Способ получения белков, обладающих сродством к опиатным рецепторам

 

„„RU„„ 2000059 С

Комитет Российской Федерации по патентам и товарным знакам ЮОЮ36

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ """ . инм ьц, ЛИОТАР, К ПАТЕНТУ

О

СР

О

О

Ql (21) 5014051/13 (22) 31.10.91 (46) 07.09.93. Бюл, М 33-36 (71) Всесоюзная ассоциация "Фармбиопресс" (72) Наймытенко Е.П., Быков В.А.. Крашенинников О.А„Наймытенко К.Е. (73) Крашенинников О,А. (56) Эндорфины,/Под ред. Э.Коста, M,Òðàбуки. М.: Мир, 1981.

Хухо Ф. Нейрохимия. Основы и принципы. M,: Мир, 1990.

Бахарев В.Д. Клиническая нейрофизиология регуляторных пептидов. Свердловск:

Издательство Уральского университета, 1989.

Изобретение относится к биотехнологии и касается получения белков животного происхождения, обладающих биологической активность, Полученные предлагаемым способом белковые препараты могут быть использованы в медико-биологических исследованиях и являются потенциальными лекарственными средствами.

Фундаментальными исследованиями заявителя было установлено, что кислоторастворимая фракция белков моллозива обладает сродством ко всем известным клеточным опиатным рецепторам, а при введении в живой организм эти белки вызывают эффекты, аналогичные эффектам природных соединений опиатной природы, в первую очередь анальгезирующий, снотворный, психотропный, Сущность предложенного способа состоит в том, что из молозива извлекают кис(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЛКОВ. ОБЛАДАЮЩИХ СРОДСТВОМ К ОПИАТНЫМ РЕЦЕПТОРАМ (57) Использование . в области биотехнологии при получении белков молозива, обладающих биологической активностью.

Сущность изобретения: получают фракцию кислоторастворимых белков путем экстрагирования молозива человека или животных подкисленной водой или подкисленными органическими растворителями. Для подкисления используют соляную кислоту.

Фракцию кислоторастворимых белков сушат, перед сушкой или после ее подвергают стерилизации. 3 з.п.ф-лы. лоторастворимую фракцию белков и освобождают ее от посторонних примесей.

Исходным сырьем для получения целевого продукта может служить молозиво млекопитающих или человека (молоко женщин), но предпочтительно использовать молозива крупного рогатого скота, как более доступного в требуемых количествах.

Кислоторастворимую фракцию белков молозива можно извлекать любыми известными приемами. но наиболее рационально экстрагировать ее подкисленной водой или подкисленными органическими растворителями. Степень кислотности экстрагента не имеет решающего значения и обычно составляет 0,25 — 1,0 н. Природа кислоты также не оказывает особого влияния на эффективность процесса, но использование соляной кислоты представляется наиболее ударным .

2000059

Для освобождения кислоторастворастворимой фракции от посторонних примесей осадки отделяют центрифугированием, надосадочную жидкость подвергают фильтрации для избавления от жиров. Могут применяться и иные методы дополнительной очистки, Из кислого экстракта белки могут быть осаждены. например. органическим растворителем для повышения степени очистки.

Осажденные кислоторастворимые белки могут быть повторно растворены в кислом растворе и подвергнуты дополнительному центрифугированию.

Фракцию освобожденных от примесей кислоторастворимых белков для дальнейшего удобства работы можно высушить, например, путем лиофилизации, Поскольку целевой продукт может быть использован для парэнтерального введения после или до высушивания возможен этап его стерилизации.

Остаточная влажность высушенного препарата составляет 3 — 5 Д, препарат полностью растворяется в воде.

