Способ лечения вирусных инфекций

 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для активации естественных защитных сил организма. Цель - повышение естественных противовирусных реакций и крепления иммунной системы в локализованных отделах организма. В качестве иммуномодулятора используют препараты двунитчатой РНК с неправильным связыванием, представляющий собой комплекс полиинозината и полицитидилата. содержащий от 1:5 до 1:30 урациловых или гуанидиновых оснований формулы rln r(Ci2-i4 V)n или rln(C29. G)n и вводят его в дозе 0,1-1000 мкг на 1 мл. Способ позволяет повысить резистентность организма к вирусной инфекции.1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) "! и ь и 4 6

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

1 (21) 4356405/14 (22) 11.08.88 (46) 15.08;93. Бюл. N 30 (31) 084227 (32) 12,08..87 (33) US (71) Хем Рисерч, Инк (US) (72) Вилльям А.Картер (US) (56) Заявка EP 028224А2, 1987.

СО

СА)

Ф о (7"

;(гд Сд (54) СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ (57) Изобретение относится к медицине и может быть использовано для активации естественных защитных сил организма. Цель

Изобретение относится к медицине и может быть использовано при лечении инфекционных заболеваний.

К числу новейших продуктов, которые могутсыграть решающую роль в борьбе с инфекционными и раковыми заболеваниями, относятся так называемые иммуномодуляторы такие, как интерфероны, интерлекины и фактор некроза опухоли.

Они представляют собой белкосодержащие лекарственные средства, которые способны активизировать естественные защитные силы организма.

Цель изобретения — повышение естественных противовирусных реакций и укрепление иммунной системы в локализованных отделах организма человека.

Способ осуществляется следующим образом.

РНК с двойной нитью, особенно рибонуклеиновые кислоты с неправильным связыванием, восстанавливают нормальную кинетику рибонуклеазы L и продуктов раз.,, Ж „, 1834б63 АЗ (я)5 А 61 К 37/10, 31/155, 31/505 — повышение естественных и ротивовирусных реакций и крепления иммунной системы в локализованных отделах организма. В качестве иммуномодулятора используют препараты двунитчатой PHK с неправильным связыванием, представляющий собой комплекс полиинозината и полицитидилата. содержащий от 1:5 до 1:30 урациловых или гуанидиновых оснований формулы

rtn Г(С12-14 V)n ИЛИ rln(C29. G)n И ВВОдят ЕГО в дозе 0,1-1000 мкг на 1 мл. Способ позволяет повысить резистентность организма к вирусной инфекции. 1 табл. ложения. Более того, скорость восстановления нормального состояния с помощью двуниточной PHK может быть ускорена посредством предварительного воздействия лимфокинами.

Двуниточные PHK представляют собой синтетические полинуклеотидные комплексы, включающие по две парные нити, Под двуниточной PHK с неправильным связыванием подразумеваются такие кислоты, в которых водородные связи (упаковка оснований) между парными нитями являются сравнительно неповрежденными, т,е. прерывание имеет место в среднем в одной паре оснований на каждые 29 последующих групп. Неправильное связывание есть нарушение нормальной геометрической конфигурации двойной спирали PHK за счет провисания нитей внутрь (или наружу). Эти участки представляют собой точки повышенной чувствительности двуниточной P HK к биологической обработке рибонуклеазами. Следует правильно понимать термин

1834663

"двуниточная РНК с неправильным связыванием", Двуниточная PHK может представлять собой комплекс полиинозината (поли 1) и полицитидилата (поли С), содержащий урациловые (У) или гуанидиновые (G) основания в определенных соотношениях, например, от 1:5 до 1:30 таких оснований (поли С4-29х > V или 6).

Двуниточная P HK может иметь общую формулу гln (С11-14 V)n MRM rln . (С12 V)n

Значение и меняется от 4 до 29. Другие подходящие примеры двуниточной PHK рассматриваются далее, Основу двуниточной PHK с неправильным связыванием, использование которых является предпочтительным в соответствии с предлагаемым изобретением, составляют сополинуклеотиды, выбираемые иэ поли (Cn, G), где n — множитель, принимающий значения от 4 до 29. Эти PHK являются аналогами комплексов из полирибоинозиновой и полирибоцитидиловой кислот, образующимися путем модификации rln Cn a целях внедрения непарных оснований (урациловых или гуанидиновых) вдоль полирибоцитидилатной нити (rCn). Альтернативным способом получения двуниточной РНК является модификация основной рибосильной нити полирибоиноциновой кислоты (г!и), например, эа счет включения 2-О-метилрибосильных групп. Эти аналоги соединения

rln г Сп, имеющие неправильное связывание, являются предпочтительными. Те из них, которые отвечают формулам rl n г(С1114, V), и г!л г(С2в, G)n, описаны Картером и

Т оу в патентах CLLIA N. 4130641 и N

4024222, упоминаемых здесь в форме ссылок на источник, Описанные в этих патентах двуниточные РНК, вообще говоря, пригодны для использования в соответствии с предлагаемым изобретением.

