АРС вЂ” IRS отличается от плазмиды pL PC—

IRS лишь делецией кодирующей последовательности AP. Принцип и последовательность

25 построения плазмиды pL APC — IRS подробно описываются в примере 3.

Плазмида pLAPC — IRS включает ген-усилитель BK. предназначенный для стимулирования транскрипции основным поздним

30 промотором аденовируса кодирующей последовательности белка С, Полученным вектором экспрессии трансформируют эукориотические клетки (табл,2).

Способ иллюстрируется следующими примерами, Пример 1. Построение плаэмиды р

АРС, 40 Пламиза рНС7 содержит полную кодирующую последовательность зарождающегося человеческого белка С. 1 л питательного бульона L (10 г пептона, 10 г

ЙаС!и5 r дрожжевого экстракта), содержа45 щего 15 мкг/мл тетрациклина, инокулируют с культурой Е.соН К12 RR1/рНС7 (NRRL В—

15926) и инкубируют в инкубаторе с воздуш20

1830081

40 путем центрифугирования со скоростью

25000 об/мин в течение 40 мин в роторе. В раствор вводят примерно 30,44 r CsCI и около 1 мл раствора 5 мг/мл этилбромида и затем объем этого раствора доводят до 40 45 мл. Этот раствор декантируют в пробирке ультрацентрифуги. Пробирку герметически закрывают и затем осуществляют центрифугирование в роторе при скорости вращения

42000 об/мин в течение около 16ч. Получен- 50 ную плазмиду, визуально наблюдаемую в. ультрафиолетовом свете, выделяют, затем помещают в пробирку и в ротор и осущест- вляют центрифугирование со скоростью

19

1 ным вибратором при 37 С до тех пор, пока не достигнуто значение оптической плотности (О.D.), при 590 нм равное примерно 1 ед., и в этот момент вводят в данную культуру 1 50 мг хромамфеникола. И нкубацию продолжают в течение примерно 16 ч; вывод кромамфеникола ингибировал синтез белка и таким образом ингибировал дальнейшее деление клеток, но он не предотвращал дальнейшую репликацию плазмиды.

Данную культуру центрифугируют в роторе при скорости 6000 об/мин в течение

5 мин при 4 С.

Образующийся поверхностный слой удаляют, и клеточные гранулы промывают в

40 мл буферного раствора TE (10 м Мол TpucHCl, рН = 7,5, 10 мМол NaCI, и 1 мМол ЕДТА (этилендиаминтетрауксусной кислоты) и снова гранулируют. Поверхностный слой снова удаляют и клеточные гранулы замораживают в ванне с сухим льдом — этанолом, и затем они оттаивают, Оттаянные клеточные гранулы снова суспендируют в 10 мл раствора 25 / сахарозы/50 мМол ЕДТА,. В данный раствор вводят примерно 1 мл раствора 5 мг/мл лизозима; 3 мл 0,25 Мол ЕДТА, pH = 8,0,. и. 100 мкл 10 мг/мп рибонуклеазы А, и затем этот раствор инкубируют во льду в течение 15 мин, В обработанные лизоцимом клетки вводят в 3 мл лизирующего раствора (попученного путем смешивания 3 мл 10 Д-ного Тритона-Х 100, 75 мл 0,25 Мол ЕДТА, рН = 8,0, 15 мл 1 Моп

Трис-Н Cl, рН = 8,0 и 7 мл воды), осуществляют перемешивание и образующийся раствор инкубируют во льду в течение еще 15 мин, Лизированные клетки замораживают в ванне с сухим льдом — этанолом и затем их оттаивают.

Клеточные остатки удаляют из раствора

55000 об/мин в течение 16 ч, Регулирование до любого необходимого объема осуществляют с использованием TES, содержащего

0,761 гlмл CsG, Данную плазмиду снова выделяют, зтидийбромид экстрагируют на.сыщенным солью иэопропанолом и окончвтельно разбавляют буферным раствором

TES со степенью 1:3. Затем в данный раствор вводят два объема этанола и полученную смесь инкубируют в течение ночи при температуре - 20 С. Плазмиду ДНК гранулируют путем центрифугирования раствора в роторе.ss34 в течение 15 мин при скорости вращения 10000 об/мин. Примерно 1 мг

ДНК ппазмиды рНС7, полученной в ходе этой процедуры, суспендируют в 1 мл буферного раствора TE (10 мМол Трис-HCI, рН

= 7,6, и 10 мМоп ЕДТА) и выдерживают ее при температуре - 20 С.

Примерно 7 мкг (7 мкл) ДНК плазмиды рНС7 вводят в 25 мкл буферного раствора

ТМ 10Х Core (буферный раствор Core ТМ, BRL состоит из 50 мМол Трис-HCl, рН = 8,0, 500 мМол NaCl и 100 мМол М9С!2), 198 мкМол НрО и 12 мкл ограничительного фермента и 7 мкл (80 ед) ограничительного фермента Sstt, Эту реакционную смесь инкубируют при 37 С в течение 4 ч, затем обработанную Sstl-ЯаИ плазмиду рНС7

ДНК экстрагируют сначала фенолом, а затем хлороформом, извлекают путем осаждения этанолом и центрифугирования, и, наконец, суспендируют в 15 мкп буферного раствора ТЕ/10 (10 мМол Трис-основание, pH = 7,6, и 0,1 мМол ЕДТА).

Затем данную реакционную смесь подвергают электрофорезу на агарозном геле (0,6 j).с низкой температурой гелеобразования втечение 2-3 ч при 130 В и 65мА в

Трис-ацетатном буферном растворе. Этот гель окрашивают в разбавленном растворе этилбромида и фрагмент ДНК 0,7 кб $з0$аИ, который визуально обнаруживают в ультрафиолетовом свете большой длины волны, отсекают от геля в виде небольшого сегмента. Обьем этого сегмента определяется его весом и плотностью, и в пробирку, содержащую этот сегмент, вводят четыре объема ТЕ, содержащего 0,25 Мол йаО. Затем данный сегмент расплавляют путем инкубирования при 72 С. Получают примерно

0,5 мкг фрагмента - 0,7 ко Sstt-Salt плазмиды рНС7 в объеме примерно 400 мкл.

Дальнейшую очистку ДН К осуществляют путем пропускания раствора ДНК через колонку (8RL) в соответствии с рекомендациями изготовителя, очищенный фрагмент снова суспендируют в 15 мкл деионизированной воды, Примерно 1 мкг ДНК фага М13 ер18

5 (репликационной формы, RF) обрабатывают с ферментами Sstl и ЯаИ. Реакцию прекращают путем экстрагирования реакционной смеси фенолом и затем хлороформом, Затем ДНК осаждают, извлекают путем центрифугирования и снова суспендируют

1830081

30

40

55 примерно в 15 мкл буферного раствора ТЕ.

Два фрагмента, полученные в результате обработки, разделяют на 0,6; агароэном

rene с низкой температурой гелеобразования, больший фрагмент отсекают от данного геля и очищают.

Примерно 0,1 мкг(в 7 мкл HzG) фрагмент

0,7 кЬ Ssti-Sall плазмиды рНС7 вводят в 5 мкл ДНК RF M13 mp18, обработанного Sstl—

Sall, вместе с 2 мкл буферного раствора лигаэы 10Х (0,5 Мол Трис-HCI, рН = 7,8, 60 мМол Mg Cb и 0,2 Моп дитиотреитола (ДТТ), 2 мкл раствора 1 мг/мп BSA, 1 мкл 25 мМол

АТР, 1 мкл (400 ед) лигазы Т4 ДН К (NE8) и

2 мкл воды). Эту реакционную смесь сшивки инкубируют при 25 С в течение ночи; сшитая ДНК представляет собой ДНК желаемого фага М13 mp18 НЕ1 в виде двухниточной молекулы.

Примерно 300 мкл выращенной за ночь культуры Е.coii К12 JM101 (New England

Biolabs) используют для инокулирования 30 мл питательного бульона 2Х ТУ (питательный бульон ТУ состоит из 10 г/л триптона, 10 г/л NaCI и 5 г/л дрожжевого экстракта), и полученную культуру инкубируют при

37 С с одновременной аэрацией до тех пор, пока оптическая плотность (0.0.1600 не достигала значения 0,5. Затем данную культуру эамораживают в течение 10 мин в ванне со льдом-водой, извлекают путем центрифугирования и снова суспендируют в 15 мл холодной 10 мМол NaCI. Клетки снова собирают путем центрифугирования и затем снова суспендируют в 15 мп холодного 30 м Мол

СаС!г.

Эти клетки помещают в лед на 20 мин и извлекают их путем центрифугирования.

Клетки снова суспендируют в 1,5 мп холодного 30 мМол CaClz, аликвоту з их клеток объемом 200 мкл удаляют, вводят в 9 мкп сшитой ДНК, полученной, как описано выше, и инкубируют на льду в течение примерно 30 мин, Смесь клетки — ДНК затем инкубируют при 42 С в течение 2 мин и затем вводят в 3 мл верхнего агара (питательный бульон ТУ с 0,57 агаром, расплавленным при 45 С), который содержит также

50 мкл 20 Х вЂ” Gal (Х вЂ” 6а1 представляет собой 5-бром-4-хлор-3-индолил P-D-галактопиранозид), 50 мкл 100 мМол IPTG (IPTG— это иэопропил Р -О-тио-гапактопиранозид) и 100 мкл Е. coli К12 М101 в фазе логарифмического роста. Эту смесь клетки — верхний агар затем высевают на чашках с

ТУ-агаром и чашки инкубируют при 37 С в течение ночи.