Полученный препарат дает see характерные реакции на белок, его мол.м. составляет от 17,5 кДа до 70 кДа. При дискэлектрофорезе в полиакриламидном геле установлено наличие нескольких индивидуальных белков, Характер наблюдаемой биологической активности полученного препарата обусловлен, по-видимому, суммарным присутствием индивидуальных белков, Для корректировки биологических эффектов допустимо фракционирование целевого продукта, Сродство полученных предложенным способом белков к опиатным рецепторам было доказано классическим налоксоновым методом (1), Теоретически и практически доказано, что биологический эффект природных соединений опиатной природы возникает в результате связывания опиатных соединений со специфическими опиоидными клеточными рецепторами нескольких типов.

Известно также, что антагонист опиоидных соединений налоксон имеет большее сродство к опиатным рецепторам и поэтому вытесняет опиатные соединения с их поверхности, тем самым "отменяя" биологические эффекты, обусловленные опиатами.

Многочисленными экспериментами показано, что полученные предложенным способом белки при введении в организм экспериментального животного вызывают клиническую картину. соответствующую последствиям введения природных опиатов.

Последующее введение налоксона полностью устраняет эффекты биологически активных белков.

Классическая реакция экспериментальных животных на налоксон и общая клиническая каргина воздействия белков, полученных предложенным способом, однозначно подтверждают специфическое взаимодейггвие этих белков с опиатными рецепторами.

Анализ патентной и научно-технической литературы показал, что сведений об оригинальной способности белков кислоторастворимой фракции молозива млекопитающих связываться с опиатными клеточными рецепторами не имеется. Заявителем впервые установлена способность нового класса соединений — белков связываться с опиатными рецепторами и вызывать биологические эффекты, воспроизводящие эффекты природных опиатов. Установленная заявителем закономерность априорно не вытекает из известного уровня знаний.

До настоящего времени был известен лишь один класс соединений — низшие пептиды, которые связывались с опиатными рецепторами. Наиболее известны и доступны лишь два нейропептида — энкефалин и эндарфин, дающие эффекты, сходные с эффектами опиатов (2, 3).

Способы получения этих нейропептидов крайне сложны, а эффект воздействия энкефалина и эндорфина кратковременен.

Предлагаемый способ получения белков. обладающих сродством к опиатным рецепторам, несравненно проще способа получения нейропептидов с аналогичной функцией, а получаемые предложенным способом белки вызывают более разносторонний и более длительный эффект.

Разработанный способ открывает по крайней мере путь решения одной из наиболее актуальных проблем — безопасного длительного обезболивания.

Пример 1, Свежее молозиво коров первого удоя после отела в количестве 3 л смешивают с 3 л 0,5 н. водного раствора соляной кислоты и выдерживают в течение

60 мин, Затем дополнительно вносят 1,5 л

0,25 н.водного раствора соляной кислоты и при периодическом перемешивании оставляют на 24 ч. После этапа экстракции смесь центрифугируют в течение 60 мин при 5 тыс. об/мин. Надосадочную жидкость отстаивают еще 24 ч и фильтруют через 3 слоя марли для отделения жира. а затем через бумажный и ватный фильтр. Фильтрат помещают на 24 ч в холодильный шкаф (4"С) и затем вновь фильтрует через 8-10 слоев фильтровальнои бумаги под вакуумом К осветлен2000059

55 ному фильтрагу постепенно поиливают 10 объемов охлажденного ацетона и оставляют для отстоя взвеси. Осадок собирают на двойном бумажном фильтре, дважды промывают холодным ацетоном, снимают с фильтра, переносят в кристаллизатор и помещают в вакуумный сушильный шкаф.

Сушку осуществляют при температуре 37—

38 С в течение 4 ч.

Полученный сухой продукт измельчают до порошкообразного состояния и готовят его 10 -ный раствор в 0,1 М растворе лимонной кислоты. Для этого навеску продук та вносят в раствор кислоты и периодически перемешивают. После набухания белков, что наблюдается через 2 ч, сосуд помещаюг в водяную баню, постепенно нагревают до

45 С и выдерживают 50 мин до просветления жидкости, После растворения белков и просветления раствора его центрифугируют в течение

40 мин при 5 тыс. o6/мин.

Надосадочную жидкость подвергают осветляющей, а затем и стерилизующей фильтрации через пластинчатые фильтры.