В предпочтительной модификации PHK с неправильным связыванием формулы

Г!п(С!2,V)n ОбЛаСтЬ, ВКЛЮЧаЮщая НЕПрЕрЫВный участок иэ 6-12 пар оснований; т.е. длиной от половины до полного витка спирали

РНК, служит в качестве биотриггера, вызывающего выделение лимфокинов и в качестве внеклеточного софактора ферментов, участвующих ва естественных противовирусных реакциях. Области неправильного связывания, состоящие из урацильных групп, внедрены с определенной периодичностью в полипиримидиновую цепочку для ускорения гидролиза РНК и устранения таким образом токсичности.

Другими примерами возможных модификаций двуниточных PHK с неправильным

55 связыванием, пригодных для использования в соответствии с предлагаемым изобретением. являются: поли (I), поли (С4, V) псли (i), пОли (Су, V) пОли (I), пОли (С13. V) пОли (!), пОли (С22, \/) пОли (!), пОли (С20, G) поли (I). Ilоли (C29, G) поли (I), поли (Cp/23 С > р)

Обычно вводимые дозы двуниточной

PHK составляют 0,1-1000 мкг на 1 мл жидкости в теле пациента. Термин "изолированная жидкость тела" относится к раствору сывороточной жидкости, солей. витаминов и т,п., который циркулирует в организме, омывая ткани, Объем жидкости в теле пациента определяются по имеющимся медицинским таблицам, которые содержат сведения о взаимосвязи веса реципиента с объемом содержащейся a его или ее теле жидкости. Эта величинаа представляет собой суммарный объем содержащейся в теле пациента жидкости, который и является тем объемом, который используют для установления необходимого для сохранения равновесия количества РНК с двойной нитью.

Например, в теле пациента весом 60 или 70 кг содержится примерно 5-6 л жидкости.

При использовании обоих агентов (двуниточная РНК и лимфокин) их можно вводить в виде смеси. раздельно, но одновременно или раздельно в определенной последовательности.

К введению двуниточной PHK и лимфокина "в комбинации" относятся случаи, когда агенты вводятся вместе в виде терапевтической смеси, а также те процедуры, при которых два агента вводят раздельно, но одновременно, например, одному и тому же пациенту по разным внутривенным путям.

Способ введения "в комбинации" также включает раздельное введение лекарств, при котором сначала вводят одно, а спустя короткий промежуток времени — другое лека рстве н н ое средство.

Пример 1. Вводят образцы двуниточной РНК с неправильным связыванием, представлявшей собой двуниточную PHK c неправильным связыванием общей формулы rln г(С12, V)n в количестве 20-1000 г еженедельно группе лиц весом 40-70 кг и проводил анализ их сывороточных жидкостей, в частности, влагалищных секреций и мужского эякулята на присутствие в них индуцированных двуниточных PHK защитных медиаторов реципиента. В ходе групповых клинических испытаний изучались аналогичные параметры на индивидах, которым было проведено вливание их интерферонов

1834663

10

25

35

45

50 или интерлейкинов, с целью выявления специфики процессов. если это имело место, С помощью световой микроскопии было установлено, что жидкость. взятая у пациентов, которым были сделаны вливания. содержали различные клетки, в т.ч, мононуклеарные, клетки сквомозного эпителия (образцы иэ жестких половых органов) и сперматозоиды (мужская семенная жидкость), а также аморфную массу клеточных "остатков". В нижерасположенной таблице приводятся обобщенные результаты наблюдений за тремя пациентами при лечении их с помощью двуниточных PHK с неправильным связыванием в течение различных периодов времени.

В случае пациентов А и В отмечены высокие титры вируса иммунодефицита человека (HLV-Itl) иэ эякулятов. Измерения проводили при обьеме эякулятов 2,0-4,0 сМ с помощью сокультуры. Для этого брали мононуклеарные клетки крови обычного донора, который подвергался стимуляции с помощью фиттогемагглютинина в течени 24 дней, и выращ. вали культуру в течение 28 дней, а затем проводил измерения на присутствие внеклеточного вируса, методом иммуносорбентного анализа с ферментной меткой, Титр сокупьтуры определяли по средней оптической плотности (оптическая плотность при 490 нм) образца для иммуносорбентного анализа после вычитания отрицательного контрольного значения (менее

0,1). У пациента С отмечено хроническое проявление вируса простого герпеса во влагалищных секрециях, связанных с формированием периональной визикулы. Вирус простого герпеса культивировали по способу Раппа с использованием конфпуентных клеток НЕ!, репродуцированных в питательных слоях чашки Петри толщиной 33 мм, Анализ образцов жидкости пациента с помощью жидкостной хромотографии при высоком давлении после системного введения двуниточной РНК показывает, что произошло увеличение количества защитных медиаторов реципиента. Влагалищные исеменные жидкости пациентов анализировали на наличие различных компонентов естественной (2 - 5 — олиго А/рибонукпеаэа

А) противовирусной реакции в соответствии с ранее описанным мною применительно к периферическим мононуклеа рным.клеткам крови.

