Способ получения рекомбинантной плазмидной днк и способ получения зимогенной формы белка с человека

 

Использование: получение новых форм бе/.ка С человека. Сущность изобретения: разработан способ получения зимогенноп формы белка С путем конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность со свойствами зимогенной формы белка С. Указанные формы белка отличаются от нативного белка С более высокими амидолитической и функциональной активностями, и имеют новые углеводородные структуры, В изобретении раскрываются также ДНК-соединения , векторы и трансформанты. 2 с.п.флы, 7 ил., 6 табл,

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) и Я

7Е!(Л 1

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

Уильям (21) 4894565/13 (22) 22.02.91 (46) 30.08,93. Бюл. и 32 (31) 07/484.081 (32) 23.02,90 (33) US (71) Эли Лилли Энд Компани (US)

Ф (72) Брус Эдвард Герлитз и Бриан

Гриннелл (US) (56) ЕПВ 0215548, кл. С 12 N 15/00, 1987.

ЕПВ, 0255771, кл. С 12 N 15/00, 1988.

ЕПВ, 0266190, кл. С 12 N 15/О(), 1988.

ЕПВ, 0245949, кл. С 12 N 15/00, 1987.

Изобретение относится к новым ДНКсоединениям и векторам клонирования рекомбинантных ДНК, кодирующих новые зимогенные формы белка С человека. Эти зимогены сконструированы таким образом, что типы гликосилирования являются совершенно иными по сравнению с зимогеном человеческого белка С дикого типа. Гликосилирование, в частности, если углеводородные части содержат высокие уровни сиаловой кислоты, может играть важную роль в секреции белка и его функции, Новые эимогены изобретения конструируют таким образом, что каждую из областей гликосилирования изменяют отдельно. Векторы экспрессии позволяют получить простой и эффективный способ экспрессии укаэанных зимогенных форм белка С человека B рекомбинантных хозяйских клетках. Изобретение позволяет получить способ продуцирования. Ж 1838411 АЗ (st)s С 12 N 15/09, 15/15, С 12 Р 21/02 (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК И СПОСОБ

ПОЛУЧЕНИЯ ЗИМОГЕННОЙ ФОРМЫ

БЕЛКА С ЧЕЛОВЕКА (57) 11спольэование: получение новых форм бе .ка С человека. Сущность изобретения: разработан способ получения зимогенной формы белка С путем конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК, кодирующей аминокислотную последовательнос1ь со свойствами зимогенной формы белка С, Указанные формы белка отличаются от нативного белка С более высокими амидолитической и функциональной активностями, и имеют новые углеводородные структуры, В изобретении раскрываются также ДН1-соединения, векторы и трансформанты. 2 с,п.флы, 7 ил„6 табл, зимогенных форм белка С, которые при активации обладают более высокой амидолитической и антикоагулиру ощей активностью, чем нативная форма белка С.

Новые формы зимогенов человеческого белка С отличаются от известных зимогенных форм аминокислотными последовательностями различных областей гликосилирования, Эти новые зимогенные формы белка С обладают определенными преимуществами при лечении заболеваний крови, в частности, нарушений коагуляции, Белок С, витамин К-зависимый белок плазмы имеет большое физиологическое значение для регулирования гемостаза, Белок С синтезируется в виде неактивных молекул, называемых далее ранним белком С.

Как будет подробно описано ниже, этот ранний белок подвергается сложному процессингу, что приводит к образованию

1838411 различных неактивных молекул. Неактивные секретируемые формы белка С именуются в настоящем описании эимогенным белком С.

Активация белка С происходит в крови путем реакции с комплексом тромбодулинт- 5 ромбин. Активиррванный белок С вместе с его кофактором белком S является антикоагулянтом, обладающим высокой физиологической активностью. Активированный белок

С способствует предупре;кдению возникно- 10 вения интерваскулярного тромбоза и распространению образовавшихся тромбов.

Механизм действия активированной формы белка C и механизм активации неактивного зимогена в активную протеазу подробно описан в нескольких работах последних лет.

В активации белка С участвует тромбин, конечная форма сериновой протеазы в каскаде коагуляции, и гликопротеин, ассоциированный с мембраной эндотеl!uaëьной клетки, и называемый тромбомодулином.

Тромбомодулин образует тесный стехио летрический комплекс с тромбином. СвязыBaRch с тромбином, тромбомодулин резко изменяет функциональные свойства тром- 25 бина. Тромбин свертывает фибриноген, активирует тро лбоциты и превращает кофакторы свертывания крови V и И!! в их активные формулы, Va и Villa, И наконец, тромбин активирует белок С, однако, этот З0 процесс протекает очень медленно и неэф фективно, и кроме того, активация ингибируется физиологическим Са . Напро1ив, 2+ тромбин в комплексе с тромбомодулином не свертывает фибриноген, не активирует З5 тромбоциты и не превращает кофакторы свертывания Чи Vill в их активныедвойники

Ча и Villa, а становится эффек1ивным активатором зимогенного белка С в присутствии физиологического Са . Константа скорости 40 активации зимогена балка С с помощью комплекса тромбомодулин-тромбин в 1000 раэ превышает константу скорости процесса с участием лишь одного громбина, Для более ясного представления регу- 45 лирующей функции активированного белка

С в свертывании крови ниже приводится описание ферментативной системы коагуляции. Указанную систему коа уляции можно рассматривать как цепную реакцию с 50 последующей активацией зимогена в активные сериновые протеазы. В итоге указанная цепная реакция продуцирует фермент тромбин, который посредством ограниченного протеолиза превращает фибриноген плаз- 55 мы в нерастворимый гелеобразный фибрин, Ключевыми стадиями в каскаде коагуляции являются превращение фактора свертывания крови Х и Ха с помощью фактора свертывания !Ха и превращение протромбина в тромбин с помощью фактора свертывания

Ха. Обе указанные реакции происходят на поверхностях клеток, преимущественно на поверхности тромбоцитов, и для их осуществления необходимо присутствие кофакторов, Основные кофакторы, факторы V u Vill циркулируют в системе виде относительно неактивных предшественников, однако образование napf34lx нескольких молекул тромбина приводит к укреплению тромбиновых петель и активации кофакторов посредством ограниченного протеолиза.

Активированные кофакторы Va u Villa ускоряютобе конверсии протромбина в тромбин и факторы Х в фактор Ха приблизительно на пять порядков величины. Активированный белок С предпочтительно действует на кофакторы свертывания Ча и Villa, т,е. активированные формы неактивных факторов V u

Vill путем протеолитической деградации, гидрослива и необратимого расщепления.

Напротив факторы свертывания V u Vill являются плохими субстратами длл аггиаированного белка С.

Ценным кофактором для активированного белка С является белок S, другой витамин К вЂ” зависимый белок плазмы, Белок S в основном в 25 раз ускоряет гидролиз факторов Va и Villa, опосрадоианный активированным белком С, Белок С известен специалистам как ценное терапевтическое средство. Av. иаированный белок С является новым антитромбином с более широки л терапевтическим индаксом по сравнению со стандартйыми антикоагулянтами такими, как гспарин, или антикоагулянтами тиг|а гидроксикумарина для перорального введения. Ни зимогенный белок С, ии активирэванный белок С не являются эффективными до тех пор, пока не будет образовываться тромбин, поскольку его присутствие является необходимым для превращения сверты-. вания V в Va u Vill в Villa, активированные формы этих двух кофакторов являются предпочтительным субстратом для активированного белка С. Для активации зимогенного белка С также требуется тромбин, при этом в отсутствии комплекса тромбомодулинтромбин превращение зимогена белка С в его активную формулу протекает очень неэффективно, Рктивированный белок С является предпочтительным актикоагулянтом, поскольку он действует посредством инактивации KQфакторов Va u Villa. Так как для превращения факторов Ч и И!.! в их активные Формы

Ча и И!!а требуется тро лбин, то белок С действует в качестве антикоагулянта л"шь

1838411

i0 30 40

10 5 -ATG TGG ÑÀG СТС.ACA AGC СТС СТО CTG ТТС GTG GCC ACC TGG GGA ЛТТ. Н2Ч-ИЕТ TRP GLN LEU TEIR .SER LEU LEU LEU РНЕ ЧЛ1. ALA TEER TRP GLY ILE

5 i0 г

50 60 70 80 90

ТСС .GGC ACA CCA GCT CCT CTT GAC TCA ОТО ТТС ТCC AGC AGC ОЛО СОТ

SER GLY THR PRO ALA PRO LEU ASP SER UAL РНЕ SER SER SER GLU ЛЯО

20 25 30

° 15

100 110 120 130 140

GCC САС СЛО GTG CTG СОО ATC CGC ЛЛА CGT GCC ААС ТСС ТТС CTG GAG

ALA HIS GLN VAL LZU APG ILE ARG:LYS ARG ALA ASN SZR PHE LEU ОП1

35 40 45

150 160 170 180 190

GAG СТС CGT САС ЛОС AGC СТО GAG CGG GAG TGC ATA GAG ОЛО ATC TGT

ЖЦ LEU ARG EEIS SER SER LEU GLU ARG GLU CYS ПЕ GLU GLU П,Е CYS

50 - 55 60

200 210 220 230 240

GAC ТТС GAG GAG GCC АЛО ОАА.ЛТТ ТТС САЛ AAT GTG GAT ОАС ЛСЛ СТО

ASP PHE GIU GLU ALA IYS GLU ПЕ PHE GLN ASN VAL Л$Р ASP ТНЛ Ы11

65 70 75 80

250 - 260 270 280

GCC ТТС ТОО ТСС ААО САС ОТС ОАС GGT ОАС СЛО TGC TTG GTC ТТО ССС

ALA PEEE TRP SER LYS HIS VAL ASP GLY ASP GLN CYS LEU VAL LEU РКС

85 90 95

290 300 310 320 . 330

TTG GAG СЛС ССО TGC GCC AGC CTG TGC TGC GGG CAC GGC ACG.TGC АТС

LEU GLU HIS PRO CYS ALA SER LEU CYS CYS GLY HIS GLY THR CYS ILZ

100 105 110

40 после образования тромбина, В противоположность указанному активированному белку С, стандартные антикоагулянты сохраняют свое антикоагулирующее действие в системе кровообращения в течение всего 5 периода введения их пациенту, что значительно увеличивает риск осложнения в виде кровотечения, Поэтому активированный белок С является предпочтительным антикоагулянтом широкого применения и может 10 быть использован вместо гепарина и гидроксикумарина в качестве альтернативного средства.

При некоторых заболеваниях, таких, как наследственный дефицит белка С, зимоген 15 белка С является черезвычайно це ейным терапевтическим средством. Человек с врожденным гомозиготным дефицитом балка С обычно умирает в раннем детстве от молниеносной пурпуры, часто встречающейся ле- 20 тальной формы диссеминированного внутрисосудистого свертывания. Человек с гетерозиготным дефицитом белка С обычно тяжело страдает от рецидивирующих тромбоэмболических осложнений. Клинически было установлено, что концентра-ы белка плазмы, предназначенные для лечения гемофилей В или дефицита фактора iX и содержащие в качестве примеси белок С, являются эффективными для предупреждения и лечения внутрисосудистого свертывания при гетерозиготном дефиците белка С, Было также установлено, что при тромботических состояниях, таких, как диссеминированное внутрисосудистое свертывание, и при заболеваниях, предрасполагающих к тромбозу таких, как обширная травма, обширное оперативное вмешательство, и рак, уровня белка С являются крайне низкими.

Для лучшего понимания механизма активации белка С настоящего изобретения, ниже представлена последовательность аминокислотных остатков для раннего белка С человека. Указанная аминокислотная последовательность и ее соответствующие области в целях настоящего изобретения также характеризует "нативный белок С человеKB

1838411

Х-7953А

340 . 350 360 370 380

С С GGC ATC GGC AGC ТТС AGC TGC ОЛС TGC CGC AGC GGC TGG GAG GGC

ASP GLY ILK GLY SER PHE SER CYS ASP CYS ARG ЯЕВ GLY TRP СЮ GLY

115 120 125

390 - 400

CGC ТТС TGC CAG ССС GAG GTG AGC

ARG РНЕ CYS ИЛ ARG GLU ЧАХ SKR

130 135 !

440: 450

GGC GGC ТСС ACG САТ ТЛС TGC СТЛ

GLY GLY CYS TIIR 1ПБ TYR CYS LKU

145 150

410 420 430

ТТС СТС AAT TGC TCG CTG GAC АЛС

РНЕ ХЕК ЛБИ СУБ БЕВ НЛ ЛБР ЛЯИ

-140

460

GAG GAG

GLU GLU :470 480

GTG GGC TGG CGG CGC TGT

ЧЛЬ ЖУ ТВЗ ЛВС АВО CYS

155 . . 160

490 500, 510 . 520

AGC TGT GCG ССТ GGC ТАС hAG CTG GGG GAC GAC CTC CTG СЛС ТОТ CAC

SER CYS ALA PRO GLY TYR ЬУБ LEU GLY ASP ASP LKU I„KU GLN CYS IIIS

165 170 175

530 540 550 . 560 570

CCC GCA GTG ЛЛО TTC CCT TGT. GGG AGG CCC TGG hAG CGG ATG GAG AAG

РВО А1.Л ЧЛЬ ЬУБ РНЕ РВО СУБ О17 ЛВО РВО ТВР LYS AHG IET GLU LYS

180 185 190

580 590 600 610 620

AAG CGC AGT CAC CTG ЛЛЛ CGA GAC ACA GAA GAC СЛЛ GAA GAC CAh, GTA

IYS ARG SER HIS LKU LYS ARG ASP *ПППБ GLU ASE- GLN GLU hSP СЕЛ VAL

195 200 205

630 . 640 650 " 660 670

GAT CCG CGG CTC ATT СЛТ GGG. ЛЛО ATG ACC AGG CGG GGA GhC AGC CCC

ЛЯР PRO ARG LEU ПЕ ASP GLY IYS ИЕТ ТЛВ hRG ЛКС GIY ASP БЕГ(PRO

210 215 220

680 690 700 710 720

ТСС СЛС ОТО СТС СТО СТО СЛС ТСЛ ЛАС ЛЛО ЛЛС СТО ССС ТСС ОСС ССЛ

ТВР СЬИ VAL VAL LKU LKU ЛБР БЕВ LYS IУБ ХУБ LEU ЛЬЛ CYS GLY А1Л

225 230 235 240

820 830 840 850 860

TGG GAG AAG TGG GAG СТО GAC СТО ОЛС ЛТС AAG GAG GTC ТТС СТС СЛС .