Раствор разливают по 3 мл в стерильные стеклянные ампулы емкостью 10 мл, эамораживают на протяжении 24 ч до температуры -50 С и подвергают сублимационноу высушиванию в течение 72 ч при начальной температуре -35 С до конечной температуры 25 С.

Ампулы заполняют азотом и запаивают.

Каждая ампула содержит 300 мг целевого продукта, а всего было получено 20.4 г препарата.

Для получения рабочего раствора ампулу вскрывают, ее содержимое растворяют в

3 мл стерильной дистиллированной воды.

В качестве экспериметальных животных испольэовали кроликов. кошек, павианов-гамадрилов. Кроликам препарат вводили в ушную вену в дозе 20 мг/кг, Через

10 мин после введения препарата у всех животных(3 кроликов) наступили кататонический ступор и глубокая анальгезия в зоне черепно-мозговых и спинно-мозговых нервов, После полного развития эффекта (через

60 мин) двум животным подкожно в дозе

4 мг/кг был введен налоксон, Через

5 мин наблюдалось восстановление двигательной активности и болевой чувствительности в зонах инерции черепномозговых и спинно-мозговых нервов.

Изменения поведения кролика, не получившего налоксон, не отмечалось на протяжении более 6 ч.

Кошкам (3 гол.) препарат вводили в вену бедра в дозе 20 мг/кг.

/

Через 15 мин у всех животных наступили кататонический ступор и анальгеэия в зоне черепно-мозговых нервов. Через 40 мин наступил глубокий сон.

После полного развития эффекта (через

60 мин) двум кошкам подкожно введен налоксон в дозе 4 мг/кг, Через .:. мин восстановились болевая чувствительность и прерван сон, Изменения поведения кошки, не получавшей налоксон, не отмечалось на протяжении более 6

Павианам-гамадрилам (3 гол.) препарат вводили в вену предплечья в дозе 20 мг/кг, Через 20 мин у всех животных исчезли агрессйвность. чувство страха, наступили эйфория и глубокая анальгезия в зоне черепно-мозговых и спинно-мозговых нервов, После полного развития эффскта (через

60 мин) двум животным подкожно вводили налоксон в дозе 5 мг/кг. Через 7 мин отмечалось проявление страха, агрессивности, а также восстановление болевой чувствительности, Изменения поведения павиана-гамадрилг. не получившего налоксон «е отмечалось на протяжении более 6 ч, Пример 2. Свежее молозиво коров первого удоя после отела в количестве 3 л

t смешивают с 3 л 1 н.водного раствора соляной кислоты и выдерживают в течение

60 мин. Затем дополнительно вносят

1,5 л 0,5 н, водного раствора соляной кислоты и при периодическом перемешивании оставляют на 24 ч. После этапа экстракции смесь центрифугируют 60 мин при 5 тыс, об/мин. Надосадочнук жидкость отстаивают еще 24 ч и фильтруют через 3 слоя марли для отделения жира, а затем через бумажный и ватный фильтр. Фильтрат помещают на 24 ч в холодильный шкаф (4 С) и затем вновь фильтруют через 8-10 слоев фильтровальной бумаги под вакуумом. К осветленному фильтрату постепенно приливают 10 объемов охлажденного ацетона и оставляют на 18 ч для отстоя взвеси, Осадок собирают на двойном бумажном фильтре. дважды промывают холодным ацетоном, снимают с фильтра, переносят в кристаллизатор и помещают в вакуумный сушильный шкаф. Сушку осуществляют при температуре 37-38 С в течение 4 ч, Полученный сухой продукт измельчают до порошкообразного состояния и готовят его 10;ь-ный раствор в 0,1 M растворе лимонной кислоты. Для этого навеску продукта вносят в раствор кислоты и периодически перемешивают, После набухания белков, что наблюдается через 2 ч, сосуд помещают в водяную баню, постепенно нагревают до

45 С и выдерживают 50 мин до просветления жидкости.