На следующее утро четыре прозрачные колонии .по отдельности используют для инокулирования 2 мл питательного бульона

2Х ТУ, и полученные культуры инкубируют при 37 С с одновременной аэрацией в течение 6 ч, Затем данные культуры центрифугируют и 500 мкл образующегося верхнего слоя (данные клеточные гранулы используют для получения ДНК фага для анализа ограничительного фермента) вводят в 500 мкл культуры (О.D.550=0,5) Е, соН К1" М",01 и 50 мл питательного бульона 2Х ТУ. Эти ку,;ьтуры инкубируют в течение ночи при

37 С. Фаговую RF ДНК выделяют из клеточных гранул с использованием варианта процедуры, с той разницей, что в данной среде культивации не использовалось никакого антибиотика, и этапы ультрацентрифугирования заменяют экстракциями фенолом и хлороформом. Трансформанты, содержащие фаговую М13 гпр18 — HE1 ДНК, идентифицируют путем анализа ограничительного фермента или их A rn n& Лнк

Разведенные за ночь культуры центрифугируют и примерно 1 мл раствора, состоя щего из 20% полиэтилен гли кол я (P EG) 600 и 2,5 мМол NaCI, вводят в 5 мл поверхностного слоя, который затем инкубируют при комнатной температуре в течение 10 мин, Смесь центрифугируют в течение 10 мин при скорости вращения 10000 об/мин, и о6разованные гранулы, содержащие однониточную фаговую М13 mp18 — НЕ1 ДНК, снова суспендируют в 500 мп буферного раствора

TES (20 мМоп Трис-HCI, рН = 7.5, 0,1 мМол

ЕДТА, и 10 м Мол NaCI). Раствор ДН К экстрагируют сначала хлороформом, затем двукратно насыщенным TE фенолом и затем снова хлороформом, Затем однониточную молекулу ДНК осаждают с использованием

NaOAc (ацетата натрия) и зтанопа, центрифугируют и после промыки гранул 70% этанолом и сушки полученные гранулы растворяют в 80 мкл Н20. Этот фаговый препарат используют в следующем этапе, в сайт-специфическом мутагенезе, с целью удаления ДНК, кодирующей активационный пептид.

Фрагмент однониточной ДНК, используемый в операции мутагенеза для удаления кодирующей активационный пептид ДНК, синтезируют в автоматизированном устройстве синтеза ДНК (представлен ниже):

5 — G С6 СА6ТСА ССТОАААС6АСТСАП

6АТ666ААОАТОА — 3

Примерно 30 пмоль (1 мкл) указанного выше фрагмента однониточной ДН К ("мутагенный олинонуклеотид") и I,5 мкл (7,5 пмоль) универсальной ДНК-затравки М13 обрабатывают по отдельности 5 ед, полинукпеотид киназы Т4 в 10 мкл буферного

23 1830081 24 раствора киназы IX (100 мМол Трис-HCI, рН 8,3, 100 мМол ДДТ, и 100 мМол MgCIg) с содержанием 1 мкл 1 мМол ATP в течение

30 мин при 37 С, с последующей инкубацией в течение 10 мин при 65 С и замораживанием. Обработанные киназой ДНК используют в сайт-специфическом мутагенвэе.

В сайт-специфическом мутагенезе мутагенный олигонуклеотид и универсальную 1О

ДНК-затравку М13 ренатурируют до однониточного ДНК фага. Реакцию ренатурации осуществляют путем ввода 300 nr (0,5 мкл) однониточного фаге М13 mp18-НЕ1 в 1 пмоль (1,2 мкл) универсальной ДНК-эатрав- 15 ки. 1 пмоль (0,3 мкл) мутагенного олигонуклеотида, 2 мкл ренатурирующего буферного раствора IOX (100 мМол Трис-HCI, рН ™ 7,5, 1 мМол ЕДТА и500 мМол NaCI) и 16 мкл Н О, инкубации смеси при 800С в течение 2 мин, 20 а затем при 500С в течение 5 мин и, наконец, охлаждения смеси до комнатной температуры.

После ренатурации олигонуклеотидов фаговая ДНК становилась деухниточной за 25 счет надстраивания затравки с ДН К полимераэой. Реакцию полимерации проводят путем ввода 3 мкл буферного раствора 10Х (500 мМол Трис-HCI, рН - 8, 1 мМол ЕДТА и

120 мМол MgCIg), 3 мкл буферного раствора 30 лигаэы 10Х, 1„5 мкл 0,2 мМол ДТТ, 3 мкл смеси б NTP (0,5 мМол Ь каждой б МТР), 1,2 мкл 25 мМол АТР, 0,5 мкл фермента Кленова (5 ед/мнл, ВМВ), 1 мкл ТЧ ДНК лигазы (400 ед., МЕВ) и 19,8 мкл Н О в смесь ренатури- 35 рованной ДНК. Реакционную смесь полимериэации инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин, затем при

37 С а течение 4 ч и затем в течениме ночи при 4 С. 40

Реакцию прекращают в результате экстракции фенолом-хлороформом и осаждения ДНК этанолом и ацетатом натрия (йаОАс); ДНК извлекают путем центрифугирования и снова суспендируют в 40 мкл бу- 45 ферного раствора SI (0,3 Мол NaCI, 0,03 Мол . NaOAt:, рН "45 и 0,3 мМол ZnCIQ, после чего вводят в раствор ДНК, Раствор ДНК распределяют в равных количествах по двум пробиркам, и в одну иэ 50 пробирок вводят 100 ед(ВМВ) нуклеазы SI.

Реакционную смесь с Sl инкубируют при комнатной температуое в течение 5 мин, и реакцию прекращают путем однократного .экстрагирования реакционной смеси насы- 55 щенным TE фенолом — хлороформом (50:50).

ДНК осаждают иэ данной реакционной сме, си и из необработанного Sl образца ацетатом натрия (NaOAc) с этанолом, Гранулы ДНК повторно суспендируют в

60 мкл Н О и используют для трансформации Е, со11 К12 М101.,Мутанты отбирают с использованием олигонуклеотида 5 —

TGAAACGACTCATTGA - 3 (меченого). Некоторые колонии, которые оказывались позитивными за счет гибридизации. отбирают и

rto отдельности инокулируют в 2 мл культуры Е. сой К12 J M101 в фазе логарифмического роста, Эти культуры инкубируют при

370С с одновременной аэрацией в течение примерно 6 ч и затем используют для получения однониточной ДНК, как описано выше для фага М13 вр18-НЕ1, Последовательность аминокислотных групп однониточной ДНК определяют с использованием метода дидекиси-последовательности, Было идентифицировано несколько фагов с желаемой мутацией, Фаг; в котором аннулирована кодирующая последовательность активационного пептида, обозначен фагом М13 mp18-НЕ2. Мутация в фаге М13 mp18-НЕ2 вызвала уменьшение размера естественной кодирующей последовательности на 36 вр, Выделяют RF форму фага М13 mp18-НЕ2, $з0-Sal (0,7 кЬ) фрагмент RF формы фага М13 mp18-НЕ2 выделяют иэ данного фага. Однако 100 мкл раствора, содержащего 0,1 мкг желаемого фрагмента 0,7 кЬ в слабо желатинированной агароэе со степенью разведения 1:2, не пропускают через какую-либо колонку, а используют непосредственно в операции лигирования, в результате чего получают плаэмиду pL АРС, Три фрагмента ДН К сшивают вместе с образованием плазмиды pL APC: это фрагмент 0.7 кЬ Sstl-$аП фага М13 mp18-НЕ2 и два фрагмента ДНК от плазмиды р1 PC.

Для получения фрагмента ЕсоЮ-Sstl примерно 40 мкг плазмиды pL РС s 25 мкл

Н О вводят в 10 мкл 1 мг!мл BsA, 10 мкл буферного раствора ТМ Core 10Хх (BRL), 5 мкл фермента рестрикции Есо RI (50 ед, В% ), 5 мкл рестриктаэы Sstl (25 ед, BRL) и

45 мкл НрО, и полученную реакционную смесь инкубируЮт при 37 С в течение 1,5 ч, Обработаниую Sstl-Eco RI плазмиду pI. РС

ДНК извлекают путем осаждения этанолом и центрифугирования, ДНК, обработанную .SstI-Еса Ю, суспендируют в воде и затем помещают на агарозный гель с низкой температурой гелеобраэования для разделения фрагментов ДНК путем эаектрофореза.

Для получения фрагмента Есо Ю-$аИ примерно 15 мкг плазмиды pL РС в 9 мкл

НтО обрабатывают рестриктазой Apal. Примерно 10 мкл буферного раствора Apal 10Х (60 мМол NaCI, 60 мМол Трис-HCI, рН 7,4, . 60 мМол MgO2 и 60 мМол ДТТ), 10 мкл 1

1830081

26 мг/мл BSA. 69 мкл Н20 и 2 мкл рестриктазы

Ара! (50 ед, NEB) вводят в раствор ДНК плазмиды pt PC, и полученную реакционную смесь инкубируют при 37 С в течение 1 ч. Затем 15 мкл 2 Mon NaCI, 69 мкл Н20, 8 мкл рестриктазы Sall (NEB) и 8 мкл рестриктазы Есо Rl (NEB) вводят в данный раствор плазмиды р PC ДНК. обработанную рестриктазой Apal и полученную реакционную смесь инкубируют при 37 С в течение 1 ч.

Фрагмент с Apal — SalO — Есо Rl плазмиды pL

PC ДНК экстрагируют сначала фенолом, а затем хлороформом, после чего извлекают путем осаждения этанолом и центрифугирования и в конечном итоге снова суспендируют в 25 мкл HzO. Затем ДНК помещают на

0,6$ агароэный гель с низкой температурой гелеобраэования и фрагменты ДНК отделяют путем электрофореза.