TRP GLU LYS TRP GLU LKU ASP LEU ASP ПЕ LYS GLU VAL PIIK VAL 1ПЯ

275 : 280 285

730 740 750 760

GTG СТС АТС CAC CCC ТСС TGG GTG СТО ЛСА GCG GCC CAC TGC ATG GAT

VAL LKU ILE HIS PRO SER TRP VAL LEU TIIR ALA ALA IIIS CYS ИЕТ ЛБР

245 250 255

45 7953Р 770 780 790 800 :810

GAG ТСС AAG ЛЛС СТС СТТ ОТС AGG СТТ GGA GAG TAT СЛС CTG CGG CGC

GLU SKR LYS LYS LEU LKU ЧАХ ARG LEU GLY GIU ТУВ ЛЯР LKU ЛВО hRG

260, 265 270

1838411

870 880 890 900 910

ССС AAC TAC AGC AAG AGC АСС АСС GAC АЛТ GAC ATC GCA CTG CTG CAC

PRO ASN TYR SER LYS SER ТНВ THR ASP ASN ASP ПЕ ALA LEU LEU НТ8

290 295 300

920 930 940 950 960

CTG GCC CAG ССС ОСС АСС СТС TCG CAG АСС ATA GTG ССС ЛТС-TGC СТС

LEU ALA GLN PRO ALA THR LEU SER GLN ПП ПЕ VAL PRO LE CYS LEU

305 310 315 320

970: 980 990 1000

CCG ОЛС AGC GGC СТТ GCA GAG CGC GAG СТС.АЛТ CAG GCC GGC CAG GAG

PRO ASP SER GLY LEU ALA GLU ARG GLU LEU ASN GLN ALA GLY 61Л GLU

325 330 335

1010 1020 . . 1030 1040 1050

АСС CTC GTG ACG GGC TGG GGC ТАС САС АОС AGC CGA GAG ЛАО GAG GCC

TEER LEU VAL TIER GLY TRP GLY TYR HIS SER SER hRG ОЕБ ЪТЛ 6111 ИЛ

340 345 350

1060 1070 1080 1090 1100

АЛ6 AGA ААС CGC ACC ТТС GTC CTC ЛЛС ТТС ЛТС AAG ЛТТ ССС GTG GTC

LYS ARG ASN ARG ТНЙ РНЕ VAI, LEU ЛНП PIE IIX LYS ПЕ PRO ЪЛХ. 7М

355 360 365

GAG ЯС

GLU ASN

ОЛО GGC

GLU GLY

400

Х-7953А

1210 1220 1230 1240

GAC AGT GGG GGG CCC ATG GTC GCC ТСС ХТС САС GGC АСС TGG ГГС CTG

ASP SER GLY GLY PRO ИЕТ VAL ALA SER PHE HIS GLY THR ТМ& РНЕ ЫИ

405 410 415

1250 1260 12?О 1280 1290

GTG GGC CTG GTG AGC TGG GGT GAG GGC TGT GGG СТС" CTl CAC ААС ТАС

ЧАТ GLY LEU VAL SER TRP GLY GLU GLY CYS GLY LEU LEU HIS ASN TYR

420 425 430

1300 1310 1320 1330 1340

GGC 6TT TAC АСС AAA GTC AGC CGC ТАС СТС GAC TGG ATC СЛТ GGG СЛС

GLY VAL TYR THR LYS VAL SER AR6 TYR LEU ЛЯР TRP ILE HIS GLY HIS

435 440 445 1350 1360 1370 1380

ATC AGA GAC AAG .GAA GCC ССС CAG AAG AGC TGG ОСА ССТ TAG-3

ПЕ ARG ASP LYS 610 ЫА РНО О?Л 17$ SER TRP ALA PRO-СООН

450 455 460

1110 1120 1130

CCG СЛС АЛТ GAG TGC AGC GAG GTC ATG AGC ААС

PRO HIS ASN GLU CYS SER iLU VAL ИЕТ SER ASN

370 . 375

1160 1170 ., 1180

ATG CTG TGT GCG GGC ЛТС СТС GGG GAC CGG CAG

MET LEU CYS ЛХ.А GLY ПЕ LEU G Y ASE ARG GLN

385 390 395

АХО GTG TCT

ИЕТ VAL SER

GAT GCC ТОС

ASP ALA CYS

1838411 где А — дезоксиаденил, G -дезоксигуанил, С вЂ” деэоксицитидил, Т вЂ” тимидил, ALA — аланин, APG — аргинин, ASN — аспарагин, ASP — аспарагиновая кислота, -СООН вЂ” карбоксильный конец, CYS — цистеин, GLN — глутамин, GLU — глутаминовая кислота, 61 У— глици!1, I-IIS — гистидин, Н2 — аминоконец, iLE — изолейцин, LEU — лейцин, LYS — ли.зин, MET — метионин, РНŠ— фенилаланин, PRO — пролин. SEB — серин, ТН — треонин, TRP — триптофан, TYR — тирозин, и VAL— валин.

Изображенная выше ДНК-последовательность происходит от клонов кДНК, полученных от мРНК печени человека, которая кодирует белок С человека, Каждому специалисту известно, что способность генетического кода к вырождению дает воэможность сконструировать много. различных ДН К-последовательностей, кодирующих одну и ту

>ке аминокислотную последовательность.

Таким образом, изображенная выше кДНКпоследовательность для раннего белка С человека является лишь одной из многих возможных последовательностей, кодирующих ранний белок С человека. При конструировании кДНК-клонов, 5 поли G последователы1ость, 3 поли С последовательность, и 5 и 3 - последовательности распознавания рестриктирующего фермента Ps(1 были построены у концов кДНК, кодирующей белок С. Два из указанных кДНК-клонов были модифицированы в целях построения ДНК-молекулы, содержащей кодирующую последовательность раннего белка С человека, а также участки

ДНК, кодиру1ощей нетранслированну!о мРНК у 5 и 3 — концов кодирующей области. Указа1гную ДНК-молекулу вводили в

Pst1-сайт плаэмиды рВР322 в целях построения плазмиды рНС7. Таким образом, плазмида РНС7 содержала вышеуказанную кодиру1ощую последовательность и указанные ниже дополнительные последовательности изображена лишь одна нить молекулы: 5 - CTGC AGG GGG GGG GGG GGG

GGG GG6 CTG ТСА TGG CGG CAG САС CGC

GAA CTT 6CA 6ТА TCT ССА CGA ССС GCC

ССТ ACA GGT GCC AGT GCC ТСС AGA — 3 и

5 - CGA ССС TCC CTG CAG GGC TGG GCT

ТТТ 6СА TGG САА TGG ATG GGA САТ ТАА

A6G GAC ATG ТАА САА GCA CAC CCC ССС

ССС ССС ССС ССС ССС ССС ССТ GCA G - 3 у концов 5 и 3 соответственно кодирующей нити последовательности, кодирующей ранний белок С человека. Благодаря комплементарности при спаривании оснований

ДНК, последовательности одной нити двухн иге вой ДН К-молекул ы впал не достаточно для определения последовательности про10

25 тивоположной нити. Плаэмида рНС7 может быть выделена стандартным способом иэ штамма Е.cali К12 RRI/рНС7, депонированного и являющегося частью постоянного фонда коллекции клеточных культур Северной региональной научно-исследовател ьской лаборатории (RR). Пеория, Иллинойс, Укаэанная культура Е,col! К12 РР! /рНС7 может быть получена из NRRl,. под входящим номером МВИ 8-15926. Сайт рестрикции и функциональная карта плазмиды р IC7 представлены на фиг.2.

Ниже приводятсл так>ха схематическое изображение раннего белка С.

1 42 43 97 19S 199 200 21! 212 1() I ргс-pro С KR ЛР Л! IC

Ф 3 -I

-! !С рге-рго — аминокислотные ос7атки 1 — 42 раннего белка С человека, которые кодиру1от сигнальный пептид и пропе13тид белка С человека, играющие важную роль в направлении секреции и г"карбоксилирования белка С. ! С вЂ” аминокислотные остатки 43 — 197 ра1гнего белка С, которые после пост-трансляционной модификации содср>кат легкую цепь (! С) двухцепочечного з14могг.11а (обраэова11ного из одпоцепочечного эимогена путем удаления дипептида, KBK указано ниже) !1 активированных форм белка С;

KR — аминокислот11ые остатки 198 — 199 раннего белка С человека; указан «1ыа ос1атки, очевидно, могут быть удалены (на основе гомологии с бычьим белком С) с помощью

35 двухстадийного сг3особа, эак>ночающегосл сначала в расщеплении (либо между остатками 197 — 198, либо между оста7ками 199—

200), а затем в воздействии карбоксипептидазой или GI111110IIQI3TII/1Us031

40 с образованием двухцепо1счного белка С;

АР— аминокислотные оста ки 200-211 раннего белка С, содержащие пепгид активации, который удаля!от иэ эимоге1 ных форм белка С в целях получе11ия акгивированного белка С;

ЛНС вЂ” аминокислотные остатки 212 — 461 раннего белка С, которые после пост-трансляционной модификации содер>кат активированну1а тяжелую цепь (АНС) активного

50 белка С;

НС вЂ” тяжелая цепь двухцепочечной формы зимогена белка С которая после посттрансляционной модификац! Iи состоит lз аминокислотных остатков 200-461, АР и

55 АНС, Зимоген человеческого белка С является предшественником сериновой протеаэы, синтеэируемым в печени и присутству1ощим в крови. Для экспрессии новой биологичеcKoI4 активности белок C нуждается 13 пост13

1838411

14 трансляционной модификации, для которой необходим витамин К. Двухцепочечный, с дисульфидной связью зимоген белка С может быть получен из одноцепочечного зимогена путем ограниченного протеолиза.

Указанный ограниченный протеолиз, очевидно, включает в себя расщепление и удаление аминокислотных остатков 198 и 199.

Активация двухцепочечного зимогена в активную сериновую протеаэу представляет собой протеолитическое расщепление пептидной связи APG — LEU {остатки 211 и 212).

Указанное расщепление высвобождает до. декапептид (остатки 200 — 211), пептид активации, который включает в себя амино-концы большей (тяжелой) цепи двухцепочечной молекулы зимогена. Белок С является значительно гликосилированным; зрелый фермент из плазмы содержит 1523 углеводов. Белок С также содержит некоторое число редко встречающихся аминокислот, например, у-карбоксиглутаминовую кислоту и Р-гидроксиаспарагиновую кислоту (эритро-Ц3-гидроксиаспйртат), у-Карбоксиглутаминовая кислота (gia) может быть получена из остатка глутаминовой кислоты путем ) -глутамилкарбоксилирования с использованием микросомной карбоксилазы, для которой в качестве кофактора требуется витамин К. Ниже схематически представлена актинация белка С человека. При этом каждому специалисту известно, что порядок стадий, показанный на схеме, не обязательно отражает порядок стадий при метаболическом пути in vivo рге-pro-LC-KR=AP-AHC ранний белок.С пост-трансляционная модификация, т.е. у-карбоксилирование конкретных остатков глутаминовой кислоты, Р-гидроксилирование остатка аспарагиновой кислоты, и гликосилирование секреция, удаление остатков 1-42, которое может состоять из более. чем одного протеолитического расщепления

LC-KR-AP-ÀÍÑ одноцепочечный зи моген удаление остатков 198-199; около 90 зимогенного белка С, найденного в крови человека. является его двухцепочечной формой (S-S-дисульфидная связь)

4С

I активация тромбин- я g двухцепочечныи зимо ген

ДНС-ДК тромбомодулином 4С

1 активированный, < белок С

Изобретение относится к получению новых соединений, векторов. трансформантов и способов рекомбинантной экспрессии новых зимогенов белка С.

Были использованы следующие обозначения:

Ad2LP — главный подний промотор аденовируса типа 2.