Для оценки специфичности процесса проводили исследования на подобных ïàциентах (или животных), котрые проходили лечение высокими дозами (< t0 млн. iRV/d/) различных интерферонов и интерпекинов.

Однако в этих случаях не удалось обнаружить увеличения количества участвующих в борьбе с болезнью медиаторов в изолированных жидкостях, При комбинированном системном введении лимфокинов и двуниточной PHK с неправильным связыванием скорость выявления медиаторов в этих изолированных жидкостях значительно возросла. Жидкостная хроматография при высоком давлении в сочетании с методами радиационного связывания и радиоимунного анализа репродуцированной PHK подтвердила такую специфическую особенность, как выработка во всех частях тела нового 2 -5 -олигоаденилата в результате применения двуниточной РНК, причем в количествах, достаточных для защиты организма от болезни.

Идентификацию методом жидкостной хромотографии при высоком давлении проводили после подготовки образца с использованием трихлоруксусной кислоты и ацетонового осаждения. Использовали аналитическую колонку Уотерса "С1а микрон

Бондапак", при этом создавали градиенты метанола и воды в буферном растворе из фосфагата аммония (50 мл) при рН 7.0. Тест, проводившийся с помощью метода жидкостной хромотографии, соответствует стандартной калибровке с аутентичными РзАз и

РзА4, которые были синтезированы ферментативным путем. На графике резко выделяются те пики, которые появились при проведении жидкостной хроматографии в соответствии с данной схемой через 6,87,0 мин или через 12 мин, поскольку именно они указывают на наиболее активные медиаторы, в частности соответствующие аутентичным РзАз и РзА4, являющихся соответственно тримером и тетрамером 2 -5 олигоаденипатных медиаторов.

Обнаруживается, что механизм, обусловивший эти явления в локализованных отделах организма, включает, по крайней мере, частично сигнальный трансдуктивный процесс, в ходе которого двуниточная РНК действует на окружение клеток или стенки расположенного вблизи кровеносного сосуда, вызывая волнообразный процесс включения формирования медиаторов в самой локализованной секции.

Изобретатель установил, что уникальная структура двуниточной РНК с неправильным связыванием является наиболее благоприятнойдпя практического испопьзования в качестве обьекта изобретения. Это обусловылено тем фактом, что неправильное связывание в PHK с двумя нитями приводит к образованию слабых областей в относительно стабильном в остальной части

1834663 комплексе. Результатом этого является то, что маленькие биоактивные фрагменты двуниточной РНК, будучи более мобильными, получают доступ к специализированным отделам организма, обуславливая проявление в них локального высокоспецифичного иммуномодуляторного и противовирусного эффекта. Опыт свидетельствует о том, что получение доступа к другим изолированным отделам не является свойством большинства экзогенно применяемых двуниточных

PHK.

С целью подтверждения предположения о том, что новые молекулярные разновидности двуниточной РНК, образующиеся в процессе биоразложения, способствуют созданию требующегося высокого уровня медиаторов естественной защитной системы (например, системы 2 -5 А) в различных биологических жидкостях (жидкости в теле

20 пациента), проводили эксперименты как в лабораторных условиях, так и на живом организме. . А. Сравнение разложения поли I, поли С и двуниточной РНК с неправильным связы- 25 ванием под действием нуклеазы.

Чувствительность двуниточных PHK к гидролизу нуклеазной изучалась с помощью радиоактивных поли 1, поли С и двуниточных РНК с неправильным связыванием. По- 30 лиинозиновая кислота (8- С) (спектральная

14 активность 3,6 мк кюри (мкмоль) была куплена у фирмы "P-Брокемикалз", Эта маркированная полиинозиновая кислота имела более 1000 оснований по длине молекулы. 35

Полиинозиновую кислоту (8- С) смешивали

14 с немаркированными поли 1, поли С или двуниточной PHK с неправильным связыванием, смесь подвергали тепловой денатурации и реданатурации с получением 40 радиоактивных двуниточных РНК, B первоначальных исследованиях определяли расщепление нуклеазой S> (Е.

С,3.1.30. 1). Нуклеаза S< расщепляет нуклеиновые кислоты с одной нитью, оставляя 45

У сдвоенные области неповрежденными, Расщепление с помощью нуклеазы S> поли I, поли С имело монофазнывй кинетический механизм, при этом скорость генерирования двуниточной PHK трихлоруксусной кис- 50 лоты достигала 1,4% в минуту. После тепловой денатурации скорость гидролиза увеличивалась до 1,8% в минуту.