Фрагменты -3,76 кЬ Есо Rl — Sall u

2,0 кЬ Есо Rl — Sstl отсекают от данных гелей и эти гелевые фрагменты расплавляют после ввода равных объемов 10 мМол ТрисНС!, рН = 7,6. Таким образом, получают примерно 2 мкг фрагмента 3.76 кЬ Есо Rt Sall плазмиды pL рС в 200 мкл 10 мМол ТрисНС1, рН = 7,6, который содержит также расплавленную агарозу. Примерно 2 мкг фрагмента 2 кЬ Есо Rl Sall плазмиды

pL PC получают отдельно в 200 мкл

10 мМол Трис-HCI, рН = 7,6, который содержит агарозу, Примерно 12,5 мкл раствора каждого из двух фрагментов (фрагмент 3,76 кЬ EcoRI—

Sall плазмиды pLPC и фрагмен 2,0 кЬ

EcoRI — Ssti плаэмиды plPC) вводят в 20 мкл фрагмента, 0,7 кЬ Sstl — Sall фага М13 mp18—

НЕ2, 10 1 r/ìë BSA, 10 . 10ммол

АТР, 10 мкл буферного раствора лигазы 10Х, 2 мкл (800 Ед„МЕВ) Т4 дНК лигазы и 23 мкл Н20, и полученную реакционную смесь лигирования инкубируют при 15 С а течение ночи. Сшитая ДНК составляет желаемую плазмиду р1 АРС; Пламизда р1 АРС отличается от плазмиды pLPC делецией, кодирующей активационный пептид ДНК.

Для проверки структуры плазмиды и получения больших количеств плазмиды р}.АРС для трансформации эукариотической клетки и последующих построений плазмиду р1 АРС используют для трансфор. мации Е.сой К12 RV308 из коллекции культур NRRL, где она хранится под номером ййй(В-15624.

50 мл культуры Е.соИ К12 RV308 в питательном бульоне L выращивают до достижения оптической плотности (О.Д,) при 590 нм, равной 0,6. Культуру охлаждают во льду в течение 10 мин и. клетки собирают путем центрифугирования. Клеточные гранулы по15

20 вторно суспендируют в 25 мл холодного 10 мМол NaCI. Клетки снова гранулируют путем центрифугирования, и гранулы снова суспендируют в 25 мл холодного 30 мМол

СаС!2 и инкубируют во льду в течение 30 мин. Данные клетки снова собирают путем центрифугирования и снова суспендируют в

2,5 мл холодного 30 мМол CaClz, 200 мкл этой клеточной суспензии смешивают с плазмидой Р1 АРС, содержащей сшитую ДНК, и инкубируют во льду в течение 60 мин. Затем смесь инкубируют при

42 С в течение 2 мин, а затем в течение 10 мин при комнатной температуре, Примерно

10 мл питательного бульона ТУ 10Х вводят в смесь клетки-ДНК и затем клетки инкубируют в инкубаторе с воздушным вибратором в колбе объемом 125 мл при 37 С в течение

2 ч. Аликвоты этой клеточной смеси высевают на чашках с ТУ-агаром (питательный бульон ТУ с I5 г/л агара), содержащих 100 мкг/мл ампициллина, и чашки затем инкубируют при 37 С в течение ночи. Трансформанты Е.соН К12 RV308/pL АРС проверяют

25 путем анализа их плазмиды ДНК на ограничительной фермент. Плазмиду ДНК получают иэ Е.coll К12 RV308/pLAPC с той разницей, что в качестве агента отбора используют 50 мкг/мл ампициллина, а не тет30 рациклин, Пример 2. Плазмиду pLPC используют как промежуточный вектор в построении плазмиды р АРС. Плазмида р РС включает сегмент ДНК, который кодирует энхансер

35 вируса ВК и поздний промотор аденовируса

2, вызывая усиленную экспрессию человеческого белка С. Принцип и последовательность построения плазмиды pL APC приводит в результате к замене последова40 тельности, кодирующей человеческий белок С на плазмиде pL РС, последовательностью. кодирующей другой белок С, из которой удалена

ДНК, кодирующая активационный пептид, В.К вирус получают из Коллекции куль45 тур американского типа, где он хранится под номером АТСС VR-837. Этот вирус поставляется в замороженно-высушенной форме и снова суспендируется в равновесной соли Хэнка с титром примерно 10 обра50 зующих. колонии единиц (pfu)/ìë.

Хозяином, выбранным для приготовления

ДНК вируса ВК; являются клетки человеческой эмбриональной почки (РНЕК).

Для получения данного вируса исполь55 зуют примерно пять полистироловых колб (75 мм ). содержащих сливающиеся монослои примерно 10 клеток PHEK. Примерно

1 мл ВК вируса титром 10 pfu/ìë вводят в

5 каждую колбу, которую затем ингибируют при 37 С в течение 1 ч, и затем вводят све1830081

28 жую питательную среду для разведения, в которой .содержится 10 эмбриональной бычьей сыворотки), и зараженные клетки инкубируют при 37 С в течение 10-14 дней или да тех пар, пока не выявлен полный цитопатогенный эффект вируса.

Данный вирус освобождают от клеток в ходе трех циклов замораживания-оттаивания и клеточные остатки удаляют путем центрифугирования при 5000Xg. Данный вирус осаждают в 1 л поверхностной жидкости и собирают путем добавления 100 г РЕ С-6000, инкубируют раствор в течение 24 ч при 4 С и центрифугируют в течение 20 мин при

5000Xg, Полученные гранулы растворяют в буферном растворе 0,1x SSC (IX SSC-0,15

Moil NaCI и 0,015 Мол Цитрат Na, рн = 7) при

1/100 исходного объема. Эту вирусную суспензию наносят в виде слоя на поверхность i5 мл раствора насыщенного КВг в пробирке, которая центрифугировалась в течение

3 ч при 75000Xg, Г1осле центрифугирования в растворе КВгобнаруживаютдве зоны. Нижнюю зону, которая содержит полный вирион, собирают и обессоливают в колонке на

$ерйадеФ6-50 с использованием ТЕ (10 мМол Трис-HCI, pH = 7,8, и 1 мМол ЕДТА) в качестве элюирующего буферного раствора.

В раствор очищенных вирионав, пол.ученных в данной колонке, вводят дадецилсульфат натрия фОЯ) до концентрации 1 g, вводят проназу (Сигма) пратеаза до концентрации 100 мкгlмл и раствор инкубируют при 37 С в течение 2 ч, Затем в раствор вводят хлорид цезия да плотности 1,56 г/мл и этидийбромид до конечной концентрации

100 мкг/мл, Данный раствор центрифугируют в роторе $огчаП 865 или в аналогичном вертикальном роторе при 260000Ха в течение 24 ч. После центрифугирования зону вирусной ДНК выделяют и экстрагируют пятикратно изоамиловым спиртом, насыщенным 100 мМол Трис-НС!, рН - 7,8. Этот раствор ДНК вируса ВК затем диализируют на ТЕ буферном растворе до тех пор, пока степень поглощения при 260 нм/280 нм не составит 1,75 — 1,90, ДНК осаждают путем доведения концентрации NaO до 0,15 Мол, ввода двух объемов зтанола, инкубирования данного раствора при -70 С в течение не менее чем 2 ч и центрифугируют этот раствор при 12000Х9 в течение 10 мин, Полученные гранулы ДНК вируса ВК суспендируют в буферном растворе ТЕ концентрацией 1 мг/мл.

Клетки Е,coli К12 HB101/pd BPVMMTneo получают в лиафилизированнай форме из Коллекции культур американского типа,. где они хранятся под номером АТСС

37224. Эти лиофилизированные клетки вы20

35 кции равным объемом фенола с последую5

55 севают на чашки с L-агаром, содержащие

100 мкг/Mn ампициллина, и инкубируют при

37 С, в результате получают изоляты одной колонии.

1 л питательного бульона L(10 r триптона, 10 г NaCI и 5 г дрожжевого экстракта на литр), содержащего 50 мкг/мл ампициллина, инокулируют колонией Е,coll К12

НВ101/pd BPV-MMneo и инкубируют в воздушном вибраторе при 37 С до тех пор, пока

О.Д. цю не достигнет 1 ед, поглощения, и в этот момент вводят 150 мг хлорамфеникола в данную культуру, Инкубирование продолжают в течение примерна 16 ч; ввод хлорамфеникала препятствует синтезу белка и, таким образом, дальнейшему делению клетки, но не препятствует дальнейшей репликации плазмиды.

Примерно 1 мг ДНК плазмиды pdBPVММТпео суспендируют в 1 мл буферного раствора ТЕ и выдерживают при -20 С, Когда желательно получение больших каличеств очень чистой ДНК плазмиды, то осуществляют процедуру извлечения плазмиды, описанную в примере 1

Г1римерно 5 мкг (5 мкл) ДНК плазмиды

pdBPV-MMTneo и 5 мкг (5 мкл) ДНК вируса

ВК, полученной, как описано выше, обрабатывают (каждую) при 37 С в течение 2 ч в растворе, содержащем 2 мкл буфера 10Х

BamHI (1,5 Мол NaCI, 60 мМол Трис-НО, рН = 7,9, 60 мМол MgCIz и 1 мг/мл В$А), 1 мкл (10 ед) фермента BamHI и 7 мкл Н2О.

Реакцию прекращают в результате экстращими экстракциями хлороформом. Затем каждую ДНК, обработанную BamHI, осаждают, извлекают путем центрифугирования и снова суспендируют в 5 мкл Н20.

Примерно 1 мкл буферного раствора лигазы 10Х вводят в смесь абрабатайной

BamHl плазмиды pdBPV-ММТпео (1 мкл) и

ДНК вируса ВК, обработанной ВааН! (1 мкл), После ввода в эту смесь ДНК 1 мкл (5 ед) Т4 ДНК лигазы и 6 мкл Hz0 полученную реакционную смесь инкубируют в течение ночи при 16ОС.

