Иммобилизованная аденилатциклаза чумного микроба

 

Использование: биохимия и биотехнология относится к получению матриц с ковалентно связанными белками. Сущность изобретения: получают иммобилизованную аденилатциклазу чумного микроба путем ковалентного связывания аденилатциклазы с окисленной с помощью периодата сефарозой CL 6B. Активность иммобилизованного фермента по отношению к нативному 95%. Активность сохраняется в течение 6 мес.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ .

РЕСПУБЛИК (19) (11) (я)5 С 12 N 11/12, 9/88

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР)

ollvIcAHvIE изоБркткния

К ПАТЕНТУ (21) 5016438/13 (22) 03.07.91 (46) 30,08.93. Бюл, N. 32 (71) Ростовский-на-Дону государственный научно-исследовательский противочумный институт (72) Л.А.Шевченко, О.)О.Рябухина и Б.Н.Мишанькин (73) Ростовский-на-Дону государственный научно-исследовательский противочумный институт (56) Дин П.. Джонсон У. Мида Ф Аффинная хроматография. М.: Мир, 1988, с. 280, Изобретение относится к биохимии и биотехнологии, в частности к способам получения матриц с ковалентно связанными белками.

Цель изобретения — иммобилизация аденилатциклазы чумного микроба.

Цель достигается тем, что на окисленной с помощью периодата сефарозе CL 6В ковалентно связывают аденилатциклазу чумного микроба. В отличие от прототипа раствор для присоединения фермента не содержит фосфатных ионов, инактивирующих аденилатциклазу.

Пример 1. 15 г сефарозы С1 6В, промытой 10-кратным объемом воды, помещают в пластиковый флакон объемом 15 — 20 мл. Добавляют 3 мл 0,07 М раствора периодата натрия и медленно перемешивают реакционную смесь в течение 45 — 60 мин при комнатной температуре, Добавляют 0,5 мл

2 М зтиленгликоля и продолжают перемешивание еще 30 минут. Гель отфильтровывают на пористом стеклянном фильтре, (54) ИММОБИЛИЗОВАННАЯ АДЕНИЛАТЦИКЛАЗА ЧУМНОГО МИКРОБА (57) Использование: биохимия и биотехнология относится к получению матриц с ковалентно связанными белками. Сущность изобретения: получают иммобилизованную аденилатциклазу чумного микроба путем ковалентного связывания аденилатциклазы с окисленной с помощью периодата сефарозой С 6В, Активность иммобилиэованного фермента по отношению к нативному 957,.

Активность сохраняется в течение 6 мес. промывают водой, а затем 0,01 М натрийкарбонатным буфером (рН 9,5).

В 5 мл отдиализованного против 0,01 M карбонатного буфера (рН 8,5) раствора аденилатциклазы чумного микроба (0,5 мг/мл аденилатциклазы с активностью 2 нмоль/мг) вносят активированную матрицу и рН суспензии доводят до 9,5 с помощью

2 М гидроокиси натрия. Реакцию продолжают в течение 24 часов, медленно вращая реакционный сосуд при 8 — 10 С.

Для восстановления азометинов и оставшихся альдегидных групп добавляют 3 мл свежеприготовленного раствора борогидрида натрия в концентрации 1 мг/мл в том же буфере. Реакцию продолжают при медленном перемешивании втечение 1 часа в холодном помещении. Гель прол1ывают

0,01 М карбонатным буфером рН 8,5, затем

0,01 Мтрис-HCl рН 7.6. Активность связанной с матрицей аденилатциклазы определяют по методу (Tovey К.S„Whelan J,А,M. А

simple direct assау for сусИс AMP in plasma

and other biological sampe using an improved

1838409

Н Н

35 где Р— остаток модифицированного периодатным окислением сефарозы CL 6В, Составитель !О, Ломов

Редактор В. Трубченко Техред M. Моргентал Корректор Л, Филь

Заказ 2905 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретения1л и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Проивводственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101

compietlve рготеИп binding technique. Clin, Chlm. Acta, 1974, ч,56, Р.221 — 224), Она составляет 2,5 ед/г. За единицу активности аденилатциклазы принимают количество наномелей цАМФ синтезированного одним мг фермента за 1 минуту при 37 С. Количество аденилатциклаэы, иммобилизованной на 1 r носителя равно 1,3 мг, что составляет

80% от добавленной для связывания. Иммобилиэованный фермент сохраняет 95% активности по отношению к нативному состоянию, Иммобилизованная аденилатциклаза полностью сохраняла свою активность в течение 6 месяцев (срок наблюдения).

Пример 2. Все операции проводят как в примере 1, но концентрация аденилатциклазы составляет 0,6 мгlмл, инкубация 12 часов, температура 22 С. Дальнейшие операции как в примере 1, Количество аденилатциклазы и1лмобилизованной на 1 г носителя составляет 1,7 мг, что соответствует 85% от добавленной для связывания, Активность связанной с матрицей аденилатциклазы соответствует 3,2 ед/г.

Пример 3. Все операции проводят как в примере 1, но аденилатциклаэу отдиа, лиэовывают против 0,01 M карбонатного буфера рН 9,5. Концентрация фермента составляет 0,5 мгlмл, время инкубации 10 часов, температура 28 С. Количество аденилатциклазы и1лмобилизоваиной на 1 г носителя составляат 1,4 мг, что составляет 82% от добавленной для связывания. Активность связанной с 1латрицей аденилатциклазы составляет 2,7 ед/г.

Как видно из приведенных примеров, получен ная иммобилизован ная аденилатциклаэа чумного микроба является высокоактивн ы м и стабильным и родукто1л, имеющим большую биотехнологическую и биохимическую значимость, Поскольку аденилатциклаза является ферментом синтеза циклического аденозинмонофосфата — биологически активного вещества, используемого в биологии и медицине, то иммобилиэованная форма фермента может быть использована в биотехнологическом процессе по получению цАМФ, благодаря легкой извлекаемости нуклеотида из реакционной смеси и возможности многократного использования матрицы, Кроме того, связанная аденилатциклаза характеризуется стабильностью своей структуры, что обусловливает возможность ее

"0 транспортировки на большие расстояния без привлечения низкой температуры и других условий, обычно используемых для ферментов.

Ковалентное связывание аденилатциклазы может сыграть свою роль в изучении механизма ее действия, т.к, дает возможность быстро изменять и контролировать окружение фермента. Если учесть, что большинство белков клетки, к числу которых относится аденилатциклаза, активиру1отся присоединением или отщеплением неорганического фосфата, то, имея "пришитый" к матрице белок, последовательно вводя или удаляя изучаемые вещества из реакционной систе1лы, можно точно. установить, какой именно ион катализирует его активность и какие энзимы клетки принима1от в этом уча-, стие.

Формула изобратенил

30 И1лмобилиэова11ная аденилатциклаза чумного микроба общей формулы

Н N-Š— остаток молекулы аденилатциклаэы после восстановления борогидридом натрия, 45 обладающая способностью синтезировать циклический аденозин1лонофосфат..