Аналогичные эксперименты с использованием маркированных двуниточных PHK с 55 неправильным связыванием продемонстрировали, что в этом случае кинетический механизм был бифаэным, Исходная двуниточная РНК с.неправильным связыванием имели быстро разлагающийся компонент (3,2 в минуту), за разложением которого следовала фаза расщепления боле медленно разлагающегося компонента (0,5 в минуту). Денатурированная двуниточная

PHK с неправильным связыванием разлагалась сравнительно быстро (4,5 в минуту), Степень общего разложения исходных поли I. поли С и двуниточной РНК с неправильным связыванием спустя 45 мин, после начала эксперимента была примерно одинаковой. Как сообщалось ранее, скорость гидролиза двуниточной PHK с неправильным связванием изначально была больше, чем поли I. поли С. Однако двухфазный кинетический механизм расщепления двуниточной РНК с неправильным связыванием свидетельствует о явном физическом различии между этими материалом и хорошо фиксированными (полностью спаренными по основаниям) молекулами поли I, поли С. Результаты указывают на наличие существенного отличия во вторичной и третичной структурах, которое приводит к неодинаковой чувствительности этих двуниточных

РНК к нуклеазе и обуславливает получение неожиданных биологических результатов, описанных в предлагаемой патентной заявке. Кроме того, значительное, т.е. шестикратное уменьшение скорости гидролиза компонентов определенной двуниточной

PHK во второй фазе по сравнению с первой и сравнительно слабый гидролиз медленно расщепляющегося компонента указывают на то, что в двуниточных PHK этого типа существует ядро. обладающее относительной стойкостью по отношению к нуклеазе.

Это не имеет места в случае поли 1, поли С, Разложение двуниточной PHK с неправильным связыванием под действием нуклеазы проводили с использованием стандартной тканевой питательной среды. (RPMl 1640), дополненной дезактивированной теплом сывороточной жидкостью эмб.риона теленка или человека в количестве

10 . Эта.сывороточная жидкость является источником рибонуклеаз. Разложение двуниточной PHK с неправильным связыванием в этой среде происходило быстро, примерно 40% этой двуниточной PHK дало растворимую трихлоруксусную кислоту в течение 3 мин, При дальнейшем расщеплении в течение почти двух часов не отмечалось дополнительной деградации в значительной степени. Серийное разбавление среды после трехминутной инкубации в присутствии двухниточной РНК с неправильным связыванием снова продемонстрировало высокую степень разложения — примерно

50% при разбавлении 1:16, которая не возрастала при использовании более концент1834663

10

25

35

50 рировэнной сывороточной жидкости. Поскольку количество осаждаемого трехуксусной кислотой материала остается относительно постоянным в течение длительных периодов времени и.при различных степенях разбавления, то пролонгированная стабильность осаждаемого трехуксусной кислотой материала. вероятно, не связана с его преимущественной деградацией. Эти результаты также подтверждают.наличие в молекуле двуниточной PHK с неправильным связыванием ядра реэистентности по отношению к нуклеазе.

Б. Молекулярный вес резистентного по отношению к нуклеаэе ядра двуниточной

P H К с неп равильным связыванием.

Молекулярный вес определяли путем установления коэффициентов седиментации, Необработанные образцы двуниточной PHK анализировали в ультрацентрифуге

"Бекман модел Е" при скорости 48000 оборотов в минуту и 20 С. Коэффициенты седиментации рассчитывали по пяти точкам, при интервале в 8 мин. Образцы двуниточной

PHK разбавляли гак, чтобы оптическая плотность (002бо) в буферном растворе А/0.15 молей NaCI 0,01 моль фосфата натрия, 0,001 моль Mg С 2 рН 7,2/ достигала 0,63. Образцы двуниточной РНК, обработанные нуклеазой

S>, анализировали при скорости 52000 оборотов в минуту, 20 С в буферном растворе с

0026о = 0,65. Коэффициенты седиментации рассчитывали методом полувысот и второго момента.

Коэффициенты седиментации, двуниточной РНК, определенные методом полувысот и второго момента, составляли соответственно 12,74 и 13,29. После гидролиза в присутствии нуклеаэы S> коэффициенты седиментэции двуниточной РНК, определявшиеся методом полувысот, снизились до 6,18, а полученные методом второго момента уменьшились до 7,21. Эти данные показывают, то при обработке нуклазой S< двуниточная PHK с неправильным связыванием расщепляется на низкомолекулярные фрагменты.

С. Биологическая активность резистентного по отношению к нуклеазе ядра двуниточной РНК.