Аминокислотные остатки в белках и пептидах обозначены аббревиатурами, представленными в табл.1, ApR — ампициллин — устойчивый фенотип или его несущий ген

ВК вЂ” ДЕК от ВК-вируса

Enh или энхансер — энхансер BK-вируса. ер или SV40 ер - ДНК - сегмент, содер. жащий SV40 — ранний промотор гена T-антигена. области связывания T-антигена, 40- энхансер, и точка инициации репли20 KaL;èè SV4G. у"карбоксилирование — реакция присоединения карбоксильной группы к глутаминовым кислотам у у-углерода. у-карбоксилированный белок — белок, в

25 котором некоторые остатки глутаминовых кислот были подвергнуты 1карбоксилированию, GBMT — транскрипционная единица— модифицированная единица регулирования

30 транскрипции, содержащая знхансер Р2

ВК-вируса, расположенный непосредственно выше регуляторного элемента главного позднего промотора аденовируса; поздний главный промотор аденовируса-2, элемент

35 поли-GT, с1 имулирующий указанный промотор, и ДНК-последовательность, содержащую разделенную на три части сплайсерную лидерную последовательность аденовируса. G BMT — транскрипцион40 ная единица находится приблизительно на

HlflcIIII - рестриктиционном фрагменте 900 п.с. плазмиды pGTIV - ДН К, кодирующая интрон, так называемая внедряющаяся последовательность, 45 MMTpro — промотор мышиного гена металлотионеина-1.

Ранний белок -полипептид,продуцированный после трансляции мРНК-транскрипта. до любых пост-трансляционных

50 модификаций. Однако пост-трансляционные модификации, такие, как карбоксилирование остатков глутаминовой кислоты и гидроксилирование остатков аспаргиновой кислоты, могут иметь место перед тем, как

55 белок будет полностью транслирован о м P Н К-тра нскрипта, NoeR - ген, несущий устойчивость к неомицину, который .может быть также использован для переноса устойчивости к антибиотику 6418.

1838411

16 клетку-реципиент ДНК, измсняющую генотип указанной клетки-реципиента. 45

55 рА - ДНК - последовательность, кодирующая сигнал полиаденилирования, Промотор - ДНК-последовательность, которая направляет транскрипцию ДНК. в

РН К.

Активность белка С вЂ” любое свойство белка С, ответственное эа протеолитическую, амидолитическую, эстеролитическую и биологическую антикоагулирующую или профибринолитическую активности, Методы испытания белка на антикоагулирующую активность хорошо известны, Вектор клонирования рекомбинантной

ДНК - любой агент, например агент хромосомной интеграции, автономно реплицирующиеся плазмиды, и фаги, содержащие

ДНК-молекулу, к которой могут быть добавлены один или несколько дополнительных

ДН К-фрагментов.

Вектор экспрессии рекомбинантной

ДН К - любой вектор клонирования рекомбинантной ДНК, в который вводят промотор в целях стимулирования генного продукта. .Вектор рекомбинантной ДНК вЂ” любой вектор клонирования и экспрессии рекомбинантной ДН К.

Репликон - ДНК-последовательность, контролирующая и направляющая автономную репликацию плазмиды или другого вектора.

Фрагмент рестрикции — любая линейная ДН К-последовательность, генерированная с помощью одного или нескольких рестриктирующих ферментов, Восприимчивая клетка-хозяин — клеткахоэяин, которая неспособна развиваться в присутствии данного антибиотика или другого токсичного соединения, если отсутствует ДНК-сегмент, несущий уСтойчивость к данным соединениям.

TcR — тетрациклин — устойчивый фенотип или ген, несущий указанный фенотип.

Трансформация — введение в хозяйскую

Трансформант — хозяйская клетка-реципиент, подвергнутая трансформации.

Трансляционйая активирующая последовательностьть — любая ДН К-последовательность, включающая последовательность, кодирующую область связывания с рибосомой и кодон инициации трансляции, такой, как 5 -ATG - 3, который обеспечивает трансляцию мРНК-транскрипта в пептид или полипептид.

Зимоген — ферментативно неактивный предшественнйк протеолитического фермента. Используемый в настоящем описании термин "зимоген белка С" относится к

40 секретируемым неактивным одноцепочечным или двухцепочечным формам белка С.

На фиг. 1 представлены рестрикционный сайт и функциональная карта плазмиды

pLPC-Q097; на фиг.2 — сайт рестрикции и функциональная карта плазмиды pLPC0248; на фиг,3 — сайт рестрикции и функциональная карта плазмиды pLPC-0313; на фиг.4 — сайт рестрикции и фун кционал ьн а я карта плазмиды pLPC-Q329; на фиг.5 — сайт рестрикции и функциональная карта плазмиды РОТС; фиг, 6 представляет собой сайт рестрикции и функциональную карту плаэмиды pGT-d; нэ фиг.7 — сайт рестрикции и функциональная карта плазмиды РОТ-I>, Изобретение позволяет получить ДНКсоединения, кодирующие. экспрессию новых зимогенных форм белка С человека, Некоторые способы получения зимогена нативного белка С человека и раннего белка С человека известны. Способы прототипов направлены на экспрессию зимогенных форм белка С человека, аминокислотная последовательность которых не отличается от аминокислотной последовательности эимогенных форм, присутствующих в крови человека. При экспрессии в„определенных линиях эукариотических клеток, таких, как линия 293 клеток почки человека, секретируется зимоген нативного белка С человека с новым типом гликосилирования, который отличается от формы зимогена, обнаруженного в крови человека.

Изобретение относится к получению эимогенных форм белка С человека, которые имеют измененные типы гликосилирования вследствие сайт-направленных изменений в последовательности аминокислотных остатков. указанные активированные зимогенные формы имеют более высокую амидолитическую и антикоагулирующую активность по сравнению с нативным белком

С человека. Изобретение также относится к

ДНК-соединениям, векторам экспрессии рекомбинантной ДНК, линиям трансформированных клеток и способам рекомбинантной экспрессии указанных новых зимогенных форм белка С человека, Способ продуцирования ухазанных форм зимогена белка С человека заключается в том, что:

А) эукариотическую хозяйскую клетку

lр,ансформируют с помощью фактора рекомбинантной ДНК, причем указанный вектор содержит: (i) ДНК-последовательность, кодирующую последовательность аминокислотных остатков, которая от аминоконца до карбоксильного конца включает в себя следующую аминокислотную последовательность. t838411

x — 7953 A

10 fKT TRP (ЛЛ LKU THR SER IXU LEU LEU РНЕ VAL ALA ПВ TRP GLY ILE

SER GLY T«lR PRO ALA PRO LEU А$Р SFR VAL РНЕ SER SER SER GLU ARG

ALA HIS GLN VAL LKU ARG ILE ARG LYS ARG Л?А ASN SER PHE LEU GLU

GLU LEU ARG HIS SER SER LEU GLU ARG СЫ CYS ILE GLU GLU ILE CYS

ASP PHE GIU GLU ALA LYS GLU ILE PHE GLN ASN VAI, ЛЯР ASP ТНВ LEU

ALA PHE TRP SER LYS HIS VAI, ASP GLY ASP GLN CYS LEU ЧАТ; LEU PRO

LEU GLU «ПБ PPO CYS ALA SER LEU GYS CYS GLY HIS GLY THR CYS ПЕ

ASP GLY ПЕ GLY SER РНЕ SER CYS ASP CYS ARG SER GLY TRP GLU GLY

ARG PHE CYS GLN ARG GLU VAL SER РНЕ LEU 21 CYS SER LE«J ASP ASN

GLY GLY CYS ТЫЛ HIS TYR CYS LEU GLU GLU VAL GLY TRP ARG ARG CYS

SER CYS ALA PRO GLY TYR LYS LEU СЬУ ЛБР ASP LEU LEU GLN CYS !ПБ

PRO ALA VAL LYS РНЕ PRO CYS GLY ARG PRO TRP LYS ARG ИЕТ GLU LYS

LYS ARG SER «ПБ LEU LYS ARG ASP THR GLU АБР GLN GLU ASP GLN VAL

35

ASP PRO ARG LEU ПЕ ASP СТ,Ъ IYS ИЕТ Т«П ARG ARG GIY ASP SER PRO

ТВР С?Л ЧЛЬ ЧЛТ.,Е«« ЪЕ«« ЛБР ЯЕВ ЬУБ ЬУЯ ЕУБ ?Е«« ЫЛ СУЯ GLY ALA

VAL LEU ILE JlIS,PRO SER TPP VAL LKU TER ALA ALA HIS СУЯ ИЕТ ЛЯР

GLU SER LYS

Х-7953А

TRP СЫ LYS

LYS LEU LEU

TRP GLU LEU

LYS ARG Вз ЛКС THR PHE VAL LEU ASN PHE IIE LYS ПЕ PRO VAL VAL

PRO HIS R4 GLU CYS SER GIU VAL ИЕТ SER ASN ИЕТ VAI. SER GLU ASN

ИЕТ LEU CYS ALA GLY ILE LEU GLY ASP ARG GLN ASP ALA CYS GLU GIY

ASP SER GLY GLY PRO ИЕТ VAL ALA SER PHE «ПЯ GLY T«IR TRP PHE LEU

VAL GLY LEU VAI, SER TRP GLY GLU GLY CYS GLY LEU LEU HIS ASN TYR

GLY VAL TYR ТНЯ IYS VAL SER ARG TYR LEU АБР ТИ. ILE HIS GLY HIS

ILE ARG ASP LYS GLU ALA PRO GLN LYS SEP, TRP ALA PRQ-COOH

PRO Rg TYR SER LYS SER

IEU AIÀ СТ«« РВ0 АХ.А Т«В

PRO ASP SER GLY LEU ALA

THR LEU VAL THR GLY TRP

VAI. АРС LEU GLY GLU TYR ASP LKU ARG ARG

ASP СКЦ ASP ILE LYS GLU VAL P«K VAL «ПБ

THR T««R ASP ASN ASP ILE ALA LEU LEU HIS

LEU ЯЕР GLN THR П.Е VAL PRO П.Е CYS LEU

GLU ARG GLU LEU ASN GLN ALA GLY ИЛ GLU

GLY TYR HIS SER SER ARG GLU LYS GLU ALA

1838411

20 м

O где В1 выбирают иэ группы. содержащей

ASN и GIN, Rz выбирают из группы. содержащей ASN и GIN, Вз выбирают из группы, содержащей ASN u GIN и Из выбирают-из группы, содержащей ASN и GIN; R4 выбирают из группы, содержащей ASN и GIN; (П) промотор для регулирования экспрессии укаэанной ДН К-последовательности;

В) хозяйскую клетку, трансформированную в стадии (А) культивируют при условиях, способствующих экспрессии указанной

ДНК-последовательности и

С) указанный зимоген белка С выделяют из культуры, Изобретение также относится к ДНКсоединениям, используемым в целях получения новых зимогенных форм белка С человека, Все укаэанные соединения кодируют препропептид, содержащий сигнальный пептид для направления секреции и пропептид из у-карбоксилированного (посредством воздействия витамин К-зависимои карбоксилаэы), белка. Такие пропептидные последовательности хорошо известны специалистом. См., например, Su>tie и др., 1987, Proc.Matt, Acad. Sei.

34:634-637. Предпочтительно для простоты конструирования, если последовательность, кодирующая сигнальный пептид, и последовательность, кодирующая пропептид, будут происходить от аминокислотной последовательности пре-пропептида у-карбоксилированного белка. Примерами таких у-карбохсилированных белков являются (но не ограничиваются ими) фактор Vll, фактор

IX, фактор Х, протромбин, белок S, белок Z и белок С, ДНК-последовательность, .кодирующая пре-и ропептид белка С человека является предпочтительной для введения в вектор настоящего изобретения, Кроме того, ДНК-соединения изобретения содержат последовательность кодирования для легкой цепи белка С человека, которая расголожена непосредственно за пре-пропептидкодирующей последовательностью и втрансл,яционной рамке считывания. Легкая цепь белка С человека содержит аминокислотные остатки от 43 до 197 включительно, раннего белка С, как указано выше. Амино-концевые части витамин

К-зависимых белков плазмы, также, как амина-концевая часть легкой цепи белка С, имеют область связывания C кальцием, Области связывания с кальцием указанных белков плазмы, таких, как фактор Vil, фактор IX, фактор У., протромбин и белок S могут быть использованы аналогично областям связывания с кальцием легкой цепи белка С чело10

50 века. В одной из новых форм зимогена (097) изобретения остаток аспарагина в положении 139 в легкой цепи заменяли на остаток глутамина. удаляя тем самым область гликосилирования.

ДНК-соединения изобретения, кроме того, содержат последовательность, кодирующую дипептид LYS-ARG (KP), которая расположена непосредственно за последовательностью, кодирующей легкую цепь и в трансляционной рамке считывания с этой последовательности. Двухосновный дипептид, такой, как LYS — APG расположен в раннем белке со стороны карбоксильного конца легкой цепи. Ориентация дипептида

LYS-ARG в экспрессированном белке не относится к целям изобретения. Для целей изобретения, двухосновные дипептиды, такие, как LYS — LYS или ARG ARG, эквивалентны дипептиду LYS — ARG. Однако для целей изобретения, дипептид LYS — ARG, который представляет собой дипептид нативного белка С человека, является предпочтительным.

Непосредственно ниже за кодонами для LYS — ARG-дипептида расположена последовательность, кодирующая пептид активации. При этом следует отметить, что зимогены изобретения в основном отличаются от нативных форм зимогенов белка С человека, описанных ниже.