2000059

После растворения белков и просветления раствора его цент рифугируют в течение

40 мин при 5 тыс.об/мин, Надосадочную жидкость подвергают осветляющей, а затем и стерилиэующей фильтрации через пластинчатые фильтры.

Раствор разливают по 3 мл в стерильные стеклянные ампулы емкостью 10 мл, замораживают на протяжении 24 ч до температуры -50 С и подвергают сублимационному высушиванию в течение 72 ч при начальной температуре -35 С до конечной температуры 25 С.

Ампулы заполняют азотом и запаивают, Каждая ампула содержит 300 мг целевого продукта, а всего было получено 20,8 г препарата.

Для получения рабочего раствора ампулу вскрывают. ее содержимое растворяют в

3 мл стерильной дистиллированной воды.

В качестве экспериментальных животных использовали кроликов и кошек.

Кроликам препарат вводили в ушную вену в дозе 20 мг/кг. Через 10 мин после введения препарата у всех животных (3 кролика) наступили кататонический ступор и глубокая анальгезия в зоне черепно-мозговых и спинно-мозговых нервов.

После полного развития эффекта (через

60 мин) двум животным подкожно в дозе 4 мг/кг был введен налоксон.

Через 5 мин наблюдалось восстановление двигательной активности животных и болевой чувствительности в зонах инервации черепно-мозговых и спинно-мозговых нервов.

Изменения поведения кролика, не получавшего налоксон, не отмечалось на протяжении более 6 ч.

Кошкам препарат вводили в вену бедра в дозе 20 мг/кг. Через 15 мин у всех животных (3 кошки) наступили кататонический ступор и анальгезия в зоне черепно-мозговых нервов, Через 40 мин наступил глубокий сон.

После полного развития эффекта (через

60 мин) двум кошкам подкожно введен налоксон вдоэе 4 мг/кг,,Через 5 мин восстановилась болевая чувствительность и прерван сон.

Изменения поведения кошки, не получившей налоксон, не отмечалось на протяжении более 6 ч.

Пример 3. Свежее молозиво коров первого удоя после отела в количестве 3 л смешивают с 3 л 80 этанола 0.5 н. по соляной кислоте, перемешивают и оставляют на 24 ч при комнатной температуре, Периодически перемешивают смесь. После этапа экстракции смесь центрифугируют 60 мин

20

25 .45 С и выдерживают 50 мин до просветле30

55 при 5 тыс.об/мин. Надосадочную жидкость отстаивают 24 ч и фильтруют через бумажный и ватный фильтры.

Фильтрат помещают на 24 ч в холодильный шкаф (4 С) и затем вновь фильтруют через 8-10 слоев фильтровальной бумаги под вакуумом. К осветленному фильтрату постепенно приливают 10 объемов охлажденного ацетона и оставляют на 18 ч для отстоя взвеси. Осадок собирают на двойном бумажном фильтре, дважды промывают холодным ацетоном, снимают с фильтра, переносят в кристаллизатор и помещают в вакуумный сушильный шкаф. Сушку осуществляют при температуре 37 — 38 С в течение 4 ч.

Полученный сухой продукт измельчают до порошкообразного состояния и готовят его 107,-ный раствор в 0,1 М растворе лимонной кислоты. Для этого навеску продукта вносят в раствор кислоты и периодически перемешивают. После набухания белков, что наблюдается через 2 ч, сосуд помещают в водяную баню, постепенно нагревают до ния жидкости.

После растворения белков и просветления раствора его центрифугируют в течение

40 мин при 5 тыс.об/мин.

Надосадочную жидкость подвергают осветляющей, а затем и стерилизующей фильтрации через пластинчатые фильтры, Раствор разливают по 3 мл в стерильные стеклянные ампулы емкостью 10 мл.

Замораживают на протяжении 24 ч до температуры -50 С и подвергают сублимационному высушиванию в течение 72 ч при начальной температуре — 35"С до конечной температуры 25 С.