Биологическая активность расщепленной нуклеазой двунитотчной P H К испытывалась с помощью стандартного анализа на выявление замедления роста культуры опухолевой ткани. Двуниточную PHКинкубировали с нуклеазой S> в течение 120 мин, а затем использовали для ингибирования роста культуры клеток человеческой фибросаркомы НТ 1080 С14. Через 72 ч обработки двуниточной PHК с неправильным связыванием, расщепленной нуклеаэой, в количестве 50 мкг/мл отмечался определенный рост необработанных контрольных клеток. Замедление роста клеток необработанной двуниточной PHK составляло примерно

50%, Аналогичное замедление наблюдалось и в случае использования двуниточной

PHK с неправильным связыванием, обработанной нуклеазой S>. причем вне Зависимости от степени обработки нуклеаэой 81.

Тепловая денатурация в сочетании с обработкой нуклеазой S> приводила к исчезновению антипролиферативного влияния двуниточной PH К с неправильным связыванием.

Эти результаты указывают на то, что антипролиферативная активность двуниточной PHK с неправильным, связыванием сохраняется даже при длительной обработке нуклеазой. В связи с тем, что резистентное по отношению к нуклеазе ядро формируется в этой системе в первые 15-20 мин расщепления, то в последующие моменты времени торможение роста указывает на сохранение антипрофилеративной активности а резистентном по отношению к нуклеазе ядре двуниточной РНК. Это, в свою очередь, может являться причиной удивительно интенсивной выработки биологически активных медиаторов в различных отделах организма.

С целью дальнейшего изучения биологической активности резистентного по отношению к нуклеэзе ядра, проводили расщепление двуниточной PHK с помощью нуклеазы $ в течение 60 мин. Аликвоту этого материала затем подвергали осаждению метанолом с целью удаления низкомолекулярных продуктов расщепления, которые не могут быть осаждены с помощью такой процедуры. Для определения биологической активности культуру клеток глиомы человека линии А 1235 обрабатывали нерасщеппенной двуниточной PHK в количестве 200 ммкг/мл, расщепленннойнуклеазой и осажденной этаноломдвуниточной PHK и расщепленным нуклеаэой $1 Амплигеном. Через 72 часа в культуре клеток линии А 1235 торможение в случае Амплигена составило 99,8%, при использовании обработанного нуклеаэой S1

Амплигена — 78,4%, а для Амплигена,обработанного нуклеазой и осажденного этанолом84,4;6. Таким образом,. антипролиферативная активность двуниточной PHK сохранялась при различных видах обработки.

Оценивали также способность этих ïðåпаратов индуцироаать 2-5А синтетазу (АТФ:(2, 5 - олиго (А) аденилил-трансферазаЦЕ С 2.7.7.19) а этих клетках линии А 1235.

Осадок клеток после центрифугирования

1834б63

12 и ромы вали фосф атно-солев ым раствором,ресуспенди ровали в 5 мл растворяющего буферного раствора (20 миллимолей

Трис, рН 7,5; 0,1 миллимолей этилендиаминтетрауксусной кислоты, 0,25 моля сахарозы, 50 миллимолей KCI 2 миллимоля

Mg Clz и 1 милливоль DTT) и выдерживали на льду в течение 5 мин. После двукратного промывания фосфатносолевым буферным раствором осадки клеток ресуспендировали в 0,1 мл буферного раствора В (20 миллимолей НЕРЕ$; рН 7,5; 5 миллимолей MgC4, 120 миллимолей DTI и 10 глицерина), содержащего ОЯ Monidet - Р40, и выдерживали на льду для растворения клеток.

Цитоплазменные экстракты получали центрифугированием в течение 6 мин (8000 r) и хранили в виде 50-миллилитровых аликвот при -70OC. 2-5А синтетазу анализировали в соответствии с описанным методом (Сухадольник и pp„Biochemistry 22: 4153, 1983), Оттаявший экстракт (эквивалент 25 мг белка) смешивали с 30 мл упакованной поли (г1), поли (rC) - эгэрозой и инкубировали при

25 С в течение 20 мин, Несвязанный белок удаляли двукратным промыванием в 0,4 мл буферного раствора В. Ферментативный синтез 2-5-олигоаденилатов (2-5А) иниции- ровали добавлением 10 мл буферного оаствора В, содержащего 2,5 миллимоля (р) аденазин - 5 - трифосфата (0,12 Кюри) миллимоль), 2,5 миллимоля DTT, 3 единицы (мл креатиновой фосфокиназы и 10 молей креатинового фосфата). После 20-часовой инкубации при 30 С агарозу .отделяли центрифугированием (3 мин., 8000 г, 25ОС), Смесь олигомеров 2-5А во всплывшем отстое анализировали в колонке для диэтиламиноэтилцеллюлозной хроматографии в соответствии с описанием Доетша и др. (Nature:291:355, 1981). Образование продукта устанавливали по величине изменения радиоактивности при замещении материала в колонке для диэтиламиноэтилцеллюлозной хроматографии буферным раствором, содержащим 0,35 моля KCI, деленной на общую величину полученной радиоактивности.