Кроме того, другие замещения аминокислот, в дополнение к замещению в положении 139 в легкой цепи, также может способствовать:усилению амидолитической и антикоагулирующей активностью полученного эимогена. Выражение "полученный зимоген" указывает на то, что, хотя замещения описываются со ссылкой «а положения в раннем белке С человека, однако ранний белок С человека должен быть сначала выделен (в результате удаления аминокислотных остатков от 1 до 42) для получсния эимогенной формы. Таким образом, замещение остатка аспарагина в положении 139 (в раннем белке С человека) остатком глутамина приводит к новой форме эимогена настоящего изобретения, Замещение остатка аспарагина (в активированной тяжелой цепи) в любом иэ положений 290, 355 или 371 остатком глутамина привоДит к новой форме зимогена изобретения.

Таким образом предпочтительные новые формы зимогена белка С человека изобретения могут быть получены в результате секреции и процессинга молекул раннего белка С человека, имеющих следующую аминокислотную последовательность:

22

1838411 х- в зА

ИЕТ TRP GLN LEU THR SER LEU

SFR GLY THR PRO АХА PRÎ LEU

ALA HIS GLN VAL LEU ARG ILE ARG LYS ARG ALA ASN SER РНЕ I.ÅU GLU

GLU LEU ARG HIS SER SER LEU

ASP PHE GLU GLU ALA IYS GLU

ALA PHE TRP SER LYS HIS VAI ASP GLY ASP GLN CYS LEU VAL LEU PRO

LEU GLU HIS PRO CYS ALA SER LEU CYS CYS GLY HIS GLY ТНВ CYS ПЕ

ЛЯР GLY ILE GLY SKR РНЕ SKR CYS ASP CYS ARG SER GLY TRP FLU GLY

ARG РНЕ CYS GLN ARG GLU VAL SER PIIE LEU R CYS SKR LKU ASP ЛЯК

GLY GLY CYS ТНВ HIS TYR CYS LEU GLU GLU VAL GLY TRP ARG ARG CYS

SER CYS ALA PR0 GLY TYR LYS LKU GLY ASP ЛЯР LEU LEU GLN CYS НЕЯ

РВО АХЛ ЧАХ. ХУЯ РНК РВО СУЯ ОХ,У АВО РВО ТВР ХУЯ АВС МКТ 6Ы ХУЯ

35 - 79535

LYS ARG SER HIS LEU LYS ARG ASP THR GLU ASP GLN GLU ASP GLN VAL

GLY LYS ИЕТ ТНВ ARG ARG GLY ASP SKR PRO

ASP PRO ARG LKU ПЕ АЯР

VAI, LEU LEU ASP SER IYS LYS LYS LKU ALA CYS GLY AIA

HIS PR0 SKR TRP VAL LEU ТНВ ALA ALA HIS CYS ИКТ ASP

TRP GLN VAL

ЧАХ LEU ПЕ

GLU SER LYS LYS LEU LEU VAI ARG LEU GLY GLU TYR ASP LKU ARG АВС

TRP GLU LYS TRP GLU LEU ASP LKU ASP ILE LYS GLU VAL РНЕ VAL HIS

PRO Rg TYR SER LYS SER ТНВ НП ASP ASN ASP ILE ЛХА LKU LEU HIS

ILE ЧЛХ PRO ILE CYS LEU

Х,Е1Х SKR GLN ТНВ с

GLU ARG GLU LEU

ЛЯБ GLN ALA,GLY GLN GLU

THR LEU VAL THR GLY TRP GLY TYR HIS SER SER ARG GLU LYS GLU ALA

LYS ARG Вз ARG THR РНЕ ЧАХ LEU ASN РНЕ П,Е LYS LE PRÎ ЧАХ VAL

PR0 HIS R4 GLU CYS SKR GLU ЧЛХ ИКТ SER ASN МЕТ ЧАХ SER GLU ASN

MET LEU CYS ALA GLY ПЕ LEU GLY ASP ARG GLN ЛЯР ALA CYS GLU GLY

ASP SER GLY GLY PRO LENT VAL ALA SER PHK kkIS GLY TkkR TRP PkiE LEU

VAL GLY LEU VAL SER TRP GLY GLU GLY CYS

GLY ЧАХ TYR THR LYS VAL SER ARG TYR LEU

GLY LEU LEU HIS ASN TYR

ASP TRP П.Е HIS EELY HIS

ПЕ ARG ASP LYS GLU ALA PRO GLN ЛЯ SKR TRP ALA PRO-СООН

LEU ALA GLN PR0 ALA THR

25 PRO ASP SER GLY LEU ALA

LEU LEU PHE VAL ALA TliR ТВР GLY П,Е

ASP SER ЧЛХ РНЕ SER SKR SER GLU ARG

GLU ARG GLU CYS ПЕ GLU GLU ILE CYS

1 с

ILE PHE GLN ASN VAL ASP ASP THR LEU

1838411 где R ) выбирают иэ группы, содержащей

ASN и GIN, Rz выбирают из группы, содержащей ASN и GIN, йз выбирают из группы, содержащей ASN и GIN, и R4 выбирают из группы, содержащей ASN u GIN.

Новый зимоген Q,097 включает замещение остатка аспарагина в положении 139 остатком гпутамина. Зимоген 0,248 включает замещение остатка аспарагина в положе10

15 нии 290 остатком глутамина, Зимоген Q,313 включает в себя замещение остатка аскарагина в положении 355 остатком глутамина, а зимоген 0.329 включает в себя замеЩение остатка аспарагина в положении 371 остатком глутами <а.

При этом следует отметить, что вследствие вырождения генетического кода некото рые ДНК-соединения могут кодировать изображенный выше полипептид. Следова20 тельно, описанные ниже конструкции и примеры получения предпочтительных

ДНК-соединений, векторов и трансформантов изобретения являются всего лишь иллюстративными и не ограничивают объема изобретения, Кроме того, замещение GIN

25 вместо ASN является иллюстративным и не ограничивает объема настоящего изобретения, поскольку могут быть использованы и другие.заiлещения, за исключением CYS или PRO. К тому х<е следует отметить, что

30 ченный для усиления экспрессии от промотора, Векторы были трансформированы в Е.coll К12 AGI êëåòêè и депонированы в основном фонде клеточных культур Северс ной региональной исследовательской лаборатории в Peoria, Иллинойс 61604 от 9 января 1990 r. Конкретные культуры, даты депонирования и входящие номера представлены в табл.2.

С помощью стандартной техники получают культуры и выделяют плаэмиды, кото45

55 рые затем тра нсфецируют непосредственно в хозяйские эукариотические клетки в целях прордуцирования зи логенных форм белка человека С. Плаэмиды предпочтительно трансформировать в хо зяйские клетки, которые экспрессируют не \ различные замещения отдельных. аминокислот настоящего изобретения могут сочетаться для создания новых зимогенов, Все ДНК-соединения изобретения были получены посредством сайт-специфическо- 35 го мутагенеза гена белка С человека. Подвергнутые мутагенеэу зимоген-кодирующие молекулы затем вводили в эукариотические векторы экспрессии для осуществления экспрессии генов зимогенов с помощью глав- 40 л ного позднего промотора аденовируса-2.

Указанные векторы содержат также элемент знхансера Р2 ВК-вируса, предназнапосредственно ранний генный продукт аденовируса EIA, поскольку BK-энхансер. действующий на векторной основе, наиболее эффективно усиливает экспрессию в присутствии EIA. Для специалистов следует отметить, чт0 имеется ряд клеток-хозяев, которые экспрессируют или которые могут быть адаптированы для экспрессии непосредственно раннего генного продукта большого ДНК-вируса. Предпочтительными линиями клеток являются линия клеток почки человека 293 депонированная в Американской коллекции типовых культур под номером допуска ATCC GRL1573 или ли ия клеток АУ12 сирийского хомячка (АТСС

9595). Однако наиболее предпочтительной является линия клеток 293 почки эмбриона человека.

Для получения более высоких уровней экспрессии из депонированных векторов могут быть вырезаны гены, кодирующие различные формы зимогена белка С, и лигированы в вектор, содержащий транскрипционную единицу 6BMT. В частности, плазмида pGT-h, когорая содержит ген, несущий устойчивость к гидромицину, может быть получена из МВК3 (ИВЕТ. В-18591)

Ппазмидный остов получают пугегл переваривания плазмиды рестриктирующим ферментом Bell с последующим выделением плазмидной ДНК из баге-штамма E.coli, несущего метилазу, например, GN48 (NRRI В15725), Каждый из этих новых генов зимогена может быть выделен из их соответствующих плазмид путем Bell-переваривания, Векторный остов очищают и дефосфорипируют, а загем любой из генов нового.зимогена настоящего изобретения лигируют в Hell-сайт, Ппазмиды, содержащие гены нового зимогена, расположенные за 6ВМТ-транскрипционной единицей, затем трансформируют в клетках 293, культивируют, и полученные новые зимогены очищают от культурьt с помощью стандартной техники. Способ очистки белка С человека из культуры, например, описан Уап.

Соединения изобретения также включают в себя зимогенные формы, генерированные при секреции ранних белков настоящего изобретения, Таким образом, соединения изобретения включают ДНК-кодирующие последовательности, векторы экспрессии, направляющие экспрессию указанных последовательностей, ранние белки, продуцированные при трансляции мРНК-транскриптов, генерированных из указанных кодирующих последовательностей, зимогены, продуцированные при секреции укаэанных ранних белков и

1838411

5

55 активи ров ап н ые и роиэводные н екоторых зимогенов.

ДНК-соединения изобретения могут быть также синтезированы химически или путем объединения рестрикционных фрагментов, или путем объединения укаэанных способов, харашо известных специалистам.

Механизм синтезирования ДН К также хорошо известен специалистам и может быть использован для конструирования соединений изобретения.

Характерные векторы изобретения содержат ВК-эпхансер, предназначенный для стимулирования транскрипции главным поздним промотором аденовируса кодирующей последовательности изобретения, При этом каждому специалисту известно, что существует большов количество эукариотических праматоров, знхансерав и экспрессирующих векторов, которые обычно используются в аналогичных целях и могут использованы в cnocobe настоящего изобретения. Специалистам также известно, что эукариотический вектор экспрессии мо. жет быть использован и без эпхансерного элемента, Ключевым аспектом изобретения является не конкретный энхапсер, если он присутствует, или прамотор, используемый длл управления экспрессией зимогапа белка С, а новая кодирующая паследавате>-ьность и соответствующие белки, продуциравапные из указанной последовательности, Однако выбор BBKTopHblx элементов, таких, KBI; энхансеры, проматары, и селектируемые маркеры, может сильно повлиять на конечные уровни белка, прадуцируемого эукариатичеакой клеткой-хозяином. В публикации Еврапатента 0245949, опубл. 19 ноября 1987 г. вводимого в предлагаемое описание посредством ссылки, описывается.ряд экспрессирующих векторов для зимагена нативнаго белка С, в которых используется ВК-знхансер в целях стимулирования эукарлотического праматора, направля ащего экспресси а раннего белка С человека, Указанные векторы обеспечивают экспрессию особенно высоких уравнел, если их трансформировать в эукариатические клетки, которые так>xe экспресс«рушат непосредственно ранний генныл продукт

„большого ДНК-вируса, такого, как EIA-адепавируса. Как видно из описапил характерных векторов р6Т-G097-h, рСТ-0248-9, рСТ-0313-h и рСТ-329-К раскрываемых в данном описании изобретения, способ экспрессии генного продукта СВМТ-Е!А является особенно предпочтительным для использования в нем векторов на=таящего изобретения.

Изобретение не ограничено использованием какой-либо определенной эукариотичес кой клетки-хозяина. Ряд эукариотических хозяйских клеток являются доступными, т.е. находятся в хранилищах, например, в АТСС, Роквилль, М0 20852, и могут быть использованы для целей настоящего изобретения. Выбор конкретной клетки-хозяина в определенной степени зависит от конкретного вектора экспрессии, используемого для управления экспрессией ДНКсоединений, кодирующих белок С. Так как ранний белок С человека и производные раннего белка С человека изобретения подвергаются значительной пост-трансляционной модификации, то некоторые хозяйские клетки являются более предпочтительными для использования векторами настоящего изобретения. В публикации Европатепта N"

0245949 и в работе Grlnell и др. i987, Bio!Technology 5:1189 указываетсл, что для получения рекомбинантнаlо продукта )карбаксилираванных белков, таких. как белок С человека, особенно предпочтительными являются адепавирустрансформированные клетки пачки эмбриона человека, Одной из таких аденовирус-трансформированных эмбриональных клеточных линий почки человека является линия 293, которая может быть получена из ATCC под входящим поморам

АТСС СИ 1573. Линия клеток 293 являет я также предпочтительной для использования с векторами настоящего изобретения, Однако преимущества продуцирования

1"-карбоксилираванна о белка, такого, как зимаген белка С человека, в аденавирустрансформированной линии клеток не ограничиваютсл использованием аденалирустрапсформираванпых клеток пачки эмбриона человека. Факти lpски, адеповирустрансфармиpавапные клетки явлл атся исключ«тельными хозяевами для прадуц«рован«я -карбосилираваннаго белка Г человека, Одной vç наиболее предпочтительных линий клеток этого типа является линия клеток АУ12-664 (обозначаемая нижс

"AY12"), которую можно получить из АТСС под входящим нол ерам АТСС CRL 9595. Лини а клеток АУ12 конструировали путем ипьециравапил сирийского хомячка путел введения в загривок человеческога аденавируса 12» выделения клеток из полученной опухали. Ниже, в примере 3, описана трансформация линий клеток 293 и АУ12 с памащыа характерного вектора рС1-0097-I, Векторы изобретения могут быть трансформированы и зкспрессированы в ряде зукариотических клетках-хозяевах. напри1838411

40

50 мер, в клетках млекопитающих, Векторы настолщего изобретения, которые не имеют селектируемый маркер длл выделения и идентификации стабильных эукариотических трансформантов, используютсл не только длл временных анализов, но и также длл совместной трансформации. Векторы изобретения могут также содержать последовательности, которые стимулируют репликацию в Е.coll поскольку обычно более эффективно продуцировать плазмидную

ДНК в E.coli, чем s других хозяйских организмах, Зкспрессил последовательностей, кодирующих белок С человека и содержащихся в векторах настоящего изобретения, происходит в тех клетках-хозяевах, в которых конкретный промотор ассоциирован с функциями структурного гена. Характерные клетки-хозяева, подходящие для использования их в изобретении, представлены в та 5А.3.