Клетки Е.соб К12 НВ101 получают в лиофилизираванной форме из Северной регионал ьной научно-исследовательской лаборатории, где они хранятся под номером

NRRl 8-15626. 50 мл культуры Е.coll К12

Н8101 в питательном бульоне L выращивают до получения оптической плотности при

650 нм (O,Д.ma) примерно 0.4 ед, поглощения. Данную культуру охлаждают ва льду в течение 10 мин и клетки собирают путем центрифугирования, Клеточные гранулы снова суспендируют в 25 мл холодного

100 мМол MgCb и инкубируют во льду в

1830081

30 течение 25 мин, Клетки еще раз гранулируют путем центрифугирования, и гранулы снова суспендируют в 2,5. мл холодного

100 мМол CaCIp и инкубируют в течение

30 мин во льду, После инкубирования данные клетки компетентны для поглощения трансформирующей ДНК, 200 мкл этой клеточной суспензии смешивают со сшитой ДНК, полученной, как указано выше, и инкубируют во льду в течение 30 мин, В конце этого периода клетки помещают в водяную баню с температурой

42 С на 2 мин и затем их снова возвращают на лед, где они находятся еще в течение 10 мин. Эти клетки извлекают путем центрифугирования, снова суспендируют в 1 мл питательного бульона и инкубируют при 37 С в течение 1 ч. Трансформированные клетки высевают на чашках с 1=агаром, содержащих 100 мкг/мл ампициллина. Трансформанты Е.coll К21 НВ101/pBKneot и E,colt

Kt2/pBKneo2 идентифицируют по их стойкости к ампициллину и путем анализа их

ДНК.

ДНК вирион аденовируса 2 (Ad2) представляет собой двухниточную линейную молекулу размером примерно 35,94 кЬ, Поздний промотор Ad2 выделяют на фрагменте 0,32 кЬ Acct-Pvull генома Ad2, этот фрагмент 0,32 кЬ соответствует последовательности между положениями нуклеотида

5755 и 6071 генома Ad2, Для выделения желаемого фрагмента 0,32 кЬ Accl-Pvult сначала Ad2 ДНК обрабатывают ферментом

Ball и выделяют фрагмент 2,4 кЬ Ball, который включает всю последовательность фрагмента 0,32 кЮ Acct-Pvult, Затем фрагмент 2,4 кЬ Batt обрабатывают рестриктаэами Acct и Pvult, в результате чего получают желаемый фрагмент, Примерно 50 мкг Ad2 ДНК (получаемая из BRL) растворяют в 80 мкл HgO и 10 мкл буферного раствора 10Х Ball (100 мМол

Fpec-HCI, рН = 7,6, 120 мМол MgCIz, 100 мМол ДТТ и 1 мгlмл BSA), Примерно 10 мкл (20 ед} рестриктаэы Ball вводят в раствор

Ad2 ДНК, и полученную реакционную смесь инкубируют при 370С в течение 4 ч.

Обработанную рестриктазой ВаН ДНК вводят в агароэный гель и подвергают электрофореэу. Визуализацию подвергнутой электрофорезу ДНК осуществляют путем окрашивания геля s разбавленном растворе (0,5 мкг/мл) этидийбромида и обработки данного окрашенного геля длинноволновыми ультрафиолетовыми лучами, Способ выделения ДНК из агарозы заключается в следующем, В геле в передней части желаемого фрагмента проделывают небольшую щель, и небольшой кусочек мембраны NA-45

ДЕЯЕ помещают в каждую щель, После дальнейшего электрофорвза ДНК образует нековалентные связи с мембраной ДЕАЕ, После того как желаемый фрагмент связывался с мембраной ДЕАЕ, мембрану удаляют и промывают слабо солевым буферным раствором (100 мМол KCI, 0,1 мМол ЕДТА и

20 мМ(л Трис-НС1, рН 8).

Затем данную мембрану помещают в

10 небольшую пробирку. и погружают в сильносолевой буферный раствор (1 Мол NaCI, 0,1 Мол ЕДТА и 20 мМол Трис-Hcl. рН 8). и затем инкубируют при 650С в течение 1 ч для удаления ДНК с бумаги ДЕАЕ, После

15 инкубирования при 65 С буферный раствор собирают и мембрану промываютсильносолевым буферным раствором. Этот сильносолевой промывочный раствор сливают с сильносолевым буферным раствором инку20 бирования, Объем сильносолевого раствора ДНК доводят до такого значения, чтобы концентрация NaCI составляла 0,25 Мол, и затем в этот раствор вводят три объема холодного

25 абсолютного этанола. Полученный раствор перемешивают и выдерживают при температуре -70 С в течение 10-20 мин. Затем этот раствор центрифугируют в течение

15 мин со скоростью 15000 об/мин. После

30 последующего осаждения с целью удаления остаточной соли гранулы ДНК промывают этанолом, высушивают, снова суспендируют в 20 мкл буферного раствора TE и в результате получают. примерно 3 мкг жела35 емого фрагмента Аб2. Полученный очищенный фрагмент растворяют в 10 мкл буферного раствора TE..

Примерно 5 мкл HzO и 2 мкл буферного раствора 10Х Accl (60 мМол йаС1. 60 мМол

40 Трис-НCI, рН = 7,5, 60 мМол МцО2. 60 мМол

ДТТ и 1 мг/мл BSA) вводят в раствор.2,4 кЬ

ВаП фрагмента Ad2. После ввода примерно

2 мкл (10 ед) фермента Асс! в раствор ДНК реакционную смесь инкубируют при 37 С в

45 течение 2 ч, После гидролиэа рестриктаэой

Acct ДНК извлекают путем осаждения этаналом и повторно суспендируют в 16 мкл

Н2О и 2 мкл буферного раствора 1ОХ Pvu Н (600 мМол йаС!, 60мМол Трис-HCI ° рН =7,5, 50 60 мМол Mg Ctg, 60 мМол ДТТ и 1 мг/кг BSA).

После ввода примерно 2 мкл (примерно 10 ед) фермента Pvuli в раствор ДНК реакционную смесь инкубируют при 37 С в течение

2ч, 55 Acct- Pvu ill фрагмент 2,4 кЬ Bali промотора Аб2 вводят в 6 полиакриламидный гель и осуществляют электрофорез до тех пор. пока фрагмент 0,32 кЬ Acct-Pvu Ilt. содержащий поздний nðîìîòîð Ad2, не отделяется от других продуктов гидролиэа.

1830081

Данный гель окрашивают зтидийбромидом, исследуют в ультрафиолетовом свете, сегмент геля, содержащий фрагмент 0,32 кЬ

Accl РчиИ, отсекают от данного геля, измельчают и пропитывают в течение ночи при комнатной температуре экстракционным буферным раствором (250 мкл) (50 мМол NH40Ac, 10 мЫол MgOAc, 1 мМол

ЕДТА и 0,1) SDS). На следующее утро смесь центрифугируют и гранулы удаляют.

ДН К в поверхностном слое осаждают этанолом, для гарантии полного осаждения желаемого фрагмента вводят примерно 2 мкг тРНК. Получают примерно 0,2 мкг фрагмента 0,32 кЬ Acct — РvuИ, который суспендируют в 7 мкл HzO.

Для превращения фрагмента Accl — Pvull в ограничительный фрагмент Acc! — ВсИ, связывающие линкеры ВсИ сшивают с фрагментом 0,32 кЬ Accl — Pvull, Поскольку линкеры ВсИ были с тупыми концами, то эти линкеры подсоединяют лишь к концу Pvull фрагмента, Линкеры Bell, которые имеют следующую последовательность:

5 -СТ6АТСА6-3

3 -GACTAGTC-5 обрабатывают киназой, 4 мкл линкера (2 мкг} растворяют в 20 — 15 мкл HzO, 5 мкл буферного раствора киназы 10Х (500 мМол

Трис-HCI, рН -7,6, и 100 мМол MgCtz) инкубируют в течение 2 мин при 90 С и затем охлаждают до комнатной температуры.

5 мкл p P-ATP (20 мкС!), 2,5 мкл 1 Мол

ДТТ и 5 мкл полинуклеотидкиназы (10 ед) вводят в данную смесь, которую инкубируют при 37 С в течение 30 мин. Затем вводят

3,35 мкл 0,01 Мол АТР и 5 мкл киназы и реакционную смесь продолжают инкубировать при 37 С в течение еще 30 мин. Радиоактивная АТР позволяет определить, сшиты ли данные линкеры с конечной ДНК.

Примерно 0,25 мкг (в 0.5 мкл) обработанных киназой линкеров ВсИ вводят в раствор фяермента 0,32 кЬ Ace!-Ð÷uÈ, затем в раствор ДНК вводят 1 мкл (1000 ед) Т4 . ДНК лигазы и 1 мкл буферного раствора лигазы 10Х:и полученную реакционную смесь инкубируют при 16 С в течение ночи.

Линкеры ВсИ сшивают лишь с концом Pvull ограничительного фрагмента Асс! — Pvull, Дальнейшее определение последовательности аминокислотных групп ДНК позволило обнаружить, что линкеры Bell связаны с концом Pvull фрагмента Accl—

PvuII, Эти линкеры ВсИ удаляют путем обработки Bell и повторной сшивки, однако экстралинкеры ВсИ не удаляются, поскольку эти связывающие звенья не принимают участия в функционировании факторов.

Клетки Е.coll К12 НВ101/psv2cat получают в лиофилиэированной форме из

АТСС, где они хранятся под номером АТСС

37155, и ДНК плазмы psv2cat выделяют из данных клеток с той разницей, что используют ампициллин с концентрацией 50 мкг/мл вместо тетрациклина. Примерно 1 мг ДНК плазмиды psv2cat получают и растворяют в 1 мл буферного раствора ТЕ. Примерно 3 мкг (3 мкл) ДНК плазмиды psv cat вводят в 2 мкл буферного раствора 10X Accl и 16 мкл воды, затем 3 мкл (примерно 9 ед) фермента Accl вводят в раствор ДНК

psv2cat и полученную реакционную смесь инкубируют при 37 С в течение 2 ч, Обработанную Acct плазмиду psv2cat затем гидрализируют ферментом Stul введением 3 мкл буферного раствора 10Х Stul (1,0 Мол NaCI, 100 мМол Трис-НС!, pH = 8,0, 100 мМол

MgCIz, 60 мМол ДТТ и 1 мг/кг BSA), 5 мкл

НрО и примерно 2 мкл (примерно 10 ед) фермента stui. Полученную реакционную смесь инкубируют при 37 С в течение 2 ч.

