Способ получения конъюгированных производных барбитуровой кислоты для иммунохимического анализа барбамила
Использование: в качестве реагента для иммунохимического анализа барбамила . Сущность изобретения: продукт конь юг эт 5-и зо ам и л -5 -(5 -к ар бокс и пен - тил)барбитуровой кислоты и бычьего сывороточного альбумина. Реагент 1:5- и з о а м и л - 5-(5 -к а р б о к с и п е н т и л) барбитуровая кислота. Реагент 2: изобутилхлорформиат. Реагент 3: бычий сывороточный альбумин. Условия процесса: в диоксане при рН 8-9 и температуре 0-10°С. Ё
(;<>Y>з (:(>Br t(ких
СОЦИАЛИСГИЧЕСКИХ ! F c (I v r> л и v. (si)s С 07 О 239/62
ГОСУДАРСТВЕнНОГ> ПАтГHTHOE.
ВедОмстВО ссср (ГОCllATEHT СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ, К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4906444/04 (22) 31,01.91 (46) 07.08.93. Бюл. N. 29 (71) Московская медицинская академия им.
И.М.Сеченова и Химический >экультет МГУ им, М.В.Ломоносова (72) С.А.Еремин, А.A.Щеголев. А.М.Егоров, А.Н.Ермаков и Б,Н.Изотов (56) Coibert О.L. et al. "Single-reagent
polarization fluoroimmunoassay for
barbiturates in Wiene" Clln. Chem. 1984, vol.
30, М 11, р. 1765, (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЬЮГИРОВАННЫХ ПРОИЗВОДНЫХ БАРБИТУРОИзобретение относится к способу получения новых коньюгированных производных барбитуровой кислоты, обладающих свойствами реагентов для иммунохимического анализа барбамила, которые могут найти применение в иммунохимическом анализе.
Целью изобретения является получение коньюгированных производных бар битуровой кислоты с иммуногенным носителем, обладающих более высокой чувствительностью и позволяющих снизить процент перекрестных реакций при иммунохимическом анализе барбамила.
Указанная цель достигается способом получения коньюгатов бычьего сывороточ-. ного альбумина (БСА) с 5-изоамил-5-(5 -.карбоксипентил)-барбитуровой кислотой, предварительно модифицированной изобутилхлорформиатом.. Ы 1832122 А1
ВОЙ КИСЛОТЫ ДЛЯ ИММУНОХИМИЧЕСКОГО АНАЛИЗА БАРБАМИЛА (57) Использование: в качестве реагента для иммунохимического анализа барбамила. Сущность изобретения: продукт коньюгат 5-изоамил-5-(5 -карбоксипентил)барбитуровой кислоты и бычьего сывороточного альбумина. Реагент 1; 5изоамил-5-(5 -карбоксипентил) бэрбитуровая кислота, Реагент 2: изобутилхлорформиат. Реагент 3: бычий сывороточный альбумин. Условия процесса: в диоксане при рН 8-9 и температуре 0 — 10" С. ай
Способ осуществляют следующим обра- СO зом: к раствору 5-изоамил-5-(5 -карбокси- (Д пентил)барбитуровой кислоты в диоксане. добавляют тризтиламин, для связывания выделяющейся при реакции соляной кислоты, и при охлаждении добавляют изобутилхлорформиат. Полученную реакционную смесь перемешивают в течение 3 мин при
0-10 С и добавляют к раствору БСА в 0,01
M карбонатном буфере (рН 8 — 9) в мольном соотношении 50;1 — 100:1, выдерживают при
0 — 10 С в течение 24 ч, Полученный продукт очищают диализом в проточной воде в течение 2 дней и затем лиофилизуют, Количество остатков барбитуровой кислоты, ковалентно связанных с молекулой
БСА, устанавливают спектрофотометрически по разнице содержания свободных аминогрупп в исходном белке и полученном конъютированном антигене, применяя в ка I 832 1 22
По описанной методике из 31 мг (100 мкмоль) 5-иэоамил-5-(5 -карбоксипектил)оарбитуровой кислоты и 70 мг(1 мкмоль)
БСА при рН 9 и температуре 0-.10"С получают конь!Огированный антиген, в котором с
Одной молекуло!л БСА ковалентно связано
18 — 20 f!oneKyn 5-иэоамил-5-(5 -карбоксипент!лл)барбитуровой кислоты.
П р и м с р 3. Антигеннь!е свойства полученных кокъюгатов.
Кроликов иммунизируют подкожно, введением конь!Огированного антигена, в котором с окой молекулой БСА ковалентно связано 14 — 1б остатков барбитуровой кислоты, 14!4муь!и!эаци!о проводят 50%-ной змульслей водного раствора кокьюгата и !
loi! li;!f 6 3!!1кова!!та Ф рейкД3 В Д036 2 МГ/кГ, B ге«!BMM 3 недель с и1!тервалом 7 суток.
Реиммгукизаци;о осуществляют через месяц, в ге !61!Ие 3 дней, ежедневно Вводя коньюгат в дозе 5 мг/кг внутривенно. Через неделю
О 1 бира ют крог ь и выделя !от сыворотку. ИммуIfM33 Jfllo кроликов кокьюгированным.антиге1ю", В отором с молекулой БСА связанб
18-20 остатков барбитуровой кислоты, осу1цссгвпя!От ак nor!n;1IO. Актигенность всех получекi ых соединений Определяют по количеству 3;, глтел, икдуцируе,"4ых коньюгатом, с
lIof4ощью Грлмого поляриэационного флуо ) и .0 рои!1муг!о;!! Ieèneà. Полученные значения тиров актисывороток представлены ниже.