Ампулы заполняют азотом и запаивают, Каждая ампула содержит 300 мг целевого продукта, а всего было получено 20,3 г препарата.

Для получения рабочего раствора ампулу вскрывают, ее содержимое растворяют в

3 мл стерильной дистиллированной воды.

В качестве экспериментальных животных использовали кроликов и кошек.

Кроликам препарат вводили в ушную вену в дозе 20 мг/кг. Через 10 мин после введения препарата у всех животных (3 кролика) наступили кататонический ступор и глубокая анальгезия в зоне черепно-мозговых и спинно-мозговых нервов.

После полного развития эффекта (через

60 мин) двум животным подкожно в дозе 4 мг/кг был введен налоксон.

Через 5 мин наблюдалось восстановление двигательной активности животных и болевой чувствительности 9 зонах инерва2000059

10 ции черепно-мозговых и спинно-мозговых нервов, Изменения поведения кролика. не получившего налоксон. не отмечалось на протяжении более 6 ч.

Кошкам препарат вводили в вену бедра в дозе 20 мг/кг, Через 15 мин у всех животных (3 кошки) наступили кататонический ступор и анальгезия в зоне черепено-мозговых нервов. Через 40 мин наступил глубокий сон.

После полного развития эффекта (через 60 мин) двум кошкам подкожно введен налоксон в дозе 4 мг/кг. Через 5 мин восстановилась болевая чувствительность и прерван сон, Изменения поведения кошки, не получавшей налоксон, не отмечалось на протяжении более 6 ч.

Пример 4, Свежее сборное молозиво овец (первый удой после окота) в количестве

1 л смешивают с 1 л 0,5 н. водного раствора соляной кислоты и выдерживают в течение

60 мин. Затем дополнительно вносят 0,5 л

0,25 н. водного раствора соляной кислоты и при периодическом перемешивании оставляют на 24 ч. После этапа экстракции смесь центрифугируют в течение 60 мин при

5 тыс.об/мин. Надосадочную жидкость отстаивают еще 24 ч и фильтруют через 3 слоя марли для отделения жира, а затем через бумажный и ватный фильтры.

Фильтрат помещают на 24 ч в холодильный шкаф (4 С) и затем вновь фильтруют через 8 — 10 слоев фильтровальной бумаги под вакуумом.

К,осветленному фильтрату постепенно приливают 10 объемов охлажденного ацетона и оставляют на 18 ч для отстоя взвеси.

Осадок собирают на двойном бумажном фильтре, дважды промывают холодным ацетоном, снимают с фильтра, переносят в кристаллизатор и помещают в вакуумный сушильный шкаф, Сушку осуществляют при температуре 37 — 38 С в течение 4 ч, Полученный сухой продукт измельчают до порошкообразного состояния и готовят его

10 -ный раствор в 0,1 М растворе лимонной кислоты, Для этого навеску продукта вносят в раствор кислоты и периодически перемешивают. После набухэния белков, что наблюдается через 2 ч, сосуд помещают в водяную баню, постепенно нагревают до 45 С и выдерживают

50 мин до просветления жидкости, После растворения белков и просветления раствора его центрифугируют в течение

40 мин при 5 тыс. об/мин.

Надосадочную жидкость подвергают осветляющей, а затем и стерилизующей фильтрации через плэстинчэтые фильтры.

Раствор разливают по 3 мл в стерильные стеклянные ампулы емкостью 10 мл, 5

55 через 8-10 слоев фильтровэльной бумаги под вакуумом. замораживают на протяжении 24 ч до температуры -50 С и подвергают сублимационному высушиванию в течение 72 ч при начальной температуре -35"С до конечной температуры 25" С, Ампулы заполняют азотом и запэивэют.

Каждая ампула содержит 300 мг целевого продукта, а всего было получено 6,7 г продукта, Для получения рабочего pacrsopa ампулу вскрывают, ее содержимое растворяют в

3 мл стерильной дистиллированной воды.

В качестве экспериментальных животных использовали кроликов и кошек.