Реакцию прекращают в результате экстракции реакционной смеси один раз фенолом, а затем два раза хлороформом, Получают примерно 0,5 мкг желаемого фрагмента, который растворяют в 20 мкл буферного раствора ТЕ.

Примерно 4 мкл ДН К плазмиды psv2cat, обработанной с Acct-Stul, смешивают примерно с 7 мкл фрагмента 0,32 кЬ Accl-РчоИ (c линкерами Bcl) промотора Ad2 и после ввода 3 мкл буферного раствора лигазы 10Х, 15 мкл Hz0 и 2 мкл (примерно 1000 ед) лигазы Т4 ДНК реакционую смесь инкубируют при 16 С в течение ночи. Сшитая ДНК представляет собой желаемую плазмиду pLPcat, которая включает поздний промотор Ad2, находящийся в таком положении, что вызывает транскрипцию и, следовательно, экспрессию гена хлорафениколацетилтрансферазы.

Данную сшитую ДНК используют для трансформации клеток Е,соб К12 НВ101.

Трансформированные клетки высевают на чашках с !=агаром, содержащих 50 мкг/мл ампициллина, для идентификации трансформированных Е.соИ К12 НВ.101/pLPcat, осуществляют. анализ ДНК плазмиды на ограничительный фермент, ДНК плазмиды

pLPcat выделяют из трансформантов для использования в последующих построениях.

Примерно 88 мкг ДНК плазмиды рВКпсо! и 50 мкл буферного раствора ТЕ вводят в 7,5 мкл буферного раствора 10Х

Acct, 30 мкл Н20 и 15 мкл (примерно 75 ед) фермента Асс! и полученную реакционную смесь инкубируют при 37 С в течение 2 ч, Гидролизованную Асс! ДHK плазмиды рВКпес! вводят агарозный гель и фрагмент

1830081

33

5

15

1,4 кЬ, содержащий ген усилитель ВК, отделяют от других продуктов. Фрагмент 1,4 кЬ Accl извлекают из геля и очищают. Примерно 5 мкг данного фрагмента повторно суспендируют в 5 мкл буферного раствора

10Х Pvull, 45 мкл HzO и 5 мкл (примерно 25 ед) ограничительного фермента Pvull и полученную реакционную смесь инкубируют при 37 С в течение 2 ч, ДНК, обработанную с Мчи П, выделяют, очищают и приготавливают для сшивки. Получают примерно 2 мкг фрагмента 1,28 кЬ Accl — Pvull и растворяют его в 5 мкл буферного раствора ТЕ, Примерно 1 мкг ДНК плазмиды с LPCat растворяют в 5 мкл буферного раствора 10Х

Accl и 40. мкл HzO, Примерно 5 мкл (25 ед) фермента Accl вводят в раствор ДНК плазмиды р1 Рса и полученную реакционную смесь инкубируют при 37 С. Обработанную

Accl ДН К плазмиды pLPcat осаждают зтэнолом и снова суспендируют в 5 мкл буферного раствора 10Х Stul, 40 мкл Н20 и 5 мкл (примерно 25 ед) фермента, Stul и полученную реакционную смесь инкубируют при

37 С в течение 2 ч, Обработанную Accl ДНК плазмиды pLPcat осаждают несколько раз этанолом с целью очистки фрагмента 4,81 кЬ Accl-Stul, включающего источники

Е.coll репликации и поздний промотор

Ad2, от другого продукта гидролиза фрагмента размером примерно 4,81 кЬ. Получают примерно 1 мкг желаемого фрагмента 4,81 кЬ и растворяют его в 20 мкл буферного раствора ТЕ.

5 мкл фрагмента -4,81 кЬ Accl Stul плаэмиды plPcat вводят. в 5 мкл фрагмента

1,28 кЬ Accl — Pvull плазмиды pBlI,neoL После ввода 3 мкл буферного раствора лигазы 10Х, 15 мкл Н20 и 2 мкл (примерно 10 ед) лигазы

Т4 ДНК в смесь ДНК полученную реакционную смесь инкубируют при 16 С в течение ночи. Эта сшитая ДНК составляет желаемую плазмиду pBLcat.

Эту сшитую ДНК используют для трансформации клеток Е.coll К12 НВ101. Трансформанты Е.соН К12 НВ101/pBLcat идентифицируют путем анализа их ДНК.

ДНК плаэмиды pBLcat приготавливают для использования в последующих построениях.

Плазмида рИЗЗ может быть построена с использованием исходных векторных плазмид psv2gpt и рНС7 (получение плазмиды рНС7 описано выше в примере 1), с по. строением промежуточной векторной плазмиды psv2-НРСЗ, которую затем сливают с плаэмидой psv2- Р-глобином, и в результате получают плазмиду рЫЗЗ,, 50 мкл (50 мкг} ДНК плазмиды рНС7 смешивают с 5 мкл (50 ед) фермента Banl, 10 мкл реакционного буферного раствора

1ОХ Ball (1,5 Mon NaCI. 60 мМол Трис-HCI, pH = 7,9, 60 мМол MgClz и 1 мг/кг BSA) и 35 мкл HzO и инкубируют до тех пор, пока не происходит полный гидролиз. Затем ДНК плазмиды рНС7, обработанной с Banl. подвергают электрофорезу на 3,5%-ном полиакриламидном геле (29:1, акриламид, бис-акриламид) до тех пор, пока фрагмент

1,25 кЬ Rani не отделится or других продуктов гидролиза.

Область геля, включающую ограничительный фрагмент 1,25 кЬ Вэп1, отсекают от данного геля, помещают в испытательную пробирку и разбивают на небольшие фрагменты. 1 мл экстракционного буферного раствора (500 мМол NHpOAc, 10 мМол

MgOAc, 1 мМол ЕДТА, 1% SDS и 10 мг/мл тРНК) вводят в данную пробирку, содержащую указанные фрагменты, и пробирку выдерживают в течение ночи при 37 C. Для гранулирования клеточных осколков осуществляют центрифугировэние и поверхностный слой переносят в новую пробирку. Эти осколки промывают один раз 200 мкл экстракционного буферного раствора, поверхностный слой смешивают с первым поверхностным слоем от экстракции, осуществляемой в течение ночи. После пропускания поверхностного слоя через спрессованную стеклянную вату в этот поверхностный слой вводят два объема этанола и смесь перемешивают. Полученный раствор вводят в ван,ну сухой лед — этанол, где его выдерживают в течение 10 мин, и затем ДНК гранулируют путем центрифугирования.

Осуществляя данную процедуру, получают примерно 8 мкг фрагмента 1,25 кЬ

Вап!. Данный очищенный фрагмент суспендируют в 10 мкл буферного раствора ТЕ и выдерживают при-20 С. Фрагмент Banl модифицируют путем ввода линкера для построения плазмиды psv2-НРС8, фрагменты

ДНК, используемые для построения линкера. синтезируют.

500 пмоль каждой одиночной нити данного связывающего звена обрабатывают киназой в 20 мкл реакционного буферного раствора, содержащего 15 ед (0,5 мкл) полинуклеотидкиназы Т4, 2 мкл буферного раствора лигэзы 10Х, 10 мкл 50 мкМол АТР, и

7,5 мкл Н20. Данную реакционную смесь киназы инкубируют при 37 С в течение

30 мин и реакцию прекращают в результате инкубирования при 100ОС в течение 10 мин.

Для гарантий полной обработки киназой реакционную смесь охлаждают во льду, в реакционную смесь вводят 2 мкл 0,2 Мол дитиотреитола. 2.5 мкл 5 мМол ATP и 15 ед. полинукпеотидкиназы Т4, и эту реакцион35

1830081

36 ную смесь перемешивают и инкубируют еще в течение 30 мин при 37 С. Реакцию прекращают при дополнительном инкубировании втечение10мин при 100 С, изатем эту реакционную смесь охлаждают во льду, Хотя обработка киназой осуществлялась раздельно, две одиночные нити связы. вающего звена ДНК смешивают друг с другом после реакции с киназой, Для ренатурации нитей реакционную смесь киназы инкубируют при 100 С в течение 10 мин на водяной бане, содержащей 150 мл воды.

После такого инкубирования водяную баню отключают и охлаждают до комнатной температуры. что осуществляется в течение примерно 3 ч. Затем водяную баню, все еще содержащую пробирку с обработанной кинаэой ДНК, инкубируют в течение ночи при

4 С. В ходе данного процесса осуществляют ренатурацию одиночных нитей. Линкеры имеют следующую структуру;

5 -AGCTTTGATCAG-3

И!И!И

3 -ААСТАОТССАС6-5

Эти линкеры хранят при температуре -20 С до их использования.

Примерно 8 мкг фрагмента f,25 кЬ Banl вводят в 50 мкл линкера (500 пмоль), 1 мкл лигазы Т4 ДНК (5 ед), 10 мкл буферного раствора лигазы 10Х и 29 мкл HzO, данную смесь перемешивают и образующуюся реакционную смесь сшивки инкубируют при

4 С в течение ночи, Реакцию лигирования прекращают в результате инкубирования при 65 С в течение 10 мин, ДНК гранулируют путем ввода NaOAc до конечной концентрации 0,3 Мол, 2 обьемов этанола, охлаждения в бане со смесью лед-зтанол и последующего центрифугирования данного раствора.