Как видно из данных табл.З, многие хозяйские клетки млекопитающих облада1от необходимым клеточным механизмом распознавания и надлежащего процессинга сигнального пептида на ранних белках изобретения и обеспечивают пост-трансляционные модификацйи, такие, . как гликосилирование, )карбоксилирование, и

/З-гидроксилирование, как зто имеет место в белке С человека, присутствующего в плазме крови. Однако, как указывалось выше, оптимальный пост-трансляционный процессинг НРС происходит в аденовирустрансформированных клетках. Для трансформации указанных эукариотических клеток может быть использован широкий диапазон векторов, обсуждаемых ниже, однако, примеры описываемых ниже векторов не ограничивают обьема изобретения.

Векторы pSY2-типа содерх<ат сегменты генома SY40, которые составляют определенная эукариотическая транскрипционная единица-промотор (ер), нитрон (IYS), и область полиаденидированил (рА). При отсутствии Т-антигена SY40, плазмидные векторы pSY2-типа трансформируют хозяйские клетки млекопитающих или других эукариотические клетки путем интеграции хромосомной ДНК в хозяйскую клетку, Был сконструирован ряд плазмидных векторов типа pSY2, где SY40-промотор осуществляет транскрипцию инсертированного гена.

Указанные векторы могут быть использованы с кодирующими последовательностями настоящего иэобретенил и являются доступными, так как находятся в Американской колЛекции типовых культур (АТСС) в

Роквилле, Мэриленд, или в Северной региональной исследовательской лаборатории (ИЙИ ) В Пеории, Иллинойс.

Плазмиды pSY2-dhfr (АТСС 37146) содержит мышиный ген дигидрофолат-редуктазы (0Ь1г) под контролем раннего промотора SY40. Известно, что при определенных условиях rell dhfr можег быть амплифицирован или реплицирован в хозяйской хромосоме. Эта аплификация может включать ДНК-последовательности, примыкающие к 0Иг-гену, например, последовательность, кодирующую белок С нас оящего иэобретенил, и таким образом может быть использована для увеличения продуцированил эимогенов белка С настоящего изобретения.

В плазмидах, которые были сконструированы и цепях экспрессии раннего белка С и зимогенов белка С изобретения в клетках млекопитающего и других эукариотических клетках-хозяевах, может быть использован широкий ряд промоторов. Однако изобретение ни в коем случае не ограничивается конкретными эукариотическими промоторами, представленными 0 настоящем описании изобретения в Качестве примера. Такие Ilpoмоторы, как поздний промотор ЗУ40 или эукариотические промоторы, описанные

Bucher и др., 1986, Nuc.Acids, Res.

14(24):1009, или промоторы от эукариотических генов, например, таких, как экстрогениндуцируемый ген куриного овальбумина. гены интерферона, глюкокортикоид-индуцируемый ген тирозин-аминотрансферазы, ген тимидин-киназы и главный ранний и поздний гены аденовируса, могут быть легко выделены и модифицированы с использованием векторов . экспрессии рекомбинантных ДНК, сконструированных в целях получения зимогена белка С в зукариотических клетках-хозяевах. Эукариотические промоторы могут Сыть также использованы в тандеме для управления экспрессией кодирующей последовател ьности настоящего изобретения, Кроме того, известно большое количество ретровирусов, которые инфицируют широкий ряд эукариотических клеток-хозяев. Длинные концевые повторы BДНК peTpoBMp) часто кодируют промоторну1о активность l1 поэтому могут быть использованы для управления экспрессией кодирующих последовательностей настоящего изобретения.

Плазмида pRSYCat (АТСС 37152) содержит участки длинных концевых повторов вируса саркомы Рауса (RCY), который, как известно, поражает кур и другие хозяйские клетки. Последовательности длинных кон1838411

50 цевых повторов RSY могут быть выделены на 0,76 кв Ndel-Hlndlll -рестрикционном фрагменте плазмиды pRSYcat, Промотор в длинном концевом повторе RSY является подходящим для его использования в векторах изобретения. Плазмида рМЯ% (МЯВ1

В-15929) содержит длинные концевые повторы вируса мышиной саркомы (MSY), который, как известно, пора>кает мышей и другие хозяйские клетки. Эти последовательности повторов могут быть использованы в качестве промоторов в векторах йастоящего изобретения, Промоторы мышиного гена металлотионеина (MMT) так>ке я вляЪтся весьма подходя щим для испол ьзования в эукариотических хозяйских клетках и в векторах настоящего изобретения, MMTпромотор присутствует 15 кв плазмиды

pdBPY-ММТпео (АТСС 37224), которая может служить в качестве исходного материала для конструирования других плазмид изобретения.

Можно осуществить множество модификаций и вариаций иллюстративных ДНКпоследовательностей и плазмид изобретения. Например, вырождение генетического кода предусматривает замещение нуклеотидов на, протяжении пептидкодирующих областей, а также в стоп-сигнале трансляции без альтерации полипептидкодирующей последовательности могут быть получены из известной аминокислотной или ДН К-последовательности белка С человека с помощью конструирования с использованием стандартных методов синтеза или сайт-специфического мутагенеэа, Синтетические методы могут быть осуществлены, например, в соответствии с процедурами, описанными Hakura и др, Следовательно, изобретение не ограничивается ДНК-последовательности и плазмидами, представленными в описании в качестве примера.

После трансформации вектора настоящего изобретения в эукариотических клетках-хозяевах, полученные трансформанты могут быть отобраны на основе селектируемого фенотипа. Этот селектируемый фенотип может быть наделен любым селектируемым маркером, присутствующим в векторе экспрессии или в другом векторе, -совместно трансформированным с вектором экспрессии в клетке-хозяине. После отбора трансформантов, желательно идентифицировать те трансформанты, которые экспрессируют наиболее высокие уровни целевого белка, колированного вектором

Экспрессии. Указанная идентификация особенно важна после процедуры совместной трансформации. которая генерирует ряд

45 трансформантов, содержащих лишь плазмиду с селектируемым маркером и не содержащих вектор экспрессии. В приведенном ниже примере 4 описана не только процедура идентификации клеток, экспрессирующих и секретирующих целевой белок, но и также процедура количественной оценки секретированного белка по сравнению с другими клетками, исследованными с использованием этого способа. Описанная процедура также предусматривает выделение жизнеспособных клеток, секретирующих наиболее высокие уровни целевого белка.

Способы активации зимогенных форм белка С человека до активированного белка

С (АРС) являются давно отработанными и хорошо известны специалистам. Белок С может быть активирован с помощью одного тромбина, комплекса тромбин-тромбомодулин, яда гадюки Рассела, или с испол.ьзованием широкого ряда других средств, Активность зимогенов белка С человека может быть измерена после активации тромбином с помощью анализов на амидолитическую или антикоагулирующую активность, Активацию тромбином и анализы на активность белка С амидолитическую и антикоагулирующую активность осуществляли по Grlnnell и др., 1987, Biotechnolngy

5;1189-1192 (вводится в настоящее описание посредством ссылки), Амидолитические активности углеводородных мутантов белка

С представлены в табл.4.

Молекулы зимогена, использованные в анализах табл,4, были оценены количественно с помощью анализа ELISA c использованием моноклональных антител, которые не способны вступать в реакцию с мутантами или производными в такой степени, как это делают молекулы дикого типа, из которых происходят эти антитела. Затем проводили очистку и количественную оцснку на основе содержания белка, в результате чего получали данные, приведенные в табл.5.

Кроме того, помимо более высокой антикоагулирующей активности производных, представленных в табл.5, мутант 0313 показал повышенное сродство к тромбину, что привело приблизительно к трехкратному увеличению степени активации одним тромбином или тромбином в сочетании с кофактором тромбомодулином. Это увеличение скорости активации может быть использовано при создании более восприимчивой формы эимогена белка С для клинических применений. а также для улучшения способа расщепления зимогена белка С в целях получения активированного белка С, В

1838411

10

50 табл,б представлен кинетический параметр активации зимогена 0313.

Представленные результаты являются средними из трех независимых определений. Значения определялись с помощью линейно-регрессионного анализа, Активированный белок С обладает значительной антитромботической активностью при использовании его для предупреждения распространения внутривенных тромбов и для предупреждения смертности и повреждения органов при сепсисе, вызванном грамотрицательной бактерией, эндотоксикоза и диссеминированного внутрисосудистого свертывания. И особенно важно, что повышенная функциональная активность активированных производных белка С изобретения позволяет использовать сниженные дозы при вышеуказанных клинических показаниях, что способствует повышению безопасности лекарственного средства.

Активированные рекомбинантные зимогены белка С настоящего изобретения могут быть использованы в целях предупреждения в лечении широкого ряда приобретенных заболеваний сопровождающихся внутрисосудистым свертыванием, таких, как тромбофлебит, эмболия легких, периферический артериальный тромбоз, эмболия, вызванная поражением сердечных или периферических артерий, острый инфаркт миокарда, тромботические шоки, и диссеминированное внутрисосудистое свертывание, Указанные производные белка С могут быть также с успехом использованы при лечении большого количества пациентов, страдающих гетерозиготным дефицитом белка С, проявляющимся рецидинирующим тромбофлебитом, и гомозиготным дефицитом белка С с осложнением в виде молниеносной пурпуры. Положительныее терапевтические показания активированной белок С дает при использовании для предупреждения эмболии легких и тромбофлебита, обычно обрабатываемых небольшими дозами гепарина.

Аналогично„эимогены белка С настоящего изобретения могут быть использованы для лечения эмболии, вызванной в результате образования трол1ба в периферических артериях, а именно в сбнных артериях, и которая не поддается лечению или достаточнол1у предупреждению с помощью обычно используемых средств, включая средства для подавления действия тромбоцитов, антикоагулянты для перорального введения, или их комбинации.

Зимогены изобретения могут быть также использованы при лечении острых инфарктов миокарда. поскольку после активации указанные зимогены обладают профибринолитическими свойствами. Эти эимогены могут быть введены вместе с тканевым активатором плазминогена при острой стадии инфаркта миокарда, После рассасывания обтурирующего коронарного тромба укаэанные эимогены могут вводиться еще несколько дней в целях предупреждения ooBTopllolo приступа инфаркта миокарда.

Активированный белок С используется при лечении диссеминированного внутрисосудистого свертывания, При экстенсивных клинических исследованиях пациентам с диссеминированным внутрисосудистым свертыванием (Dl С) вводили гепарин и антикоагулянты для перорального введения, однако получили при этом разочаровывающие результаты, При лечении диссеминированного внутрисосудистого свертывания активированный белок С, а также зимогены изобретения обладают значительным преимуществом по сравнению со стандартными антикоагулянта 4и.

Стандартные антикоагулирующие средства в частности варфарин, используются при лечении инвазивных злокачественных опухолей, 1Лногие опухолевые клетки продуцируют вещества, которые способствуют активации системы коагуляции, что приводит к локальному отложению фибрина. Эти отложения фибрина играют роль так называемых "гнезд", в которых злокачественные клетки могут делиться, образуя метастазы.

Однако введение варфарина или других стандартных антикоагулянтов в сочетании с более интенсивными и эффективными средствами хемотерапии не представляется 003можным, поскольку указанная терапия ведет к резкому снижению количества тромбоцитов, и тромбоцитопения.s сочетании с варфарин-терапией может вызвать у пациента серьезные осложнения в виде сильных кровотечений. Производные белка С изобретения, аналогично активированному белку С, которые, будучи более селективными, чем стандартные антикоагулянты, и имея при этом более высокий терапевтический„индекс, чем гепарин или пероральные антикоагулянты, являются относительно безопасными для пациента с тромбоцитопенией, что таким образом делает возможным лечение пациентов с инвазивным раком с помощью эффективной и интенсивной хемотерапией в сочетании с эимогеном белка

С настоящего изобретения.

Зимогены и их активированные двойники настоящего изобретения могут быть использованы для изготовления

18384! 1

5

15

40 фармацевтических композиций в соответствии со стандартной техникой, при которой зимоген белка С человека или активированный белок С смешивают с фармацевтически приемлемым носителем. Соответствующие носители и их составы, включая и другие белки человека, например, альбумин человеческой сыворотки, описаны в Remlngton

Pharmaceutical Sciens 16 th, 1980, Маск

Publishing Со., изд. изд. Osol è др., и вводятся в описание посредством ссылки. Указанные композиции будут содержать эффективное количество зимогена белка С или его активированную форму в сочетании с соответствующим количеством фармацевтИчески приемлемого носителя, Указанные композиции белка С могут быть введены

napaнтерально, ипи другим способо т, пригодным для снабжения кровотока эффективныт средством, Представленные ниже прилгеры илл.острируют способы получения характерных соединений, векTQpoU и трансформантов настоящего ттзобрете тия, однако они не ограничивают объекта изобретения.

