Способ определения антигенов или антител

 

Изобретение относится к методам проведения иммуноанализа и может быть использовано в медицине, сельском хозяйстве и других областях для определения антигенов, антител или следовых количеств биологически активных соединений. Цель изобретения повышение чувствительности способа. Это обеспечивается использованием специфических хелатирующих агентов, обладающих высокими относительными флуоресцентными выходами.

Изобретение относится к иммуноанализу, а именно к иммунофлуоресцентным методам анализа с временным разрешением. Цель изобретения повышение чувствительности способа. Способ осуществляют следующим образом. В качестве меток используют комплексы лантанидов с хелатами общей формулы I или II N N (I) N (II) где один из R₁-R₄-CH₂COOH, а остальные три СН₂СООН или CH₂-COO-NHCO-CH₂-CO-CF₃ или общей формулы III N N (III) где один из R₁-R₆-СН₂СООН, а остальные четыре СН₂СООН или CH₂-COO-NHCO-CH₂-CO-CF₃ при этом комплекс обязательно содержит по крайней мере один заместитель CH₂-COO-NHCO-CH₂-CO-CF₃ Флуоресцентные выходы данных хелатных комплексов с европием равны 10⁶-2,4x x10⁷. Способ может быть осуществлен в любых вариантах твердофазного анализа, описанных для радиоизотопных, ферментных и флуоресцентных маркеров, а также в гомогенных методах, основанных на тушении и возгорании флуоресценции при связывании меченого соединения. Способ применим к любым соединениям, для которых возможно получение неспецифических антител и с которыми возможно ковалентное связывание маркера (например, поли- и моноклональные антитела, анти-антитела, различные антигены, гормоны, лекарства, вирусные частицы, бактерии, белки, опухолевые маркеры, пептиды, белок А стафилококка). П р и м е р 1. Синтез 4-аминобензоилтрифторацетона гидрохлорида (АБТФА) (IV). АБТФА (IV) получают из 4-аминобензофенона (1) в три стадии CH₃-NH₂__→ CH₃-H-H __→ __→ CF₃-H-H __→ CF₃--NH₂·HCl Cтадия I. К уксусномуравьиному ангидриду, полученному из 7,1 мл (75 ммоль) уксусного ангидрида и 7,1 мл (183 ммоль) 98%-ной муравьиной кислоты, при 0-2^оС и перемешивании добавляют в течение 10 мин раствор 6,75 г (50 ммоль) 4-аминобензофенона в 10 мл 98%-ной муравьиной кислоты, полученную смесь перемешивают 1 ч при 60^оС. После охлаждения до комнатной температуры добавляют 7,2 мл воды и смесь упаривают досуха на роторном испарителе при 70-80^оС. Остаток растворяют в 100 мл хлороформа и промывают последовательно 5% -ной соляной кислотой, водой, 5%-ным карбонатом натрия, сушат над сульфатом магния и упаривают досуха. Твердый остаток перекристаллизовывают из бензола и сушат над фосфорным ангидридом в вакуум-эксикаторе. Получают 4-формиламиноацетофенол (II) в виде белых игольчатых кристаллов с т.пл. 105-106^оС (из бензола). Выход 6,99 г (85,7% от теоретического). Стадия II. К суспензии 1,13 г (21 ммоль) метилата натрия в 40 мл сухого диметилформамида (ДМФА) при перемешивании при 2-5^оС добавляют 4,92 г этилового эфира трифторуксусной кислоты (40 ммоль), а затем в течение 10 мин раствор 3,26 г (20 ммоль) 4-формиламиноацетофенола в 20 мл сухого ДМФА. Смесь дополнительно перемешивают 4 ч при комнатной температуре, добавляют 2,28 мл (40 ммоль) уксусной кислоты и упаривают в вакууме на роторном испарителе. Остаток растворяют в 400 мл хлороформа, промывают водой, сушат над сульфатом магния и упаривают досуха. Остаток перекристаллизовывают из бензола с обработкой активированным углем. После высушивания над фосфорным ангидридом получают 3,1 г (60% от теоретического) 4-формиламинобензоилтрифторацетона (III) в виде желтых игольчатых кристаллов с т.пл. 151,5-152,5^оС (из бензола). Стадия III. Смесь 0,52 (2 ммоль) 4-формиламинобензоилтрифторацетона. 8 мл сухого этанола и 0,8 мл концентрированной соляной кислоты греют на кипящей водяной бане 1,5 ч. Затем упаривают досуха на роторном испарителе и сушат в вакууме над фосфорным ангидридом. Получают 0,49 г (92,5% от теоретического) АБТФА в виде желтых мелких кристаллов. Синтез конъюгата иммуноглобулин мыши 4-аминобензоилтрифторацетон-диэтилентриаминпентауксусная кислота (lgG-АБТФА-ДТПА). К раствору 10 мг ДТПА в 10 мкл диметилсульфоксида добавляют 4 мкл триэтиламина, а затем при перемешивании по каплям 10 мкл раствора, содержащего 9 мг АБТФА в диметилсульфоксиде и оставляют на 1 ч при комнатной температуре. 10 мкл реакционной смеси добавляют к 200 мкл 0,1 М бикарбонатного буфера (рН 8,5), содержащего 10 мг/мл lgG и оставляют на ночь при 4^оС. Очистку конъюгата проводят методом гельфильтрации с использованием колонки 1,5х20 см с носителем Sephadex G-50, собирая фракции белкового пика. Соотношение lgG/АБТФА, которое определяли по поглощению на длинах волн 280 и 330 нм соответственно, было равно 1/5. Измерение относительного флуоресцентного выхода лантанидного комплекса. Относительный флуорецентный выход определяют по формуле