Гранулы ДНК растворяют в 10 мкл буферного реакционного раствора 10Х Ара! (60 мМол NaCl,.60 мМол Трис-НС1, рН = 7,4, 6D мМол М9С!2 и 60 мМол 2-меркаптоэтанола),5мкл(50ед)фермента Ара! и85мкл Н О и реакционную смесь выдерживают при

37 С в течение 2 ч; Затем реакцию прекращают и ДНК гранулируют, как описано выше. Гранулы. ДНК растворяют в 10 мкл реакционного буферного раствора 10Х Hind

И!, 5 мкл (50 ед) фермента Hind И и 85 мкл

Н О, и реакционную смесь выдерживают при 370С в течение 2 ч, После обработки

Hind ill в реакционную смесь вводят 3,5%ный полиакриламидный гель, желаемый фрагмент 1,23 кЬ Hind lil-Ара! отделяют от геля и очищают, Получают примерно 5 мкл .желаемого фрагмента, который суспендируРеакцию лигации прекращают в результате инкубирования при 650С в течение 10 мин. После осаждения сшитой ДНК гранулы

ДНК растворяют в 10 мкл реакционного бу35 ферного раствора 10Х Ара1, 5 мкл (50 ед) фермента Ара! и 85 мкл HzO, и реакционную смесь выдерживают при 37 С в течение 2 ч, Затем реакцию прекращают и ДНК снова гранулируют. Гранулы ДНК растворяют в 10

40 мкл реакционного буферного раствора 10Х

89И! (1 Мол NaCi; 100мМол Трис-Hcl, рН =7,4;

100 мМол MgC4; 100 мМол 2-меркаптоэтанола и 1 мгlмл BSA), 5 мкл(50 ед) фермента

89!!! и 85 мкл воды, и реакционную смесь

45 выдерживают при 37 С в течение 2 ч. После обработки Bglii в реакционную смесь вводят:в 3,5%-ный. полиакриламидный гель, и желаемый фрагмент 0,19 «b Ара!-ВАМИ! извлекают, Получают примерно 1 мкг желве50 мого фрагмента, который суспендируют в 10 мкл буферного раствора ТЕ, и его хранят при температуре -20 С.

П римерно 10 мкг ДНК плаэмиды

psv2gpt (АТСС 37145) растворяют в 10 мкл реакционного буферного раствора 10Х Hind

l! l, 5 мкл (50 ед) фермента Hind ГИ и 85 мкл

Н20, и реакционную смесь помещают в условиях температуры 37 С в течение 2 ч, Затем зту реакционную смесь доводят до концентрации NaOA 0,25 Мол после ввода

30 ют в 10 мкл буферного раствора.ТЕ, и его хранят при температуре -20 С.

50 мкл (50 мкг) ДНК плазмиды рНС7 смешивают с 5 мкл (50 ед) фермента Pstl, 10 мкл реакционного буферного раствора 10Х

Pstl (1,0 Мол NaCI; 100 мМол Трис-HCl, рН = 7,5; 100 мМол MgClz и 1 мг/мл BSA) и

35 мкл Н О, и реакционную смесь инкубируют при 370С в течение 2 ч. ДНК плаэмиды рНС7, обработанную Pstl, подвергают электрофорезу на 3,5%-ном полиакриламидном геле, и желаемый фрагмент 0.88 кЬ очищают. Получают примерно 5 мкг желаемого. фрагмента, который суспендируют в l0 мкл буферного раствора ТЕ и хранят при температуре -20 C.

5 мкг фрагмента 0,88 кЬ Pst! вводят и смешивают с 50 мкл указанного ниже линкера, который был построен с помощью автоматизированного устройства синтеза

ДНК;

5 -GTGATCAA-3

ИИ!И!

3 -ACGTCACTAGTTCTAG-5

Примерно 1 мкг лигазы Т4 ДНК (10 ед), 10 мкл буферного раствора лигазы 10Х и 29 мкл

Н О вводят в смесь ДН К и полученную реакционную смесь сшивки инкубируют при 4 С в течение ночи.

1830081

40 ду pL PC

30

50

39

ДНК представляет собой желаемую плаэмиду Р! 133, Сшитую ДНК используют для трансформации Е.coll К12 RRI, желаемые трансформанты Е.coll К12 RRI/ðL 133 идентифицируют по их устойчивости к ампициллину; фенотипу и путем анализа их ДНК, Примерно 20 мкг ДНК плазмидЫ рВ! са1 растворяют в 10 мкл буферного раствора

10Х H I nd I I I и 80 мкл Н20, Примерно 10 мкл (100 ед) фермента Н!пд !И вводят s ДНК плаэмиды p8L cat, полученную реакционную смесь инкубируют при 37 С в течение 2 ч, ДНК плазмиды pBL cat, гидролизованную

Hind И!, вводят в агарозный гель и подвергают электрофорвэу до тех riop, пока фрагмент 0,87 кЬ Н!пб !И, включающий ген энхансер ВК и поздний промотор Ad2, не отделится от других продуктов гидролиэа; затем фрагмент 0,87 кЬ отделяют, очищают и обрабатывают для сшивки. Получают примерно 2 мкг желаемого фрагмента, который растворяют в 5 мкл буферного раствора ТЕ, Примерно 1,5 мкг ДНК плаэмиды pL 133 растворяют в 2 мкл буферного раствора 10Х

Hind !И и 16 мкл воды. 8 раствор ДНК вводят примерно 1 мкл (10 ед) фермента Hind ill и полученную реакционную смесь инкубируют при 37 С в течение 2 ч. Затем ДНК разбавляют до 100 мкл буферным раствором ТЕ, обрабатывают- 0,06 ед. щелочной фосфатазы кишечника теленка и полученную .реакционную смесь инкубируют при

37 С в течение 30 мин, Раствор доводят до содержания в нем IXSET (5 мМол Трис-HCI, pH = =7,8, 5 мМол ЕДТА и 150 мМол NaO), 0,3 Мол Na0Ac и 0,5 SDS и затем его инкубируют при 65 С в течение 45 мин. Обработанную Hind !И ДНК плазмиды р! 133 двукратно экстрагируют фенолом и однократно хлороформом, осаждают этанолом и снова суспендируют в I0 мкл буферного раствора ТЕ.

Примерно 5 мкл фрагмента 0,87 кЬ

Hind ill плазмиды pBL cat вводят в 1,5 мкг (10 мкл) плаэмиды pL 133, обработанной

Hind И!, затем 2 мкл буферного раствора лигаэы 10Х, 1 мкл (10 ед} дигазы ТН ДНК и 2 мкл Н2О вводят в данный раствор ДНК и полученную реакционную смесь инкубируют при 16ОС в течение ночи. Сшитая ДНК представляет собой желаемую плазмиду pL

PC. целью обнаружения Е.соИ К12 HB101/ðl

РС. Фрагмент 0,87 кЬ Hind !И. который кодирует ген-усилитель ВК и поздний промотор Ad2, встраивают в плазмиду pL 133, обработанную Hind И! в одной или двух ориентаций, лишь одна из которых дает плазмиПример 3. Плазмиду р! APC-Я$ строят с помощью сайт-специфического мутагенеэа.

При построении плазмиды р! АРС-IRS фаг М13 гпр18-НЕ1 подвергают сайт-специфическому мутагенезу с использованием следующего олигонуклеотида:

5 -CGCАGТСАССТОАААСGАССС

CGCCCCAGCCCCAAGCGGCGCCTCATTGA

TTGATGGGAAGATG — 3

Этот фаг, полученный в результате сайтспецифического мутагенеэа, обозначает

М13 rnp18-Н ЕЗ, Плаэмиду pL АРС строят с использованием двух фрагментов от плазмиды р! PC.

При построении плазмиды pL APC-%$ используют эти .же два фрагмента вместо фрагмента, полученного от плаэмиды р!

АРС, Поскольку плазмиды pL PC u pL АРСIRS очень близки по размеру, то довольно трудно отличить "источники"(плазмиды pL

РС) от плаэмиды pL APC-IRS. Однако ввиду того, что плаэмида рб APC меньше, чем плазмида pL APC-IRS, то, получая два фрагмента от плаэмиды pL АРС, можно легко отличить источники (плазмиды pL АРС) от желаемой плазмиды pL APC-IRS. Таким образом, для построения плазмиды pL АРСЯ$ фрагмент -0,7 кЬ Sst-$аИ фага М13 вр18-НЕЗ лигируют с фрагментом 3,76 кЬ

EcoRI-$аИ плаэмиды р! АРС и фрагментом

-2,0 кЬ EcoRI-Sstl плвзмиды р! АРС, Сшитая

ДНК представляет желаемую плаэмиду pL

АРС-IRS, которую трансформируют в Е.col!

К12 ЯЧЗ08. Образующиеся в результате трансформанты E,col! К12 RV308/pL АРСIRS используют для получения в больших количествах ДНК плаэмиды pL. АРС-IRS.

Пример 4, Клеточную линию 293 эмбриональной человеческой почки получают иэ Коллекции культур американского типа, где она хранится под регистрационным номером АТСС CRL. 1573, Трансформированную аденовирусом клеточную линию золотистого хомячка AV12 также получают из

Коллекции культур американского типа, где

Эту сшитую ДНК используют для трансформации E.coll К12 НВ101. Трансформированные клетки высевают на чашки с ! -агаром, содержащим ампициллин, и ДНК, стойких к ампициллину трансформантов, исследуют путем анализа на фермент с

55 она хранится под регистрационным номером АТС CRL 9595.

Клетки 293 получают из коллекции культур АТСС, где они хранятся под регистрационным номером CRL 1573, в колбе 25 мм . содержащей сливающийся монослой примерно 5,5 х 10 клеток в минимальной основ41

1830081

42 ной среде Eagle (Glbco) с содержанием 10ф, инактивировэнной нагреванием лошадиной сыворотки. Колбу инкубируют при 37 С, среду заменяют дважды в неделю. Среда состоит йз ДМЕМ (Glbco),, снабженной 10)(, эмбриональной телячьей сыворотки, 50 мкг/мл гвнтамицина и 10 мкг/мл фитон дион витамина К водного MEPHYTQN, Клетки субкультивируют путем удаления среды, промывки равновесным солевым раствором НапК (61Ьсо), ввода 0,25$ трипсина(содержащего 0,2 г/л ЕДТА) в течение

1-2 мин, промывки свежей средой, отсасывания и ввода в новые колбы при степени субкультиэации 1:5 или 1: l0.