П р*и м е р 1. Выделение гтлазтлидьт р!1

Р С-0097.

Из Северной региональной исследовательской лаборатории (Пеория, Иллинойс

61604) получали лиофилы E.coli К12 AGl/ðl(PC.-0097 (номер допуска NRRL 8-18608), Эти лиофилы сливали в пробирки, содержащие

10 мл LB-среды (10 r Бактотриптона, 5 г зкстракга бак го-дрожжей, и 10 г NaCl на 1 л рН доводили до 7,5) и ипкубировали в течение 2 ч при 32 С, за1еи «ультурь обрабатывали 50 мкг/мп ампициллином и инкубиравапи при 37 С в течение почи.

Небольшуro часть точной культуры по-.,мещали на чашки с 1 В-агаром (1 В-среда с 15 г/л бакто-агара), содержащие 50 мкг/мл ал.пициллина, длл тога, чтобы получить изолят единичной колонии F.coii K12 AGI/ði РС0097. Получетнтуто единичную колонию инокулировали в 10 мл LB-среды, содержащей

50 л1кг/мл гмпициллина, и инкубировалп, при этом энергично перемешивая, в течение ночи при 37 С. 10 мл ночной культуры инокулировали в 500 мл l Р-среды, содержащей

50 мкг/мл ампициллина, и инкубироваки при 37 С. энергично размешивая ро тех пар, пока культура не достигнет стационарной фазы, Следующая процедура является адаптированной процедурой, описанной Маниатисом и др., 1982, Molecular Cloning (Cold

Spring Harbor Laboratory).

Клетки собирали центрифугированием при 4000 r в течение 10 мин ппи 40ОС, а надосадочную жидкость сливали. Клеточный осадок промывали в 100 мл охлажденного льдом буфера STE (0,1 M NaCL. 10 мМ

Трис-НС!, рН 7,8, и 1 мМ ЭДТК). После промывания клеточный осадок ресуспендировали в 10 мл раствора 1 (50 MM глюкозы. 25 мМ трис-HCl, рН 7,0, и 10 мМ ЭДТК), содержащего 5 мг/мл лизоцима, и оставляли на 10 мин при комнатной температуре. Затем к обработанным лизоцимам клеткам добавляли 20 мл раствора 2 (0,2 í NaCl и 17, SOS) и полученный раствор слегка размешивали.

Смесь инкубировали на льду в течение 10 мин.

К смеси лизированных клеток добавляли 15 мл 5 М охлажденного льдом ацетота калия (рН 4,8) и полученный раствор размешивали. Раствор инкубировапи на льду о течение 10 мин. Раствор 5 М ацет ага калия получали путем добавления 11,5 мп ледяной уксусной кислоты к 28,5 мл воды <; 60 мл 5 M ацетата калия, полученный в результате раствор представлял собой соотношение калия к ацетату как ЗМ к 5М.

Смесь лизированных клеток ценгрифугировали в устройстве Beckman ЯЧ 27 (или в его аналоге) при 20000 об/мин в течение

20 мин при 4ОС. ДНК клеток и дебрис образовывали на дне пробирки осадок. Около 36 мл надосадочной жидкости выделяли и добавляли 0,6 обьемов изопропанола, затем размешивали и полученный раствор осгавляли на 15 минут при комнатной температуре. Плазмидную ДНК собирали путем иентрифугирования при 12000 г в течение

30 мин при комнатной температуре. Нэдосадочную жидкость сливали, ДНК-осадок промывали 70% зтанола при комнатной температуре. Этаноловую промывку сливали, а осадок осушали в вакуумном зксикаторе. Затем осадок ресуспендировали в 8 мл

ТЕ-буфера (10 мМ Tp«c-HCI, рН 8,0 и 1 мМ

ЭДТ К).

К ДНК-раствооу добавляли 8 г CsCl. На каждые.10 мл С CI-ДНК-раствора добавляли около 0,8 мл раствора бромида зтилия 10 мг/мл в воде. Конечная плотность раствора составляла около 1,55 г/M/l, а концентрация бромида этилия составляла около 600 мт:г/мл, Полученный раствор переносили на центрифужные пробирки Веск а типа 50, заполняли доверху парафиновым маслом, запаивали. и центрифугировали при 45000 об/мин в течение 24 ч при 20 С. После центрифугирования в видимом диайазоне света набл.одались две полосы ДНК. Затем снимали крышку пробирки и удаляли нижнюю полосу ДНК с помощью шприца с иглой для подкожных инъекций N. 21, которую вводили через боковую сторону центрифужной пробирки, 1838411

Этидийброл ид удаляли путем неодно, кратного экстрагированип водонасыщения

1-бутанолом. CSCI удаляли путем диалиэа против ТЕ-буфера. После экстрагирования буферным фенопом, а затем хлороформом

ДНК осаждали, промывали 70 этанолом и осушали. В резупьгате получали около 1 r ппазмиды oLPC-6097, которую хранили при

4 С в TF-буфере при концентрации около 1 мкг/мкл. 1-1э фиг.1 представлены сайт рестрикции и функциона ihHesl карта плазмиды pLPC-0097, Аналогичным образом, из соответствующих клеток-хозяев, также взятых из NRRL, были выделены плазмиды PL

РС-Q240, pL РС-Q313. и р1 РС-0329. Сайт рестрикции и функциональные карты этих плазмид представлены на приложенных к данному описанию фигурах.

Пример 2, Конструировал ие плазмиды РОТ-Q097-h, В целях продуцирования высоких уровней зимогенов белка С человека, ппазмиды

pLPC-0097, pL РС-С1248, РРС-Q313 и pL РСС1329 могут быть трансформированы непосредственно в эукариотичсских клетках/хозяевах (предпоч гительно 293клетках). При этом могут быть получены даже более высокие уровни экспрессии и секреции продукта, если ген, кодирующий мугантный зимогсн, лигировать в вектор так, чтобы экспрессия гена управлялась

ОВМТ-транскрипционной единицей.

Одним иэ таких векторов является ппаэмида РОТС, где ген дикого типа зимогена белка С человска запускается транскрипционной единицей О ВМТ; Ген дикого типа белка С может быль легко удален иэ вектора

Hell-рсстрикционном фрагменте, и на этом фрагменте в вектор может быть ввсдсн любой ген настоящего изобретения. Переваривание плазмидной ДНК рестриктазой

Hc1t-èírèáèðoDàëè путем метилирования у аденина в последовательности 5 -ОАТС-3 .

Следовательно, плазмиду pGTC получали иэ хозяйских клеток Е,соН, в когорых отсутствуег аденин-мсгилаза такал, которая кодируется г1агп-геном, продукг которого метилирует остаток аденина в последовательности 5 -ОАТС-3 . В К12 GMl48 Е,coll (1БГ(3 В-15725) отсутствует функционапьцая метипаза, и поэтому эти клетки являются подходя щими хозяевами для использования их в получении ДНК-плазмие ды РОТС, которую используют в качестве исходного материала при конструировании плаэмидных производных.

Клетки К12 GM48 Е.colt культивировали и делали компетентными для трансформации, которую осуществляли в соответствии с процедурой примера 1, используя плазми55 орадиологический набор Prep-А-Gene a соответствии с инструкциями изготовителя, Затем плаз;. иду pGT-h выделяли из К12

AG1/pGTC Е.coll (NRRL В-18593) в соответствии с процедурой, описанной в примере 1, культивировали в ОМ48, а затем выделяли ду РОТС. Трансформированные клетки помещали на чашки с l -агаром, содержащим ампициплин, и после того, как ампициллинустойчивые трансформанты К12

GM48/ÐGÒÑ Е.со11 образовывали колонии, одну из таких колоний испольэовали для получения ДНК-плазмиды РОТС согласно процедуре примера 1. Около 1 мг полученной pGTC-плазмидной ДНК суспсндировали приблизительно в 1 мп ТЕ-буфера.

Аналогично, могут быть получены плазмидные ДИК из pGT-h u pG Г-d. Плаэмида РОТ-d содержит транскрипционную единицу

GBMT, в которой огсутствует ген в Bell-сай"5 те, так, чтобы можно было легко ввести любой ген, Г1лазл ида pGT-0 содержит также мышиный ген dhtt, поэтому любой трансформанг может быть отобран ипн амплифицирован с использованием

20 метотрексат-устойчивого фенотипа. Плаэмида pGT-tl содержит GHMT-транскриптон, Bell-сайт для свободного введения целевого гена, и ген, несущий устойчивость к гидромицину. Штаммы К12 AGt Е.coil, содержа-> щие каждую из этих плазмид, были депонированы 0 ИБЯ1 18 января 1990 г, Эти штаммы доступны под номерами допуска

МНИ В-18591 (для К12 AGi/ÐÑÒ-d) 11И 3

В-18592 (дпя К12 AGi/pGT-h), и NRRL В18593 (для 1:12 AG1/pGTC). Сайт рестрикции и функциональные карты этих плаэмид представлены на фигурах, приложенных к описанию, Около 10 мкл рl РС-Q097-плаэмидной

35 ДНК, полученной иэ GM48-клеток,смешивали с 20 мкл 10,х Бс!1-рестрикционного буфера (100 мМ Трис-НС1, РН 7,4, 15 М КО, 100 мМ Mg Ctz и 10 мМ ДТТ), 20 мкл 1 мг/мл Б

А, 5 мкл, 5 мкл рестриктирующего фермента

40 ВсИ (50 Ед., по определению Bett1esd8

КезеагсЫ аЬогатогles (BRL), из которого были попучены все использованные в примерах ферменты), и t45 мк". воды. и полученные о результате Реакционные смеси инкубировапи в течение 2 ч при 37 Г, Описанные реакции рестриктирующих ферме I T00 обычно прекращали путем экстрагироьания фенолом, а затем хлороформом, после чего ДНК осаждали, промывали зтано1 ом и ресуспендировали в TF-буфере. Перева ренн ые ДН К затем подвергали э:ектрофорсзу на 17 . агароэном геле, и

1400 п.о. — фрагмент рестрикции, содержащий мутантный ген, очищали, используя би1838411

38 в соответствии с процедурой, описанной в примере 2. После чего pGT-h плазмидную

ДНК переваривали рестриктирующим ферментом, как указано выше, и большой фрагмент выделяли и очищали. Этот фрагмент вектора доводили до 90 мкл обьема ТЕ-буфером (рН 8.0) фрагмент вектора доводили да 9 мкл объема ТВ-буфером (рН 8.0), а затем добавляли 10 мл (0,05 Ед.). кишечной щелочной фосфатазы теленка в целях дефосфорилирования концов вектора. Смесь инкубировали в течение 30 мин при З7 С, затем добавляли 10 мкл 500 мМ EGTA u реакцию инкубировали в течение 45 мин

° при 65 С для инактивации фермента. После этого реакцию экстрагировали смесью фенола и хлороформа, осаждали этанолом, промйвали, и ресуспендировали в 20 мкл .воды.

Затем около 7 мкл (10 кг) остова Bell-переваренного вектора смешивали приблизительно с 1 мкл (100 кг) около 1400 п.о, Bcl I-рестрикцион ного фрагмента плазмиды

pL PC-0097, 1 мкл 10 х лигазнога буфера (0,5

Трис-HCI, рН 7,6, 100 мМ Mg CI2, 100 мМ ДТТ и 500 мк/мл BSA) и 1 мкл ДНК-лигазы Т4.

После чего реакционную смесь лигирования инкубировали в течение 12-16 часов при

16ОС. Реакция лигирования приводит к получению плазмид, содержащих мутантный, гей зимогена, ориентированный для транскрипции ат GBMT-транскрипционной единицы, или к получению плазмид, в которых ген лигирован в противоположном направлении. Те плазмиды, которые содержат ген в подходящей для транскрипции ориентации, обозначали плазмидой pGT-0097-h.

Замороженные компетентные клетки

Е,coll К12 Аб! получали от Strategene, 3770. Tansey Roucl, Сан Диегс, Калифорния 92121.

Около 5 мкл реакционной смеси лигиравания смешивали с 100 мкл аликвотай компетентных клеток, после чего смесь клеток и

ДНК инкуб : ровали на льду в течение I ч, затем подвергали тепловому шоку при 42 С в течение 45 с, и охлаждали на льду приблизительно в течение 2 мин. Смесь клеток и

ДНК разбавляли 1,0 мл ОС-среды в пробирке Falcon 2059 и инкубировали в течение 1 часа при 37 С. 100-мкл аликвату помещали на LB-агаровые чашки, содержащие ампициллин и инкубировали при 37 С до тех пор. пака не появлялись колонии.

Полученные колонии культивировали отдельно, а плазмидную ДНК отдельных колоний исследовали с помощью рестрикционного анализа. Выделение плаэмидной

ДИК осуществляли в небольших количествах в соответствии с процедурой примера 1, на CsCI-стадию не проводили. до тех пор, 5

20 пока соответствующие трансформанты К12

AG I/pGT-0097-I Е.соИ не будут идентифицированы. После этого осуществляли получение высакоочищенных плазмид в большом количестве. В соответствии с указаниями примеров 1 и 2, любой из мутантных генов эимогена может быть легко клонирован в любой иэ GBMT-векторов с образованием плазмид р6Т-0097-h, pGT-Q248-h, pGTQ313-h u pGT-CI329-11.