Φ_отн= где I_che, I_и интенсивность флуоресценции; C_che, C_εи концентрации; K_che, K_εи константы затухания флуоресценции хелатированного и нехелатированного европия соответственно. Для определения относительного флуоресцентного выхода европиевого хелата с LgG-АБТФА-ДТПА смешивают в эквимолярном соотношении 10^-5 М растворы хлорида европия и lgG-АБТФА-ДТПА в 50 мМ трисгидроксилметиламинометан-НСl (рН 6,6) с 0,15 М NaCl и 0,02% тритона Х-100 и 10^-5 М триоктилфосфиноксида. Интенсивность флуоресценции европия измеряют на импульсном люминесцентном спектрометре LS-50 (Perkin Elmer) с временным разрешением на длине волны 615 нм и для свободного, и для хелатированного европия. Длина волны возбуждения для нехелатированного европия 395 нм и для хелата с lgG-АБТФА-ДТПА 330 нм. Относительный флуоресцентный выход для lgG-АБТФА-ДТПА равен 2˙10⁶. Проведение конкурентного твердофазного иммуноанализа lgG мыши по измерению остаточного флуоресцентного сигнала в растворе. 5 нг меченых lgG мыши инкубируют в лунках полистирольных стрипов (Eflab, Finkand), покрытых 10 мкг/lgG кролика против мыши, вместе со стандартными растворами, содержащими 0-4000 нг/мл lgG мыши в 0,2 мл буфера для проведения анализа (LKB, Wallac), 0,2% бычьего сывороточного альбумина (BSA) при 37^оС в течение 2 ч. Остаточный флуоресцентный сигнал измеряют флуоресцентным спектрометром с временным разрешением. Возбуждение проводят азотным лазером (337 нм) с частотой 50 Гц и полушириной 10 нс. Сигнал измеряют на длине волны 613 нм в режиме счета фотонов в течение 10 с. Время задержки 300 мкс, счет импульсов 1 мс. П р и м е р 2. "Сэндвич" флуоресцентный иммуноанализ иммуноглобулина человека по измерению остаточного флуоресцентного сигнала в растворе. lgG кролика против человека метят европиевым комплексом по методике, описанной выше для lgG мыши. Анализ проводят после инкубации стандартных растворов lgG человека (0-4000 нг/мл) в лунках полистирольных стрипов, покрытых lgG кролика против человека (10 мкг/мл), путем добавления 1 нг/мл коньюгата lgG кролика против человека, меченного европием, в буфере для анализа (LKB, Wallac) в течение 2 ч при 37^оС. П р и м е р 3. Способ осуществляют согласно примеру 1, но вместо lgG-АБТФА-ДТПА используют lgG-АБТФА-этилендиаминтетрауксусную кислоту (lgG-АБТФА-ЭДТА). Соотношение АБТФА/lgG составляет 3/1. Относительный флуоресцентный выход 1,06 ˙10⁶. П р и м е р 4. Способ осуществляют согласно примеру 1, но вместо lgG-АБТФА-ДТПА используют lgG-АБТФА 1,2-диаминоциклогексан N,N,N^', N^'-тетрауксусную кислоту. Соотношение АБТФА/lgG равно 5/1. Относительный флуоресцентный выход 1,1˙10⁶. П р и м е р 5. Способ осуществляют согласно примеру 1, но вместо lgG-АБТФА-ДТПА используют lgG-АБТФА-оксисукцинимидный эфир диэтилентриаминпентауксусной кислоты (lgG-АБТФА-ПСЭДТПА), в котором соотношение АБТФА/ПСЭДТПА составляет 1/1. Соотношение АБТФА/lgG равно 5/1. Относительный флуоресцентный выход 2˙10⁶. П р и м е р 6. Способ осуществляют согласно примеру 1, но вместо lgG-АБТФА-ДТПА используют lgG-АБТФА-ПСЭДТПА, где соотношение АБТФА/ПСЭДТПА составляет 2/1. Соотношение АБТФА/lgG равно 6/1. Относительный флуоресцентный выход 3,2˙10⁶. П р и м е р 7. Способ осуществляют согласно примеру 1, но вместо lgG-АБТФА-ДТПА используют lgG-АБТФА-ПСЭДТПА, где соотношение АБТФА/ПСЭДТПА составляет 3/1. Соотношение АБТФА/lgG равно 8/1. Относительный флуоресцентный выход 4,2x x10⁶. П р и м е р 8. Способ осуществляют согласно примеру 1, но вместо lgG-АБТФА-ДТПА используют lgG-АБТФА-ПСЭДТПА, соотношение АБТФА/ПСЭДТПА составляет 4/1. Соотношение АБТФА/lgG равно 8. Относительный флуоресцентный выход 2,4x x10⁷. Таким образом, описанный способ позволяет повысить чувствительность определения антигенов или антител за счет использования соединений с высоким относительным флуоресцентным выходом.

Формула изобретения

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИГЕНОВ ИЛИ АНТИТЕЛ, предусматривающий инкубацию иммуносорбента с анализируемыми пробами, добавление коньюгата антигена или антитела с комплексом лантанида и хелатного соединения, отличающийся тем, что, с целью повышения его чувствительности, в качестве хелатного соединения используют соединение общей формулы I или II


где один из R₁ R₄ CH₂COOH,
а остальные три -CH₂COOH или

или общей формулы III

где один из R₁ R₅ CH₂COOH,
а остальные четыре -CH₂COOH

при этом комплекс содержит по крайней мере один заместитель