За один день до трансформации осуществляют высеванив клеток при норме

0,7 x tO клеток на 100 мм чашки. Стерильную осажденную этанолом ДНК плаэмиды, растворенную в буферном растворе ТЕ, используют для приготовления раствора 2Х

ДНК вЂ” СаО?, содержащего 25 мкг/мл ДНК трансформирующей плазмиды (для трансформаций плэзмиды pL APC-fRS используют плээмиды; плаэмида pL АРС-И$ и плазмидэ, которая содержит отбираемый маркерный ген, кэк обсуждается ниже) и

250 мМол СэОз. йриготавливают раствор

2Х HSSS, содержащий 280 мМол йаО, 50 мМол Нврез и 1.5 мМол фосфата натрия. с регулированием величины рН до 7.05-7,15, Раствор 2Х ДНК-CaClz вводят по каплям в равный объем стерильного раствора 2Н

HBSS. Одномиллитровую пластмассовую пипетку с ватной пробкой вставляют в перемеаиаающую пробирку. которая содержит

2Х HBSS, и вводят в нее пузырьки путем продувки с одиоаремвнным вводом ДНК.

Происходит осажденив фосфата «альция—

ДНК при комнэтной температуре в течение

36-45 мин без перемешивания.

Затем данный осадок перемешивают путем осторожного забора пластмассовой пипеткой и 1 мл (на чашку) осадка вводят непосредственно в 10 мл питательной среды разведения, который покрывает клетки реципиента. После инкубирования при 37 С в твчейие 4 я данную питательную среду заменяют свежей средой и клетки инкубирукл дополнительно в течение 72 ч, после чего подвергают воздействию выбранного давление. Для плаэмид, которые не включает отбирэемый маркерный ген. функционирующей в эукариотических клетках, таких как плазмидэ pL АРС-Я$, в процедуре транс" формации используют смесь плазмид: вектор экспрессии, в котором отсутствует отбиреемый маркерный ген, и вектор экспрессии, который включает отбиравмый маркерный ген, функционирующей в эука10 лять отбор клеток, которые содержат

25

35 Использование дигидрофолятредуктаэ40

50 риотических клетках. Ряд векторов доступен для использования В таких системах котрансформации, и они включают плаэмиды рзч2-dhfr (АТСС 37146), psv2-пео (АТСС

37149), psv2-gpt (АТСС 37145) и psv2-hyg (RRL B-18039). Плаэмида рзч2Ьу9 обеспечивает стойкость к гидромицину эукариотическим клеткам-хозяевам. Такой способ контрансформации позволяет осущвствплазмиду с отбиравмым мэркерным геном. Эти клетки дополнительно исследуют для идентификации клеток, которые включают обе трансформирующие плазмиды, Для клеток, трансфектированных плаэмидвми, содержащими придающий стойкость к гидромицину ген, гидромицин В вводят в среду разведения до конечной концвнтрации примерно 200 мкг/мл. Эти клетки затем инкубируют при 37ОС в течение 2-4 недель с заменами среды с интервалами на

3-4 день, Полученные стойкие к гидромицину колонии переносят в отдельные колбы с культурами для определения их характеристик. Плаэмида рзч2-пво сообщает стойкость к неомицину (G418 также используется вместо неомицинэ), и отбор стойких к неомицину колоний осуществляют в основном согласно процедуре, используемой для стойких к гидромицину клеток, с той разницей, что вводят G 418 до конечной концентрации 400 мкг/мл.

pro(dhfr) гена или придающего стойкость к метотрексату произаодного гена dhfr (dhfrmtx) э качестве отбираемого маркерного гена для ввода гена или плаэмиды в клеточную линию с дефицитом бЫги последующее использование мвтотрвксэта для усиления экспрессии данной плазмиды известно.

Клетки 293 являются позитивными dhfr клетками, так что трансформанты 293,.которые содержат .плаэмиды, включающие ген

dhfr, не отбираются исключительно на основе dhfi-позитивного фенотипэ, который способен расти в питательной среде, гдв отсутствуют гипоксантин и тимин. Клеточные линии, в которых действительно отсутствует функциональиый ген dhfr и которые трансформируются плэзмидэми, содержащими dhfr, отбирают на основе dhfr фенотипа.

В результате трансформации клеточных линий 293 и АЧ12 смесью плазмиды pt АРСЯВвектора. придающего стойкость к гидромицину, и последующего отбора на стойкие к гидромицину клетки получают ряд трансформации. (Другие трансформации осущв43

1830081

44 ствляют с использованием плэзмиды ysv2neo в качестве контрансформирующего вектора и путем отбора на стойкие к G 418 клетки), Эти трансформанты анализируют. как описано в примере 5, для определения, какие стойкие к гидромицину клетки содержат плазмиду р1 АРС-fRS.

П р и м е.р 5, Стойкие к гидромицину трансформанты, полученные по примеру 4, выращивают в чашках ía t00 мм культуры ткани плотностью несколько сотен клеточных клонов на чашку с культурой ткани.

Данную среду декантируют и клетки двукратно промывают 5.мл эликвотэми равновесного солевого раствора Нэпй (Gtbco).

Раствор стерильного 0,45$ агара (агароза типа Сигма 4) приготавливают путем смешивания 1. Mn 1,8 агара (47® с модифицированным Dutbecce солевым раствором (ДМ Е) Eag fe (6 i@co) (37 С) и 2 мл этого 45ф раствора агарэ наносят слоями нэ клетки.

Нитроцеллюлозные фильтры кипятят и затем обрабатывают в автоклаве в течение

2 ч для удаления смачивамицего агента, который токсичен для клеток. Затем фильтры помещают сверху агарового слоя, и после того как воздушные пузырьки удалились, чашки инкубируют при 37 С в течение 1-3 ч.

Данные фильтры с предварительно сделанными метками для указания исходной ориентации фильтра нэ чашке с тем, чтобы облегчить последующую идентификацию колоний, затем удаляют и помещают в PBS {50 мМол Трис-kCf; рй -7,2, и f50 мМол ИаО).

Для сохранения клеток на чашке жизнеспособными входе анализа на данных фильтрах, клетки покрывают слоем, состоящим из 8 мл смеси, содержащей 2 мл 1,8 агара (47 С). 2 мл солей ДМЕ (37 С) и 4 мя солей

ДМЕ с 207 эмбриональной бычьей сыворотки (37 С). Затем клетки помещают в инкубатор при 37оС

Все промывки и реакции осуществляют на фильтрах. которые помещают на качающейся платформе. Эти фильтры сначала блокируют путем инкубировэния при комнатной температуре в ба молоке: s PBS.

Затем зти фильтры четырехкрэтно промывают(5 мин) a PSS. 8 фильтр вводят Юмкг/мл биотинилированного поликлонааьногр антитела козьего античеловеческого белка С е

2,57 альбумине бычьей сыворотки (достаточные количества для покрытия фильтра) и затем осуществляют инкубировэние при

31 С в течение t ч, Проводят очистку белка С для последующего использования и получения антитела против. белка С.

Фильтры промывают четыре раза PBS при 4 С. Затем. приготавливают эвидин и биотицилированную пироксидээу редьки полевой. Фильтры инкубируют с конъюги5 ровэнным с HPP эвидином Д в течение 1 ч при 4 С (более длительное время инкубировэния, например в течение ночи, может быть использовано при секретировании небольших количеств белка), затем фильт10 ры четырехкратно промывают PBS npu

4о

Для проявления цвета индикатора на фильтрах примерно 30 мг проявляющего, цвет реагента HPP (4-хлор-1-нафтол, Sigma), 15 растворенного в смеси лед — холодный 100 метанол, вводят в 50 мл PBS и 30 мкл 30;

Н О . Эту смесь вводят в нитроцеллюлоэные фильтры, которые инкубировались при комнатной температуре до тех пор, пока не

2р проявлялся цвет, Колонии, секретирующие большинство человеческого белка С, обнаруживают на фильтре не только по раннему . проявлению цвета, но и по более темным пятнам на фильтре;

После проявления фильтров их снова выравнивают с исходными посевами на чашках для того,.чтобы определить, какие колонии ассоциировались и с какими точками не фильтре. Затем колонии, секретирую30 щие большинство человеческого белка С, отбирают и используют для продуцирования активированного человеческого белка С.

fl р и м е р 6. Супернэтэнт отделяют от клеток, зкспрессирующих рекомбинантный продукт, и очищают на колонке фармация . Моно-о, Около 1 мл смолы уравновешивают

20 мМ Трис-HCI (pH 7,4), 0,15 M NaCt. Куль гурэльный супернэтант доводят до рН 7,4 путем прибавления Трис-HCI (рН 8,0) и до40 водят до 0,15 М NaCt путем прибавления t

М NaO. Супернатант нагружают на смблу в колонке и промывают тремя объемами колонки Трис-НС! (рН 7,4),0,15 M йаО, Рекомбинантный продукт злюируют из колонки с

45 использованием буфера для злюирования, содержащего 0,4 М NaCf в 20 мМ Трис-HCI (рН 7,4).

Удельную активность продукта определяют следующим образом: концентрированный продукт из кол оночно го злаента вначале активируют комплексом иммобилиэованный тромбин — тромбомодулин, Амидолитическую активность продукта измеряют гидролизом трипептидного субстрата S-2238 (полученного иэ Хелена Лэбораториз). Янтикоэгулянтную активность продукта определяют пролонгировэнием времени активированного частичного тромбопла45

1830081

>»

1{g}I->>!Е," !.;г „ ;,13 ; г>11 г1!}7 я II I.Ец

Ы1 }, 6„,> Т}))„Р}(О Л1,Л Р,О } ЕI ЛЯР ЕЕР V/(L P;IE. R S).-,(Si-:I, 61,Ц Л};6

}3)А lii". 6Е .! >Лт, l.i U )>6 ii,E ЛК6 !.,YS Л}(6 .,i.l ЛЫ ПЛ РШ; ЕЕЦ 6ЕЦ ;1>!., 1ЕЦ 6)Ц Л)6 6)Ц CYS, 11,. -,. Ц 61Ц т1Е С-У (. 1}Ц !.ЕЦ Лт.6> })T.