Пример 3. Конструирование трансформантов аденовирус-трансформированной линии клеток почки эмбриона человека

293 и аденовирус-трансформированной линии клеток сирийского хомячка АУ12 с испол ьзованием плазмиды pGT-0097-I.

Линия клеток почки человеческого эмбриона 293 была взята из Американской коллекции типовых культур пад номером допуска ATCC CRL 1573. Линия аденовирустрансформированных клеток сирийского хомячка АУ12 также была взята из ATCC N.

АТСС CPL 9595. Процедура трансформации клеток 293, как клеток-хозяев описана ниже, 25 однако, указанная процедура в основном, применима также клиниям наиболее типичных эукариотических клеток, включая клетки линии АУ12, и к векторам экспрессии настоящего изобретения, 30 Клетки 293 были получены из ATCC (под номером СР1 1573) в 25-мм -колбе, содер2 жащей сплошной монослой около 5,5 х 10 клеток в минимальной поддерживающей среде Игла (Gibco) с 10% термо-инактивиро35 ванной лошадиной сывороткой, Колбу инкубировали при 37 С, а среду меняли два раза в неделю. Среда состояла из DMEM (Gibco), дополненной 0% околоплодной сывороткой,. теленка, 50 мкг/мл гентамицина, и 10

40 мкг/мл витал1ина К1, фитонадиааа АкваМефитон R Merck Sharp В Dohme, Merck В Со., Jnc., West Point, РА, 19486). Клетки суб культивировали путем удаления среды, промывания сбалансированным голевым

45 раствором Хэнкса (Gibco), добавления в течение 1 — 2 мин 0,25% трипсина (содержащего 0,2 г/л ЭДТК), промывания свежей средой и диспергирования в новых колбах при отношении субкультивации 1:5 или 1:10.

50 За день до трансформации клетки засевали при 0,7 х 10 клеток на 100-MM чашку.

Стерильную, осажденную этанолом плазмидную ДНК, растворенную в воде, использовали для получения 2 х

55 ДНК-CaCI2-раствора. содержащего 25 мкг/мл трансформирующей плазмидной

ДНК и 250 мМ CaClz 2 х HBSS (сбалансированный солевой раствор Хэнкса) содержал

280 мМ NaCI, 50 мМ Нере и 1,5 мМ фосфата натрия с рН доведенным до 7,05 — 7,15. Рас39

1838411

40 твор 2 х ДНК-СаС!г по капле добавляли к сто неомицина также используют G418) и равному объему стерильного 2 х HBSS. 1-мл отбор на 6418-устойчивые колонии осущестерильную пластиковую пипетку с ватной ствляли, в основном всоответствии с процепробкой вставляли в смесительную пробир- дурой отбора для гидромицин-устойчивых ку, содержащую 2 х HBSS и путем продувки 5 клеток, за исключением того, что G418 довводили пузырьки, добавляя при этом ДНК. бавляли до конечной концентрации 400

После этого раствор оставляли на 30 — 45 мин мкг/мл, при комнатной температуре без перемеши- Использование гена гидрофолат-редуквания для образования преципитата фосфат тазы (dhfr) или производного dhfr-гена, некальция-ДНК. 10 сущего устойчивость к метотрексату

Затем полученный преципитат смеши- (dhfr-mtx), в качестве селектируемаго маркевали путем мягкого пипетирования пласти- радля введения гена или плазмиды влинию ковой пипеткой и 1 мл (на чашку) клеток с дефицитом dhfr последующее испреципитата добавляли непосредственно к пользование метотрексата для амплифици10 мл среды для выращивания, которая по- 15 рования числа копий плазмиды известны. крывает клетки-реципиента, После 4-х часо- Клетки 293 являются dhfr - положительнывого инкубирования при 37 С среду ми, поэтому 293-трансформанты, включаюзаменяли свежей средой . а клетки оставля- щие в себя плазмиды, содержащие ген 9Ыг, ли для инкубации в течение еще 72 ч, а затем не отбираются лишь на основе dhfr-положиподавали селекционное давление, Для 20 тельного фенотипа, который способен к роплазмид, которые не содержат селектируе- сту в среде, где отсутствуют гипоксантин и мый маркер, функционирующий в эукарио- тимин. Линия клеток, в которых отсутствует тических клетках, трансформацию функциональный ген dhfr i которыеявляютосуществляют с использованием смеси ся трансформированными dhfr-содержащиплазмид: вектор экспрессии изобретения, в 25 ми плазмидами, могут быть отобраны на

+ котором отсутствует селектируемый мар- основе. dhfr -фенотипа. И хотя процедура кер, и вектор экспрессии, который содержит использования 9Иг в качестве сслектируеселектируемый маркер, функционирующий мого и амплифицируемого маркера при в эукариотических клетках. Для использова- dhfr-продуцировании клеток еще недостания в такой системе совместной трансфор-. 30 точно хорошо изучена, однако, в специальмации имеется ряд подходящих векторов, ной литературе имеются с0идетельства, что например, плазмиды pSY2-dhfr (ATCC оЫгможет быть использован в качестве се3714G) pSY2-пео (АТСС 37149), pSY2-gpt лектируемого маркера и для амплификации (АТСС 37145) и pSY2-hyg (NRRL В-18039).. гена при dhfr-продуцировании клеток, ИзоПлаэмида pSY2-hyg несетвекторустойчиво- 35 бретение не ограничивается селектируести к гидромицину В для эукариотических мым марке(ом, используемым в векторах клеток-хозяев. Указанная техника совмест- экспрессии. Кроме того, могут быть испольной трансформации позволяет осуществ- зованы амплифицируемые маркеры, такие, лять отбор клеток, содержащих плачмиду с как гены металлотионеина, гены аденозинселектируемым маркером. Затем эти клетки 40 деаминазы, или члены семейства множестидентифицировали на содержание обеих вэ генов устойчивости, представителем трансформирующих плазмид, Изобретение которого является, например, ге» P-гликоптакже включает векторы экспрессии, содер- ротеина. жащие селектируемый маркер для эукарио- В результате трансформации линий клетических клеток, и для них не требуется 45 ток 293 с использованием плазмид pGTиспользования совместной трансформа- 0097-h, pGT-0248-h, pGT-Q313-h u ции. pGT-0329-h получали ряд трансформантов.

Для клеток, трансфицированных плаз- анализ этих трансформантов описан и примидами, содержащими ген, несущий устой- мере 4. чивость к гидромицину, такими, как 50 Пример 4. Отбор клеток, секретируплазмида pGT-0097-h, к среде для культиви- ющих мутанты зимогена человеческого белрования добавляли гидромицин В до пол- ка С. учения конечной концентрации около 200 Гидромицин-устойчивые трансформанмкг/мл. Затем клетки инкубировали при ты, полученные в примере 3, культивирова37ОС в течение 2 — 4 недель, меняя среду с 55 ли на 100 мм чашках с тканевой культурой г интервалами 3 — 4 дня, Полученные гидроми- при плотности в несколько сотен клеточных цин-устойчивые колонии переносили в от- клонов на чашку стканевой культурой. Средельные колбы с культурой в целях дудекантировали, а клетки дважды промыопределения их свойств. Плаэмида pSY2- вали 5-мл аликвотами сбалансированного пео несет. устойчивость к неомицину (вме- солевого раствора Хэнкса (Gibco). Раствор

18384 1| 1

42 стерильного 0,45% агара(агароза Сигма типа 4, каталожный номер А3643, Сигма Кемикал Компани, Р.О,Вох 14508, Сент-Луис, М0

63178) получали путем смешивания 1 мл

1,8%-но агара 47 С с 3 мл модифицированной по способу Дульбекко среды Игла (DME) (Gibco) (37 С), и 2 мл полученного 0,45%-ного агарового раствора наслаивали понерх клеток.

Нитроцеллюлозные фильтры (Schleicher и Schuell, Лпс., Keene, JH 03431) кипятили, а затем автоклавировали 2 ч в целях удаления смачиваемого агента, который является токсичным для клеток, После чего фильтры помещали поверх слоя агара, ит|осле удаления пузырьков воздуха чашки инкубирооали при 37 С в течение 1 — 3 ч. Затем фильтры, которые были предварительно помечены для указания первона |альной ориентации их на чашках о целях обле|чения последующей идентификации колоний, сии|лали и помещали в PBS (50 мМ Трис-HCI, рН 7,2, и 150 мМ NaCI), Для поддержания жизнеспособности, клеток на чашках во время аналиэоо на фильтрах, клетки покрывали 8 мл смеси, содержащей 2 мл 1,8%-ного агара (47 С), 2 мл

ДМЕ-солеоого раствора (37 С) и 4 мл ДМЕсолевого раствора, содержащего 20%-ной околоплодной сыворотки теленка (37 С). Затем клетки помещали в инкубатор при 37 С, Все промывки и реакции. проводимые на фильтрах, осуществляли, располагая фильтры на качающейся платформе. Сначала фильтры блокировали путем инкубации при комнатной температуре в 5%-ном молоке в PBS. Затем фильтры промывали (5 мин на промывку) в PBS четыре раза, После этого к фильтрам добавляли 10 мкгlмл биотинилирооанного козьего поликлонального антитела против белка С человека в 2,5%ном альбумине бычьей сыворотки в количествах, достаточных для покрытия фильтра, и проводили инкубацию при 37 С в течение

1 ч.

Очистка белка С для его последующего использования в целях получения антитела против белка С, может быть осуществлена способом, описанным Kisi ei, 1979, T.Clin, Invest. 64, 761. Поликлональное антитело может быть получено способом, описанным в Structural Concepts in Immunology and

Immunochemistry, Е.А. Kabat, опубл. в 1968

Холтом, Ринехартом и Уинстоном., Моноклональное антитело, которое также пригодно для использования в анализе, может быть получено способом, раскрытым в работе Kohler и Milstein, 1975, Nature 256:495, или раскрытым в патенте CLUA ¹ 4696895, публ. EPO ¹ 205046, Laurell и др„1985, 10 на в соответствии с инструкциями, приложенными к набору Вокстатасин (Вектор лабораториез). Фильтры инкубировали

15 с НРР-коныогирооанным аоидлном 0 в те20

40

55

FEB 191 (1), Sutukl и др., 1985, T. Blochem

97:127 — 138, и EPO- публ, ¹ 138222. Авидин

D и биотинилированную пероксидаэу хрена (HRP), используемого в анализе, получали в

Векстаотаин-M наборе (Вектор лабораториеэ, Инк., 30 Ингоулд Роуд, Берлингем, СА

94010), Биотин был также получен из Вектор-лабораторий. Инк.

Фильтры четыре раза промывали PBS при 4 С. Затем получали и добавляли авидин 0 и биотилированную пероксидаэу хречение 1 ч при 4 С (более длительное время инкубирооания, т.е. в течение ночи, может быть использовано при секре.плрооании ||ебольших количеств белка), после чего фильтры четыре раза промывали PHS при 40С, Для прояоления на фильтрах окраски индикатора, к 50 мл PBS и 30 мкл 30% Hz02 добавляли около 30 мг НРР-окрашивающего реагента (4-хлора-1-нафтол, Сигма), растворенного о охлажденном льдом 00%-ом метаноле. Эту смесь добавляли к нитроцеллюлозным фильтрам, которые инкубирооали при комнатной температуре до тех пор, пока не появится окраска. Колонии, секретирующие наибольшее количесгво зимогена человеческого белка С изобретения, будут отмечаться на фильтрах не только более ранним появлением окраски, но также и более темными пятнами нз филыре.

После появления окраски фильтры перегруппировыва|от с первоначальными чашками для определения того, какие колонии с какими пятнами ассоциируются на фильтре. Колонии, секретирующие наибольшее количество зимогена белка С изобретения, отбирают и используют для получения эимогена.

При этом следует отметить, что описанный выше анализ просто иллюстрирует способ идентификации оысокосекретирующих линий клеток, В способе изобретения может быть с успехом использован целый ряд методик анализа. Например, может быть использована реакция с двойным антителом, в которой биотинилированное козье антитело против белка С заменяют козьим антителом г|ротив белка С lgG u биотинилированным антителом против козьего IgG.