Copep»K3íM6 5-иэ031мил-5-(5-карбоксипокт1,n) барбитуровой KMcffoTBI в кокьюгате, мол. 14 — 1б! Йтр анч«лсыВОротки
i:1200 — 1;1800
1:2400 — 1:3200
18 — 20 честве ре»««ГОН!3 Iа аминогру11п ы трик1!тГ)0 бек зол сул ьф О ол сл Оту, 1- !!жеci:eä«(loaf!6 поимерь! ил л!Остри р( ют синтез кокьюгироваf ных производных
ОB., глт . ООВОЙ КИСЛОТЫ и ИХ ИСГIОЛЬЭОВЛ!!Ие
Для 311 3лизс! Оарбамила.
Пример 1, Получение кок IOI3r3 бычьего сывороточного альбу1г!ика с 5-иэо3 м и л 5 (5 K3 р 5 o I c M ï е к т и л «) 3 p G M T «(р О В О Й
КИСЛОТОЙ «ПОИ СООТНОЦ;611ritrl 1« 50)
K раствору 31 мг (100 мкмопь) 5-!Bоамил-5- 5 -ка рбо к си и е !тип)1б ар би туро вол кислоты В f::Iл Дио ксана Д1)б ) B!I B!O) 50;,1кл тризтил314«лка, охлакда!От до 0-10"С и qoбавляют 20 4K3 leoo«(T!43!!i!oP 0-10 С в течение 2 — 3 IMН M!...3 ге;4 с Iccь г!о" бавляют к раствору 140 м! 2 м.:а 4!)1! ь1 БСА B 5 мл 0,01 Vl карбон31кого ауfrep3 (р!-I 8л содержащему 5 мл,гиокс31!3, Ра;-,;:!!!!le ведут 24 ч г ри 0 — 10"С. Сиктеэирова!!Нььй ко!Л,ioгат выделя!от диализом в проточкой Воде в течение 2 дней и затем лииф!, i!!3! руют. 13 гloRó енном продукте с одно«! 1Иолекуло14 БСА ковалентко связано 14 — 1 б молекул 5изоа 4Mil- -(5 -карбок1 ипек1ил1".,:.: рбг:-!Гуровой кислоты, П р и м 6 р 2. Г1олу Iell!Ie I окь!о! ата бычьего сыворото1кого альбу:;!ика с 5-иэо3l4Mi1-5-(5 -ка р б о к с и и е т !!1!)!)»э р биту ро Г16 и кислотой (при соотноц!е!!и!! 1;100), Получеlí1ый конь!огирова! Iíûé ант!!Геи Mf4pff«41rlp«(eT «(ЖИВОТНЫХ ВЫСОКОСГ1611И1!«ИЧ ные антитела к барбамилу. Перекресгныо реакции с другими структурно-подобными соединения!«!и ке превь!!1!3!о 8%. Пример 4. Опре„ге !ОН!16 бароамила с помощь!о реагентов на О!. с!36 5-иэоа IMtl-5(5 -карбоксипентил)барби уровой кислоты, В плаcTмассовые контейнеры, помещенные в !1Змерительку!о карусель с к1овеT3l4и, внОсЯт по 50 мкл мОДель ;!Ых Об)оаэцов мочи, содержащлх различные концентрации барбамила, Разбавленная в 40 раз кроличья 3 IETIrfcBI BopoTK3 тротив барб 1ми1!3, раствор р аминофлуоресцеи!и локзрбамилэтиламиД3 5-1130314M/I-5-(5 -карбоксипентил)оарбит(poBGA кислоты в концентрации 139 нмоль/л и фосфатныЙ буфер (pH 7,6), СОД61)жаlЦий Г бычь6ГО Гамма 1лОбулина и 1 Г заида натрия, налива!от В TpM Отдельных флакона, «(станoвл6нкых В ОдгlОЙ сГ)ециаль" ной коробке, Коробку с реагектами и кар 35 сель «/стакавллва!от в прибор(ТЦХ-анализаfop фирмы "gibbon"), который автоматически выполняет анализ по заданной про рамме. Концентрацию барбамила в обраэцс мочи г!рибор авто1латически опреде40 ляет по величине поляризации флуоресценции на построенном заранее и хранимом B памяти прибора калибровочном графике; концентрация барбамила — поляризация флуоресценции. Чувствительность 45 определения 2.2 х 1 M барбамила в моче. Таким образом, предлагаемый способ получения позволяет повысить чувствительность определения барбамила в 2,5 раза, а 50 % перекрестных реакций уменьц!Ить с 100 до 8%. Формула изобретения Способ получения конъюгированных 55 производных барбитуровой кислоты для иммукох11м11ческого анализа барбамила взаи1832122 Составитель C. Еремин Техред M.Mîðãåíòàë Корректор Л. Пилипенко Редактор Заказ 2604 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 модействием производного бэрбитуровой кислоты с белковым соединением при гцелочном рН в среде органического растворителя, о т л и ч а ю щ и и с R TpM. что в качеств производного барбитурпвой кислоты используют 5-изоамил-5-(5 -карбоксипентил)барбитуровую кислоту. в качестве белкового соединения — бычий сывороточный альбумин и процесс ведут при рН 8-9 и 5 температуре 0 — 10"С.