Р}; (т >} !} 1> ° т ЯР ЛSP Т}!! 1 ЕЦ

1ЕЕ

ы s .,,т,i(Л :.1 P})Е 6),li

ЛЕЛ

hI. Р)}е т}(р s}1 T,"= )ц;: 4ц лир 61,у лир GLN cYs 1.ец v/3L 1.е1! Р}(О

CYS 617У }i ii S GLY T)!}(CYS I LF

I,}.I} (:L>i! !11)> j>)IO С > } Л>!.Л Ч! 1> ->-1 Ц

CYS. с; Р (- 1, (1 }> 1, (т, ;,Еl; P) }E S}. }> .СУБ >" S } C S,1(6 <;}. ) GI Y Ti> P GI Ц 6 LY 31(6 l "iil ..СУ6 6).)} Л)(6 61/Ц 3>Л1, S>EI(Р)!Е Li.i! AS>" CYS SEh LEU hS} Л.".>)(1"..:.}1 YS 1,ЕU GLU GLU Л1, 61. ТР,Р

Б} .)1 С"> Б Лбfl Р})О 6Ы }У)(1ХБ ).ЕЦ 61Y ЛИР ЛЯР 1ЕЦ LEU GL?I CYS 1)IS

)>1(О >(1}Л УЛЕ ЕYS 1 liE I )ß С S GLY Л}16 > }>О T}11 LYS ARG )LET GLU I.YS

LYS Л)16 Л}16 1. U

».1».>

* >n

>, 3>К Л}(6, Е}(li I 1S,ЕЦ I:3S,1)>6:>1>О f>BG Р1>О :Е}(РВО TRP GL!.> Ю1. 1 Л) 11,1; Л.;Р 61,1 т,; 1)1;т 111); Л}(6 Л}(6 61„> >ЯР })Е-;;

/1,Л 7Л1, LEU 11.1. })1Я

I.E i! ),),Ц Л}}i .">Е}> LYS 1ЛБ 1. 1 6 LEU Л (.Л CYS 61. > р)((1,-,1 1; }1)> vhi, I.}. I} пц, h).f(лел liis су.;;!ет лир GI,U si;l(i. }} 11;Ц Vh), Л}(6 i.ÅÏ 61У 6IЛ Т"I (I ASP I.ЕЦ Л}(С ЛР>6> TI(P GLU LYS T}()

G),Ц 1.1;U Л:>} 1. U ЛИР I LI . LYS GLU УЛ1, Р))Е УЛ1» 111 Я Р)(О Л>>>> TY}(>Е}(1.ЕЦ ЛЕЛ GLN Р)>О

),У6 .;1:.i(! }1}(Tli! Л} ЛЯ! >SP

ЛЕЛ LEU 1:ЕЦ

1 I.Е стина с использованием реагентов из Хелена.

Формула изобретения

CIIoc05 !loll j l8H!I!> p8I омб >IIBHTIHOI O BKтивированного балка С человека, закг(юча:ощийся в том, что осуществляют трансформацию штамма культивируемых клеток АТСС CR4 9599 ит}и А) СС CR4 15(3 рекомбинантной пла>зм(!дно>й,Ь,! !1., YOДиоующей активированный белок С человека и содержащей сигнальный пептид и пропептиД ) карбоксилирован ного С8кретирован" ного белка, легую цаг ь ",8ë088 ес ого белка

С, дипептид лизин-аргиIIëí, или лиз.-:,;-лизин, или аргинин-аргинин, последов 1тельность расьцепления для ассоци(1,;..уев :ой с клеткой про>еазь, КOIOpB;.T предсгаьляет ÎбОй РЛО-АР6-Р)(С! — -::}=Г .— ARG-А1(Г и а.(»1;— ви рован ную Ta>" 8 1YIO,(еп,, >., слог>е>че>с (0(0 белка С, I(Yn>ü !1Виро =.Bl! I.;8 Гранс<)>0}31>13100ванного шта .T".а 293/р! АВС-!РS ил>1

АЧ12/р! АС вЂ” !ВЯ. Bl,lä8ï8HII8:::: оч(}стку б лка

С, при атом плазмидную ДН констp/ .>>р>> от (3 833/f! 1>ТВ Т8 Л11ГИ>130(!а n!!:I ф(> 3 > IOI-, TB Я >. 1—

SBI1 )>азмсром О, / кЬ Гlлазмиды ОН С / с большим фрагментом Sst1 — За)1 фага М13 mp 18 с получением фага М13 mp 18 НЕ1, проведения сайт-специфического мутагенеза в фаге М13 mp 18 — НŠ— 1 с

5 использо анием олигонуклеотида 5 GCGCAGTCACCTGAAÀÑ6ÀÑÒÑÀÒÒ6ÀÒG

GGAAGAT6A-3 с получением фага M13 mp

18 — НЕ2, лигирования фрагмента Sst1 — SBI1 размером 0,7 кЬ фага М13 mp I8 — Н 2 с фрагментом EcoRI-SBI1 размером 3,76 кЬ плазмиды p! PC и фрагментом EcOR1 — Sai1 размером 2,0 кЬ плазмиды р! РС с получением плазмиды р1 АРС, затем проведения сайт-специфического мутагенеза

15 в фаге М13 mp 18/ IE1 с использованием Ол l(го llуклеотида 5 С6СА6ТСАССТGAААС6АССССGССС

САС С С6 CAAG COG CC CCTCTТ6АТ666АА

6АТ6- 3 с Oбоазованием фага М13 гпр 18—

20 E3 и лигированием фрагмента Sst1 — Яэ!1 фрагментом Есо)}х1--SBI I размером 3,76 кЬ

ofI!»s >>>(I,(IsI р!. АРГ и фоаг" 18I(TO>h.) EcOR1 — Ss(1 раз(Зеро .1 2,0 кЬ г;лазмиды р(АРС и образова1 ием плазмиды pL АРС вЂ” IRS.

1.ЕЦ I EU P}}E УЛ: ЛЕЛ 11)11 1 }>Р GLY 1 1.Е!

830081

47

И.Л Tlllt LEU SER GLN THR II.E VAL PRO ILE CYS LEU PRO ASP SER GLY

ЫО ЛЬА СЫ ЛВС G111 Ии ASN C M ALA СЛ СЬК СЫ ТНВ LEU VAI ТИИ

GLY TRP GLY TYR Н1Б SER SER ARG GLU LYS GLU ALA LYS ЛВС ASN ARG

Tl1R-PHE-VAL 1.FU ASN PHE П.Е LYS ILE PRO VAL ЧЛТ, PRO 111$ ASN 6Ы

CYS ЗКВ GIU ЧИ.

ИЕТ SER ASN tlET VAL SER GLU ASN ИЕТ LEU CYS ALA

ASP ARG GLN hSP ALA CYS GLU GLY hSP SER GLY G1Y

GLY ILE LEU GLY

PRO ИКТ VAL ALA SER PHE HIS GLY ТИВ TRP PIK LEU VAL GLY LEU VhL

SER ТН1 СЬУ GLU СЬУ CYS GLY IEU LEU HIS ASN TYR GLY VAL TYR,THR

LYS VhL SER ARG ТМВ LEU ASP TRP ILE HIS GLY HIS ILE АКС ASP LYS

GLU ALA PRO GLN LYS SER TRP ALA PRO-CÎÎÍ

Табли ца !

Последовательности протеолитического расцепления для ассоциированных с клеткой протеаз

Последовательность (использование однобуквенной аббревиатуры) Источник

° е

Ф

РГРБР1 "1.

Рецептура инсулина

Белок С

Инсулин фактор Х

Глюкагон

Белок С фактор JX

Фактор Х

ЩЙ1ЕИГ (f& Й1Т1Ж

Глюкагон

Пептид-вставка 1

CL РС

Пептид-вставка 2

NRDDIhI R

L VRG1Ж1Л

IVEr.LGIut

Активатор плазминогенной ткани

Пептид с концевой аминогруппой

IKRs 11Ь IIR

L EGSL QKR u PVPKTItR

ЯТЬ ЕВГЕН

M YQCSWg

ЯЧ LRIPJ R

R PI st

:ХН.АПТЕК

ARE ItRG Ë11

Таблица 2

1830081

Эукариотические клетки реципиенты

Происхождение

Клеткахозяин

Пояснения

Источник

ГепатобластомЭ *АТС//Н08065

HepG-2

Почка аФриканской АТСС/ CCL 70 зеленой обезьяны

СУ" 1

Почка обезьяны макак

Исходная

ЬЬС-ж

АТСС/ССЬ 7

АТСС//CCL 7,1 Растет быстрее, чем

АТСС/СС1 7

Почка обезьяны макак

Фибробласты мышиного эмбриона

3Т3

АТСС/CCL 2

ЯТСС//ССЬ 61 Необходимость пролина, Из данного хозяина могут быть образованы производные СИО-К1, такие как

dhtv — производные ДХ011

СНО-К1

Яичник Китайского хомяка

АТСС/ССЬ 2

Зпителоид шеи человека

HeLa

АТСС//ССЬ 155 Секреция легкой цепи типа XgG лямбда

RPM18226 Ч еловеческая миелома

Гепатома крысы

Н411ЕС3

АТСС/СЕЬ 1600 Из данного хозяина могут быть получены такие производные, как стойкие к

8"азагуанину клетки хозяева FAZA

Мышиный фибро- АТСС//СГЬ 1616 бласт

С1271

Н S-Сюлтан

Почка детеныша АТСС//CCL 10 хомяка

ВНК" 21 Коллекция культур американского типа, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852-1776

Составитель H. Куэенкова

Техред M. Моргентал Корректор С, Патрушева

Редактор

Заказ 2490 Тираж Подписное

В НИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, yn,Ãàlaðèíà, 101

Производ" ные от

LLC-МК

Клетки человечес- АТСС//ПЬ 1484 кой плазмы

Плазмоцитома

0 патенте ClJA

l393133 описывается использование данной клеточной линии