Зимогенные мутанты могут быть очищены от клеточных культур. Из клеток, экспрессирующих рекомбинантный продукт, удаляют надосадочную жидкость и проводят очистку на колонке Farmacia Fastlow43

1838411

SER GLY THH PRO ALA PRO LEU ASP SEH VAL РНЕ SER SER SER GLU ARG

ALA !ПБ GT-И VAL LEU ARG ILE ARG 1ЛБ ARG ALA ASN SER РНЕ LEU GLU

GLU LEU ARG И1Б SEB SER LEU GLU ARG GLU CYS ILE GLU GLU ILE CYS

ЛБР РНЕ GLU GLU ALA LYS GLU II.Е РНЕ О1Л ASN VAL ЛБР ASP ТЦВ LEU

Л1Л РНЕ TRP БЕВ 1ЛБ ПХБ VAI, ЛБР GLY ЛБР 01?? CYS LKU VAL LEU PPO

LEU О1Д И1Б PRO CYS ALA БЕВ riU CYS CYS GI Y HIS GIЛ ТНВ CYS ILE

ЛБР GLY П.Е GLY SEH РНЕ БЕВ CYS ЛБР CYS AHG SER GLY TRP GLU GLY

ARG РИЕ CYS ОЩ ARG GLU VAL SER Pl?E LEU Hi CYS SER LEU ASP ASN

GLY GLY CYS TlIH HIS TYR CYS LKU CLU GLU ЧЛ1 О1Л TRP ЛВО ARG CYS

SER CYS hLA PRO GLY TYR LYS LEU GLY ASP ASP LEU LEU GLN С"S HIS

РВО ALA VAL LYS РИЕ PRO CYS GI,Y AHG PRO ТВР LYS ЛВС ?ЖТ GLU LYS

LYS AHG SER И1Б LEU LYS ARG ASP T)?R GLU ASP GLN GLU ASP GLN VAL

ЛБР РВО ЛВС 1Е?? IIX ASP GLY LYS ??ET T?IR ARG ARG GLY ASP SER PRO

TRP GL3 VAL VAL LKU LEU ASP SEH LYS LYS LYS LEU ALA CYS GLY А. .А

VAL LEU ILE HIS PRO SER ТВР ЧЛ1 LEU Т?П ALA Л?.Л liIS CYS NET ASP

GLU SEH LYS LYS LEU IZU VAL ARG LEU GLY GLU A hSP LEU ARG ARG

TRP GLU LYS TRP GLU LEU ASP LEU ASP ILE LYS 01Л VAL РНЕ VAL И1Б

PHO Hg TYH SER LYS SER ТНВ ТНВ ASP АБН ЛБР ILE ALA LEU LEU Н1Б

LEU ALA О1И PRO ALA ТНВ LEU SER GLN ТНВ ILE ЧАХ PRO ILE CYS LEU

Трис-НО (рН 7,4), 0,15 M ?чаС?, 5 мМ ЗДТК и

4 мМ бензамидина, Супернатант культуры доводили до рН 7,4 путем добавления Трис НС? (рН 8.0), и вводили 5 мМ ЭДТК и 4 мМ бензамидина. Затем супернатант наносили на смолу в колонке и промывали 3 х объемами колонки Трис-HC? (оН 7,4), 0,15 M NaCl, 5 мМ ЭДТК, а затем 3-мя обьемами колонки

20 мМтрис- lCI,0,15 M NaC?, и 1 мМ бензамидина. Рекомбинантный продукт злюировали с колонки, используя в качестве элюента буфер, содержащий 10 мМ CaClz в

20 мМ Трис-HCI (рН 7,4), 0.15 М NaCl, 5 мМ бензамидина.

Специфическую активность продукта определяли с помощью процедуры, описанной G rinetl и др„1987, B! o techno alogy 5:11891192, следующим образом, Концентрированный и диализоианный про- дукт элюата колонки сначала активировали иммобилизованным комплексом тромбинtfET TRP О1?(LEU ТНВ SER LEU LEU тромбомодулин, затем измеряли амидолитическую активность продукта путем гидролиза трипептидного субстрата S-2366 (полученного из лаб. Не!епа), Лнтикоагулирующую активность определяли путем продления периода действия частично активированного тромбопластина с использованием реагентов от лаборатории ?elena.

Формула изобретения

1. Способ получения рекомбинантной плазмидной ДНК, кодир ющей аминокислотную последовательность со свойствами зимогенной формы белка.С, предусматривающий конструирование вектора, включающего область репликации, селективный маркер, промотор, нуклеотидную последовательность, кодирующую белок С, о т л ич а ю шийся тем, что нуклеотидная последовательность кодирует следующую аминокислотну о последовательность:

LEU РНЕ VAL Л1.А Т?1В ТВГ CLY ILE

45 1838411 46

PRO ASP SER GLY LEU ALA GLU ARG GLU LEU ASN GLN ALA GLY GLN GLU THR LEU VAL THR GLY TRP GLX TYR HIS SER SER ARQ GLU LYS GLU ЛХ.Л

LYS ARO Вз ARG TIIR РНЕ VAL LEU ASN РНЕ ILE LYS ILE PRO VAL VAL PRO HIS Rg GIU CYS SER GLU 7Л1 ИЕТ SER ASN ИЕТ VAL SER GLU ASN . I

NET LEU CYS ALA GLY ПЕ LEU GLY ASP ARG GLN ASP ALA CYS GLU GLY

ASP SER GLY GLY PRO NET VAL ALA SER PHE HIS GLY THR TRP PHE LEU

VAL GLX LEU VAL SER TRP GLY СЫ GLY CYS GLY LED LKU HIS ASN TYR

GLY 7/й TYR Т2В И5 VAL SER ARG ТИ LEU-ASP TRP ILK HIS GLY HIS

SKR GLY Т2Б PR0 ALA PRO LEU ASP SER VAL РНЕ SER SER SER GLU ARG

ALA HIS СИ ЧЛТ LEU ARG ILE ARG LYS ARG ALA ASN SER РНЕ LEU GLU

GLU LEU ARG Нiа SER SER LEU GLU ARG GLU CYS ILE GLU GLU .ILE CYS

ASP РНЕ GLU GLU ALA LYS GLU ILE Р2Б GLN ASN VAL ASP ASP ТНВ LEU

ALA Р2Е TRP SER LYS ШЗ VAL ASP СЛ ASP GLN CYS LEU VAL LEU PRO

LKU GLU HIS PRO CYS

ASP GLY ILE GLY SER

ALA SER LEU CYS CYS GLY HIS GLY T|1R CYS П.Е

PHE SER CYS ASP CYS ARG БЕЕ CLY TRP GLU GLY

ABG PIE CYS GLN ЛНО GLU VAL ВЕй РНЕ LEU Г1 CYS SER LEU ASP ASN

GLY GLY CYS ТНН 2ПБ TYR CYS LEU GLU GLU VAL GLY TRP ARG ARG CYS

TYR LYS LEU GLY ASP ASP LEU LEU GLN CYS 2ПБ

PR0 CYS GLY ARG PR0 TRP LYS ARG NET GLu LYS

SER CYS ALA PRO GLY

PRO ALA VAL LYS РПЕ

IYS ARG SER 2ПБ LEU

ASP PH0 ARG LEU ILE

LYS ARG ASP T2IR GLU ASP GLN СЫ ASP GLN ЧЫ

ASP GLY. LYS ИЕТ Т2В ABG ARG GLY ASP SER PRO

ПЕ ARG ЛЯР LYS GLU ALA PRO GLN LYS SER TRP ALA PRO-C002C где Ri — GLN>Rz- ASN, йз — ASN; Рд — ASN, 2. Способ получения зимогеннойформы полученные в результате сайт специфиче- белка С человека, включающий трансфорского мутагенеза фрагментов ДНК плазмиды мацию эукариотической хозлйской клетки рН РС-0097 или pGT-Q097-h, или R> — ASN, рекомбинантным вектором ДНК, содериаRz — GLN, Rz — ASN, Rq — ASN, полученные в 5 щим нуклеотидную последовательность, корезультате сайт специфического мутагенеза дирующу о аминокислотную фрагментов ДНК плазмиды pLPC-0248, или последовательность полипептида со свайpGT-Q248-h, или B1 — АЯН, Rz — ASN, Вз — 6 Я, ствами белка С человека, промотор, стиму R4 ASM, полученные в результате сайтспеци- лирующий экспрессию ДН К, фического мутагенеза фрагментов ДНК плаз- 20 культивирование трансформированных клемиды р РС-0313 или плазмиды pGT-Q313-h, ток, выделение целевого продукта из кульили R3 — ASN, Rz — ASN, Рз — А8й, R4 — GLN, туры трансформированных клеток, о т л и- ч полученные л результате сайт специфического а ю шийся - тем, что аминокислотнал мугагенеза фрагментов ДНК плазмиды pLPO- последовательность имеет следующий

0329 или плазмиды pGT-Q329-h, $5 вид:

ИЕТ TRP GLN LEU TIIR SER LEU LEU LEU РЕЯ VAL ALA Т2Б TRP GLY LE

1838411

TRP. GLN VAL VAL LEU LEU ASP SER LYS LYS LYS LEU ALA CYS GLY А1Л

ЧЯ LEU ILE HIS PRO SER TRP ЧЛ? LEU THR ALA ALA HIS CYS НЕТ ASP GLU ЗЕЙ LYS LYS LEU LEU VAL ARG LEU GLY GLU TYR ASP LEU ARG ARG

TRP GLU LYS TRP GLU LEU ASP LEU ASP ILE LYS GLU VAL РНЕ VAL HIS

PRO Rg TYR SER LYS SER НВ ТНВ ASP ASN Л$Р ILE ALA LEU LEU HIS

LEU ALA GLN PRO ALA THR LEU SER CLN ТИВ ILE VAL PRO П.Е CYS LEU

PRO ASP SER GLY LEU ALA GLU ARG GLU LEU ASN GLN ALA GLY GLN GLU THR LEU VAL THR GLY TRP GLY TYR HIS SER SER ARG GLU LYS GLU ALA

LYS ARG Кз ARG THR PHE VAL LEU ASN PHE ПЕ LYS ПЕ PRO VAL VAL

PRO HIS R4 GLU CYS SER GLU VAL ИЕТ SER ASN МЕТ ЧЛ? SER GLU ASN

ИЕТ LEU CYS ALA GLY ILE LEU GLY ASP ARG GLN ASP ALA CXS GLU GLY

ASP SER GLY GLY PRO ИЕТ VAL ALA SER РНЕ HIS GLY THR TRP РНЕ LEU

VAL GLY LEU VAL SER TRP GLY GLlI GLY CYS GLY LEU LEU HIS ASN TYR

GLY ЧИ TYR THR LYS VAL SER ARG TYR LEU ASP TRP ILE HIS GLY )П$

ILE ARG ASP AS GLU ALA PRO GIrN LYS SER TRP ALA PRO-СООН где R — GLN, Rz — ASN, Из — ASN, R4 — ASN или R)-ASN В2 GLN, йз — ASN R4 ASN, или Й1 ASN, 82 ASN, Йз GLN, R4 ASN, или R1 — ASN, Rz — ASN, Вз — ASN, R4 — GLN. а трансформированную клетку выбирают из 5 группы следующих . клеток: 293/pL

Р$-0097, . 293/pL PC-Q248, 293/pLPCQ313, 293/pLPC-0329, 293/pGT-0097-h, 293/pGT-Q248-h, 293/р6Т-0313-h u

293/pGT-0329-h.

Таблица1

Трехбуквенная аббревиат а

Аминокислотный остаОднобуквенная аббревиат а ток

Фенилаланин

Лейцин

Изолейцин .

Метионин

Валин

Серин

Пролин

Треонин

Аланин

Тирозин

Гистидин

Глутамин

Аспарагин

Лизин

Аспарагиновая кислота

Глутаминовая кислота

Цистеин

Три,птофан

Агринин

Гли ин

Е

С

N!

РНЕ

LSU

ПЕ

МЕТ

VAI

SEP . PRO

THR

ALA

TYP и

ASN

LYS

ASP

И.U

CYS

TRP

APG

GLX

1

M

S

Т

А

Н

N

К

1838411

Таблица 2 лица

Исто

Клетка-хо схождение ание клеток патенте

393133

ЕЛ С-MKz npou рее, чем

АТСС

АТСС №

АТСС № СС1 61

3Т3 ибробласты висим. мыши итайс. хомячСНО-К1 ка

АТСС № СС1 2

ЯТСС № СС1 155 ечный эпитеl4eLB лий

БРМ1822

Н411ЕС ма человека

АТСС № СВ(1600 ома крысы

ышиный бробласт ет. чел.

С1271

H S-Su l ta оцитомы зяйск. клетки, могут быть генерированы из этого хозяина, ВН К-21 о итеныша хоячка

*Американская коллекция типовых культур, 12301 Парклаун Драйв, Рокьилль, Мэриленд

20852-1776.

Фо

* Определяли путем деления количества активированного белка С, определенного с помощью АРТТ-анализа на количество, определенное с помощью амидолитического анализа, ** Не определяли. ** Относительная амидогитич. активность по сравнению с нативным АРС, умноженная на относительную антикоагулирующую активндсть.

HepG-2

CV-1 исхо

Ll С-МК бластома чел. фр. зел, мартышки

1акак-резуза

*АТСС №

АТСС №

АТСС №

АТСС №

Производн. CHO-К1, такие, как dhfr — производ. DXB11, могут быть генерированы из этого хозяина

Секретирование легкой цепи 10G Л-типа

Производные, такие, как 8-азагуанин-устойчивые FAZA xo1838411

52

Таблица 5

Функциональная активность (ед,/мг) l1 р и м е ч э н и е. Первая цифра в скобках означает кратность увеличения активности по сравнения с НРС, происход, из плазмы. Число независимых проб (n) определяли с удвоением или утроением.

Таблица 6

EcoRI

Bell

StulIPvuI t Bell Hin

:рLPC-QG97

Фиг. 7

1838411

EcoRI

St

EcaRl

St0i/PvulI

Фиг. З nLPC-ОЗФЗ f 8384 И

EcoRI

pLPC-Q329

EcoRl

pGTC

"* салий 5

1838411

Н(пйИ

Hlndl flВоИ!

Hlndl l

Вагп

Н(пдШ Bell

scil фу

g ill

Hindlll

EcoRI/AatlI

egiIi

hatI l

Hindili

pQ а 1 Риг, /

Составитель Г. Лукина

Техред M. Моргентал Корректор О, Кравцова

Редактор

Производственно-издательский комбинат "Патент", r, Ужгород. Ул.Гагарина, 101

Заказ 2905 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5