Синтез 2-5А олигомеров путем инкубирования с освобождением из клеток экстрактом двуниточной РНК,. обработанным нуклеазой, после осаждения, показал, что переход аденазин - 5 -трифосфата в 2-5А олигомер зависит от времени. Получено несколько удивительных результатов. Во-первых, через 18чэсовинкубацииосвобожденных от клеток экстрактов с необработанной двуниточной PHK с неправильным связыванием удельная активность 2-5А синтетазы

15 гомеров 2-5А значительно увеличивается

25

35

45 ботанной нуклеазой после 18-часовой инку5

55 составила 41.5. Во-вторых, после обработки нуклеазой St было отмечено заметное увеличение конверсии аденозин-5 -трифосфата в 2-5А синтетазу. Например, после 18 часов инкубации удельная активность достигала

284, что почти в 7 раз больше, чем в случаве необработанной двуниточной PHK с неправильным связыванием. В-третьих, при использовании двуниточной РНК, обработанной нуклеазой S> после осаждения, максимальный выход синтетазы 2-5А наблюдался после 12-часовой инкубации. Эти данные показывают, что ферментативный синтез тримеров, тетраме ров и более сложных олипосле обработки двуниточной PHK с неправильным соединением нуклеазой S>. Позитивная связь увеличения ферментной активности с уменьшением размеров двуниточной PHK является свидетельством того, что здесь может иметь место взаимодействие с аллостериновым модификатором, т.е. частично расщепленной двуниточной PHK c неправильным соединением, которое может приводить к его связыванию и улучшению активации синтетазы 2 — 5А по сравнению со случаем необработанной двуниточной PHK с неправильным связыванием. Терапевтическое значение таких наблюдений является очевидным. В тех случаях, когда низкомолекулярные продукты разложения обработанной нуклеаэой St, двунитотчной PHK c неправильным связыванием удаляли путем осаждения, максимально высокий синтез 2-5А синтетазы наблюдали после 12 часов инкубэции, Максимально активное формирование синтетазы 2-5А при использовании двуниточнай РНК, обработанной нуклеазой Si после осаждения указывает на то, что резистентное по отношению к нуклеазе ядро может активизировать 2-5А синтетазу точно так же, как это происходит при активации с помощью двуниточной

PHK с неправильным связыванием, обраб ации.

Эти данные подтверждают наличие в двуниточной РНКс неправильным связыванием биологически активных фрагментов и служат объяснением физической основы терапевтической активности этих фрагментов в биологической жидкости. Эти данные также свидетельствуют о том, что биологическая активность этих фрагментов больше, чем у исходного соединения, Пример 2, Другим примером практического применения изобретения является предотвращение заболеваний, распространяемых половым путем, например, таких, 1834663 как цитомегэловирусные инфекции. Цитомегаловирус (ЦМВ). входящем в семейство вирусов герпеса, только в CLLIA заражено более 1 млн. человек. У людей с ослабленной иммунной системой он может вызывать желудочно-кишечные расстройства или слепоту(обе серозные поверхности легко инфицируются вирусами, а вместе с тем не отличаются доступностью для многих системно применяемых противовирусных агентов). ЦМВ передается половым путем. Более высокая степень торможения (ингибировани) может быть достигнута путем генерирования с течением времени биоактивных фрагментов (например. при введении двуниточной РНК с неправильным связыванием (Амплиген). Например, показано, что ингибирование ЦМВ после 24-часового воздействия фрагментов Амплигена достигает

100 . Такое регулируемое выделение биоактивного материала, как происходит при использовании двуниточной РНК относительно нетоксичного типа, не может быть легко достигнуто в случае применения мазей местного действия и подобных средств, Генерирование биоактивных фрагментов двуниточной РНК подтверждают исследования культуры тканей с ЦВМ. Часто поражения ЦМВ называют цетамегаловирусными инкулузиями, последние представляют собой обнаруживаемые в увеличенных клетках, пораженных вирусом, включения. Цетамегэловирусы человека составляют подгруппу вирусных агентов, тесно связанных или входящих в группу вирусов герпеса. Несмотря на повсеместное распространение, число лиц, пораженных ЦМВ, переданным половым путем в

США, по оценкам, достигло в 1988 r. 1 илн. человек. Инфицирование обычно является бессимптомным, однако, у лиц с ослабленной иммунной системой могут возникать

40 желудочно-кишечные расстройства или слепота. Особенно чувствительны к ЦМВ новорожденные, этот вирус также может быть 45 причиной выкидышей. мертворождения и послеродовой смерти, B данном эксперименте использовалиследующие процедуры и материалы.

Извлекали фибропласты крайней плоти человека у новорожденных и выдерживали при низкой пассировке (<20) в физиологическом растворе с солями Эрла,.куда добавляли 10% сывороточной жидкости эмбриона быка, 2 миллимоля 1=глютэмина, 1 миллимоль пирувата натрия, 20 миллимолей буфера НЕРЕЯ и антибиотики. После слияния клеток их выдерживали в вышеописанном растворе, из которого было удалено

5$ сывороточной жидкости эмбриона быка.