Кроликам препарат вводили в ушную вену в дозе 20 мг/кг. Через 10 мин после введения препарата у всех животных (3 кролика) наступили кэтатонический ступор и глубокая анальгезия в зоне черепно-мозговых и спинно-мозговых нервов.

После полного развития эффекта (через

60 мин) двум животным подкожно в дозв

4 мг/кг был введен ía loKcoH.

Через 5 мин наблюдалось восстановление двигательной активности животных и болевой чувствительности в зонах инервации черепно-мозговых и спинно-мозговых нервов.

Изменения поведения кролика, не получившего налоксон, не отмечалось на протяжении более 6 ч.

Кошкам препарат вводили в вену бедра в дозе 20 мг/кг. Через 15 мин у всех животных (3 кошки) наступили кататонический ступор и анальгезия в зоне черепно-мозговых нервов. Через 40 мин наступил глубокий сон.

После полного развития эффекта (через

60 мин) двум кошкам подкожно введен нэлоксон в дозе 4 мг/кг, Через 5 мин восстановилась болевая чувствительность и прерван сон.

Изменение поведения кошки, не получившей налоксон, не отмечалось на протяжении более 6 ч. . Пример 5. Сборное женское грудное молоко (первые сутки после родов) в количестве 1 л смешивают с 1 л 0,5 н, водного раствора соляной кислоты и выдерживают при периодическом перемешивэнии 24 ч.

После этапа экстракции смесь центрифугируют в течение 60 мин при 5 тыс.об!мин.

Надосадочную жидкость отстаивают еще

24 ч и фильтруют через 3 слоя марли для отделения жира, а затем через бумажный и ватный фильтры.

Фильтрэт помещают на 24 ч в холодильный шкаф (4 С) и затем вновь фильтруют

2000059

12 ч

К осветленному фильтрату постепенно приливают 10 объемов охлажденного ацетона и оставлюят на 18 ч для отстоя взвеси.

Осадок собирают на двойном бумажном фильтре, дважды промыва от холодным ацетоном, снимают с фильтра, переносят в кристаллиэатор и помещают в вакуумный сушильный шкаф.

Сушку осуществляют при температуре

37 — 38 С в течение 4 ч.

Полученный сухой продукт измельчают до порошкообразного состояния и готовят его 10 -ный раствор в 0,1 М растворе лиМОННОЙ КИСЛОТЫ.

Для этого навеску продукта вносят в раствор кислоты и периодически перемешивают.

После набухания белков, что наблюдается через 2 ч, сосуд помещают в водяную баню, постепенно нагревают до 45 С и выдер>кивают 50 мин до просветления жидкости, После растворения белков и просветления раствора его центрифугируют в течение

40 мин при 5 тыс.об/мин.

Надосадочную жидкость подвергают осветляющей, а затем и стерилиэующей фильтрации через пластинчатые фильтры, Раствор разливают по 3 мл в стерильные стеклянные ампулы емкостью 10 мл, замораживают на протяжении 24 ч до температуры -50 С и подвергают сублимационному высушиванию в течение 72 ч при начальной температуре -35"С до конечной температуры 25 С.

Ампулы заполняют азотом и запаивают.

Каждая ампула содержит 300 мг целевого продукта, а всего было получено 14 8 r препарата.

Для получения рабочего раствора ампулу вскрывают, ее содержимое растворяют в 3 мл стерильной дистиллированной воды, В качестве экспериментальных животных испольэовали кроликов и кошек.

Кроликам препарат вводили в ушную вену в дозе 20 мг/кг. Через 10 мин после введения препарата у всех животных (3 кролика) наступили кататоничекий ступор и глубокая анальгезия в зоне черепно-мозговых и спинно-мозговых нервов.

После полного развития эффекта (через

60 мин) двум животным подкожно в дозе 4 мг/кг был введен налоксон, Через 6 мин наблюдалось восстановление двигательной активности животных и болевой чувствительности в зонах инервации черепно-мозговых и спинно-мозговых нервов.