Ежедневно проводили анализы клеток ма бактериальное или микоплазменное загрязнение.

В исследованиях использовали штамм чело вече ского цетаме гало ви руса (ЦМ В

АТ :С/VR - 538, ветвь А0 169), Он состоял из второго посева в фибропласт крайней плоти человека, который собирали, когда действием ЦМВ было охвачено 75 реципиентных клеток. Освобожденный из клеток штамм вируса помещали в трубки для хранения и держали при -120 С. Тесты на бактериальную и микоплазменную стерильность дали отрицательные результаты, Титр инфекционной активности препаратов шиамма ЦМВ определяли на клетках фибропл ста крайней плоти человека,он составлял 4х10 флюорисцентообразующих инклузий на миллилитр (см.далее).

Испольэовали лиофлизид — клинический сорт Амплигенэ (двуниточная РНК с неправильным связыванием, поли 1, поли

С1г, V фирма "Нем рисерч", Роквилл, шт.

Мэриленд, США). В соответствии с инструкциями производителя Амплиген был реструктурирован, аликвотирован и хранилося при -120 С..Для каждого эксперимента проводили размораживание свежей аликвоты путем вращения в водяной бане при 50 С и разводили в вышеописанной тканевой питательной среде до нужных концентраций.

Лекарственное средство инкубировэли с клетками фибропластов крайней плоти человека при различных условиях. К числу изменяемых параметров относились: (1) концентрация Амплигена; (2) последовательность воздействия Амплигеном на вирусные инклузии; (3) продолжительность воздействия Амплигена на эти клетки фибра пласта. Жизнеспособнос i ь обработанных Амплигеном клеток фибропласта краййей плоти человека была такой же, как и в случае необработанных клеток, что определяли по инклузии голубого трипэна (т.е, >

99%), Конфлуентные клетки фибропластовв крайней плоти человека культивировали на круглых покровных стеклах в ампулах с кожухом емкостью 3,7 мл (1 драхма). Вирусную инфекцию инициировали инкубированием этих ампул с 0,25 мл культуры ЦМВ соответствующего разбавления. Клетки крайней плоти человека подвергали воздействию

ЦВМ в течение одного часа (700 кг, 37 С) для обеспечения поглощения вируса. Ампулы промывали 2-3 раза для устранения внеклеточного вируса. Затем в ампулы снова помещали 1 мл тканевой питательной среды и обычно инкубировали их 18-24 часа, при 37,С - 72 часа.

1834663

5

20

40

55

Репликацию ЦМВ измеряли следующим образом, Вирусную репликацию останавливали, фиксируя фибропласты крайней плоти человека в 100 -ном ацетоне. Покровные стекла, на которых находились прилипшие клетки этих фибропластов, промывали и инкубировали с моноклональным антителом мыши (" Дюпон" ) антицетамегаловирусного типа, специфичным для непосредственного предшествующего белка массой 72 килодальтона. Связанное антитело детектировали путем добавления антиагента lgGF /аЬ/2р IGMA/ марки FITC.

Инфицированные вирусом клетки давали яблочно-зеленое ядерное флюоресцентное свечение при рассмотрении в эпифлюоресцентном микроскопе с 250-кратным увеличением. В микроскопе осуществлялся подсчет числа инфицированных клеток (т,е. тех, что содержали дающие ядерное флюорисцентное свечение инклузии). Препарат позитивного штамма разбавляли так, чтобы

s отсуствие Амплигена он позволял получать 200-1200 зараженных ЦМВ клеток в расчете на одно предметное стекло через 24 часа инкубирования. Это достигалось при мул ьтиплетности инфекции 0,04.

Определяли среднее число инклузий

ЦМВ для репликатных покровных стекол в условиях всех экспериментов и сравнивали результаты с данными для позитивных контрольных клеток, не получавших Амплиген.

Параллельно оценивали негативные контрольные образцы, которые не подвергали воздействию Амплигена или ЦМВ. Противовирусная активность Амплигена рассчитывалась в соответствии со следующей формулой; ингибирования инклуэий LIMB - среднее число инклузий ЦМВ/покровное стекло для обработанных Амплигеном клеток. НГГ

100 - среднее число инклуэий

ЦМВ/покровное стекло для необработанных контрольных клеток НГГ

Данные о влиянии продолжительности предварительной обработки Амплигеном на инфицирование фибропластов крайней плоти человека с цетамегаловирусом. Репликатные монослои фибропластов крайней плоти человека подвергали: предварительной обработке 10 мкгlмл Амплигена или предварительной обработке 100 мг/мл Амплигена в течение указанных промежутков времени до поглощения ЦМВ. Степень инфицирования ЦМВ определяли через 24 часа после поглощения вируса описанным методом IFA. Среднее число инклуэий ЦМВ на одно покровное стекло для обработанных

Амплигеном культур сравнивали с контрольыми результатами для необработанных лекарством культур. Полученные результаты свидетельствуют о том, что степень ингибирования цетамегаловирусной инфекции прямо пропорциональна продолжительности предварительной обработки Амплигеном; Максимальное ингибирование наблюдалось при предварительной обработке клеток HFF Амплигеном в течение 24 часов.

Данное исследование демонстрирует способность двуниточной PHК с неправильным связыванием оказывать противовирусное действие по отношению к ЦМВ, которое возрастает с течением времени, и чувствительность ЦМВ к двуниточной РХК с неправильным связыванием вне зависимости от использованной концентрации остается с течением времени на уровне, который не достижим при MecTHQM применении двуниточных PHK относительно нетоксичной группы.

Процедуры также эффективны для снижения до предела потогенности фильтруемых агентов, выделяемых биологических жидкостях, например, фильтруемых агентов, найденных в биологических жидкостях, таких как спинномозговая (цереброспинальная) жидкость, особенно агентах, имеющих место при болезни Альцхеймера и других медленно прогрессирующих болезнях, или "медленных" вирусов, вызывающих медленно прогрессирующее умственное ухудшение.

Формула изобретения

Способ лечения вирусных инфекций, путем введения в организм больного иммуномодулирующего препарата, о т л и ч а ю щ ий с я тем, что, с целью повышения естественных противовирусных реакций и укрепления иммунной системы в локализованных отделах организма, в качестве иммуномодулятора используют препараты двуниточной

PHK с неправильным связыванием, представляющих собой комплекс полиинозината и полицитидилата, содержащего от 1:5 до 1:30 урациловых или гуанидиновых оснований формулы г4 v(C12-C14, V)n или г4(Сщ,6)п и вводят его в дозе 0,1-1000 мкг на 1 мл.

1834663

17

Влияние системной обработки с помощью двуниточной PHK на уровень извлекаемого виру- . са в изолированной биологической жидкости (жидкостяк) Пациент

Экзогенная двуниточнал PHK (полученное количество Г

Время

Нагрузка вируса сокультурой

06;08;0,%

0,3; 0.25; 0,25

0,2; 0,15; 0,15

1,6

2.8, 10,0

3, Пациент С (женщина с инфекцией типа простого герпеса-2) 0

2.6

10,8

8 недель

36 не ель

Составитель О.Крюкова

Техред M.Mîðãåèòàë Корректор Т.Вашкович

Редактор

Заказ 2693 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035. Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

1. Пациент А (мужчина с инфекцией

HTLV — И 1)

В

2. Пациент В (мужчина с инфекцией

НТ(Ч вЂ” III) Предварительная обработка

4 недели

30 недель

Предварительная обработка

8 недель

40 недель

Предварительная обработка

1;5; 1,2; 1,2

0,6; 0,5; 0,7

0,15; 0,10: 0,18

Титр вируса (готового к употреблению)

1х104,2 к 104,2х10

2 х 10, 5 х 10, 1 х10

1 х 10 . 1 х l0, 1 х10

Способ лечения вирусных инфекций Способ лечения вирусных инфекций Способ лечения вирусных инфекций Способ лечения вирусных инфекций Способ лечения вирусных инфекций Способ лечения вирусных инфекций Способ лечения вирусных инфекций Способ лечения вирусных инфекций Способ лечения вирусных инфекций 

 

Похожие патенты:

Изобретение относится к медицине, а именно кфармакопрофилактике нарушений вследствие воздействий физических факторов

Изобретение относится к производству медицинских препаратов, может быть использовано для получения различных модификаций препарата инсулина

Изобретение относится к медицине, а именно к химико-фармацевтической промышленности

Изобретение относится к медицине, в частности к наркологии, и может быть использовано для медикаментозного лечения алкоголизма

Изобретение относится к медицине, может быть использовано в клинической неврологии и позволяет ускорить регресс неврологических расстройств, сократить сроки лечения и снизить осложнения, вызванные приемом больших доз кортикостероидных препаратов и длительным их применением у больных рассеянным склерозом с выраженными аутоиммунными реакциями

Изобретение относится к экспериментальной медицине

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии

Изобретение относится к медицине, а именно к фармакотерапии нарушений вследствие активаций процессов перекисного окисления липйдов

Изобретение относится к вирусологии

Изобретение относится к медицине, в частности к ревматологии

Изобретение относится к медицине, а именно к фармакотерапии нарушений вследствие холодовых воздействий

Изобретение относится к области медицины , а именно к физиотерапии, и касается лечения больных неспецифическим язвенным колитом

Изобретение относится к медицине, в частности к терапии Цель уменьшение клинических проявлений заболеваний за счет коррекции метаболизма соединительной ткани

Изобретение относится к медицине, в частности к педиатрии

Изобретение относится к медицине, в частности к профилактической медицине и лечению профзаболеваний
Наверх