Изменения поведения кролика, не получившего налоксон, не отмечалось на протяжении более 6 ч, 10

30 5

Кошкам препарат вводили в вену бедра в дозе 20 мг/кг. Через 15 мин у всех животных (3 кошки) наступили кататонический ступор и анальгезия в зоне черепно-мозговых нервов, Через 30 мин наступила эйфория и было подавлено чувство страха. Через

50 мин наступил глубокий сон.

После полного развития эффекта (через

60 мин) двум кошкам подкожно введен налоксон в дозе 4 мг/кг. Через 5 мин восстановились болевая чувствительность, чувство страха и были прерваны сон и эйфория.

Изменения поведения кошки, не получившей налоксон, не отмечалось на протяжении более 6 ч.

Пример 6. Сборное женское грудное молоко (первые сутки после родов) в количестве 1 л смешивают с 1 л 80 -ного этанола

0.5 н, по соляной кислоте. Перемешивают и оставляют 24 ч при комнатной температуре.

Периодически перемешивают смесь. После этапа экстракции смесь центрифугируют 60 мин при 5 тыс. об/мин, Надосадочную жидкость отстаивают 24 ч и фильтруют через бумажный и ватный фильтры.

Фильтрат помещают на 24 ч в холодильный шкаф (4ОQ) и затем вновь фильтруют через 8 — 10 слоев фильтровальной бумаги иод вакуумом.

К осветленному фильтрату постепенно приливают 10 объемов охлажденного ацетона и оставляют на 18 ч для отстоя взвеси.

Осадок собирают на двойном бумажном фильтре, дважды промывают холодньйч ацетоном, снимают с фильтра, переносят в кристаллизатор и помещают в вакуумный сушильный шкаф. Сушку осуществляют при температуре 37 — 38 С в течение 4 ч.

Полученный сухой продукт измельчают до порошкообразного состояния и готовят его 10%-ный раствор в 0,1 M растворе лимОннОЙ кислоты.

Для чего навеску продукта вносят в раствор кислоты и периодически перемешиващт.

После набухания белков, что наблюдается через 2 ч, сосуд помещают в водяную баню, постепенно нагревают до 45 С и выдерживают 50 мин до просветления жидкости, После растворения белков и просветления раствора его центрифугируют в течение

40 мин при 5 тыс.об./мин. Надосадочную жидкость подвергают осветляющей. а затем и стерилизующей фильтрации через пластинчатые фильтры.

Раствор разливают по 3 мл в стерильные стеклянные ампулы емкостью 10 мл.

Замораживает на протяжении 24 ч до температуры -50 С и подвергает сублимационному высушивание в течение 72 ч при

2000059

14 ют

Составитель Е. Наймытенко

Техред М.Моргентал Корректор А. Мотыль

Редактор Л. Павлова

Тираж Подписное

НПО "Поиск" Роспатента

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб.. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101

Заказ 3052 начальной температуре -35" до конечной температуры 25" С.

Ампулы заполняют азотом и запаиваКаждая ампула содержит 300 мг целево- 5 го продукта. а всего было получено 13,7 г препарата.

Для получения рабочего раствора ампулу вскрывают, ее содержимое растворяют в

3 мл стерильной дистиллированной воды, 10

В качестве экспериментальных животных испольэовали кроликов и кошек. Кроликам препарат вводили в ушную вену в дозе 20 мг/кг. Через 10 мин после введения препарата у всех животных (3 кролика) на- 15 ступили кататонический ступор и глубокая анальгезия в зоне черепно-мозговых и спинно-мозговых нервов, После полного развития эффекта (через 60 мин) двум животным подкожно в 20 дозе 4 мг/кг был введен налоксон. Через б мин наблюдалось восстановление двигательной активности животных и болевой чувствительности в зонах инервации черепно-мозговых и спинно-мозговых нер- 25 во в.

Изменения поведения кролика, не получавшего налоксон, не отмечалось на протяжении более 6 ч.

Кошкам препарат вводили в вену бедра 30 в дозе 20 мг/кг. Через 15 мин у всех животных (3 кошки) наступили кататонический ступор и анальгеэия в зоне черепно-мозговых нервов. Через 30 мин наступила эйфория и было подавлено чувство страха, Через 35

50 мин наступил глубокий сон.

После полного развития эффекта (через

60 мин) двум кошкам подкожно введен налоксон в дозе 4 мг/кг. Через 5 мин восстановились болевая чувствительность, чувство страха и были прерваны сон и эйфория.

Изменения поведения кошки, не получавшей налоксон, не отмечалось на протяжении более 6 ч.

Формула изобретения

1, Способ получения белков, обладающих сродством к опиатным рецепторам, отличающийся тем, что в качестве белков, обладающих сродством к опиатным рецегггорам, используют фракцию кислоторастворимых белков молозива человека или животных с мол.мас. 17,5 — 70 кД.

2. Способ по п,1, отличающийся тем, что фракцию кислоторастворимых белков иэ молозива человека или животных получают путем экстрагирования подкисленной водой или подкисленными органическими растворителями с последующим ее осаждением органическими растворителями, 3, Способ no nn.1 и 2. о т л и ч а ю щ и йс я тем. что для подкисления воды или органического растворителя используют соляную кислоту.

4, Способ по п.1, отличающийся тем, что фракцию кислоторастворимых белков подвергают сушке.

5, Способпо пп 1и4,отл ича ющийс я тем, что сушкой или после сушки фракцию кислоторастворимых белков подвергают стерилизации,

Способ получения белков, обладающих сродством к опиатным рецепторам Способ получения белков, обладающих сродством к опиатным рецепторам Способ получения белков, обладающих сродством к опиатным рецепторам Способ получения белков, обладающих сродством к опиатным рецепторам Способ получения белков, обладающих сродством к опиатным рецепторам Способ получения белков, обладающих сродством к опиатным рецепторам Способ получения белков, обладающих сродством к опиатным рецепторам 

 

Похожие патенты:

Изобретение относится к биотехнологии и касается способа очистки кислотного гидролизата белоксодержащего сырья

Изобретение относится к пищевой промышленности и может быть использовано в пищеконцентратной, кондитерской и консервной промышленности

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к способам получения белковых гидролизатов дрожжевой биомассы и производства биологически активных продуктов пищевого, кормового и медицинского назначения
Изобретение относится к молочной промышленности и может быть использовано при производстве молочно-белковых продуктов

Изобретение относится к микробиологической промышленности, к биотехнологии, в частности к способам автолиза хлебопекарных дрожжей для получения биологически активной пищевой добавки, представляющей высокоценный продукт, богатый содержанием легкоусвояемых аминокислот, витаминов группы В, эргостерина (провитамина Д ), полисахаридов антиоксидантов, нуклеиновых компонент, радиопротекторов, биосорбентов, макро- и микроэлементов, высокого процента пантотеновой кислоты, других физиологически активных веществ, и используемой в различных областях пищевой промышленности, в медицине для лечебного питания, парфюмерии, косметологии, в сельском хозяйстве
Изобретение относится к пищевой промышленности, касается получения продуктов из дрожжей

Изобретение относится к замене жира при приготовлении пищевых продуктов, при профилактическом и терапевтическом лечении для снижения веса и усиленной белковой терапии, а также к съедобным пищевым продуктам типа, в котором жиры, обычно имеющиеся в концентрациях, достаточных для получения органолептического ощущения, заменяются белковыми материалами, которые обладают мягкими органолептическими характеристиками масла в водных эмульсиях
Изобретение относится к пищевой промышленности, а именно к производству функциональных пищевых добавок на основе продуктов переработки яиц

Изобретение относится к биологически активным веществам, в частности витаминно-аминокислотным концентратам
Изобретение относится к пищевой промышленности и биотехнологии в т.ч
Изобретение относится к пищевой промышленности и биотехнологии в т.ч

Способ получения белков, обладающих сродством к опиатным рецепторам

Наверх