Способ получения белков, обладающих сродством к опиатным рецепторам

 

Использование: в биотехнологии при получении белков микробного происхождения , обладающих биологической активностью . Сущность изобретения1 получают фракцию кислоторастворимых белков, обладающих сродством к опиэтным рецепторам, путем экстрагирования микробной массы подкисленной водой или подкисленными органическими растворителями с последующим осаждением этой фракции органическими растворителями. В микробную массу входят молочно-кислые бактерии, уробактерии сенная палочка. Для подкисления используют соляную кислоту Фракцию кислоторастворимых белков сушат, перед сушкой или после сушки ее подвергают стерилизации к чв

isl>s А 23 ) 1/00. 3/20

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

Комитет Российской Фелсрации

Но патентам и товарным знакам (21) 5014052/13 (22) 31.10.91 (46) 07.09.93. Бюл. М 33 — 36 (71) Всесоюзная ассоциация "Фармбиопресс" (72) Нэймытенко Е,П., Быков В.А., Крашенинников О.А„Наймытенко К.Е. (73) Крашенинников О.А. (56) Эндорфины./Под ред. Э.Коста. М.Трабуки, М.; Мир, 1981.

Хухо Ф. Нейрохимия. Основы и принципы. М.; Мир, 1990.

Бахарев В,Д. Клиническая нейрофизиология регуляторных пептидов, Свердловск:

Издательство Уральского университета, 1989.

Изобретение относится к биотехнологии и касается получения белков микробного происхождения, обладающих биологической активностью.

Полученные предлагаемым способом белковые препараты могут быть использованы в медико-биологических исследованиях и являются потенциальными лекарственными средствами.

Фундаментальными исследованиями заявителя было установлено. что кислоторастворимая фракция белков, выделенная из биомассы бактерий, обладает сродством к опиоидным клеточным рецепторам, и при введении в живой организм они вызывают эффекты, аналогичные эффектам природ„.,RU „„2000060 C (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЛКОВ, ОБЛАДАЮЩИХ СРОДСТВОМ К ОПИАТНЫМ РЕЦЕПТОРАМ (57) Использование; в биотехнологии при получении белков микробного происхождения, обладающих биологической активностью. Сущность изобретения: получают фракцию кислоторастворимых белков, обладающих сродством к опиатным рецепторам, путем экстрагирования микробной массы подкисленной водой или подкисленными органическими растворителями с последующим осаждением этой фракции органическими растворителями. В микробную массу входят молочно-кислые бактерии, уробактерии, сенная палочка. Для подкисления используют соляную кислоту. ФракЦию кислоторастворимых белков сушат, перед сушкой или после сушки ее подвергают стерилизации, иых опиоидов, — анальгезирующий, снотворный, психотропный.

Сущность предложенного способа состоит в том, что после дезинтеграции микробной массы ультразвуком и экстракции балластных веществ экстракцией ацетатным буфером из нее извлекают кислоторэстворимую фракцию белков и освобождают ее от посторонних примесей.

Исходным сырьем для получения целевого продукта может служить микробная масса многих видов бактерий, но предпочтительно использовать молочно-кислые бактерии, уробактерии, сенную палочку, как более доступные в требуемых количествах и

2000060 не обладающие патогенностью для человека и животных.

Кислоторастворимую фракцию микробных белков можно извлекать любыми известными приемами. но наиболее рационально экстрагировэть ее подкисленной водой или подкисленными органическими растворителями, Степень кислотности экстракта не имеет решающего значения и обычно составляет 0,25 — 1.0 н, Природа кислоты также не оказывает особого влилния на эффективность процесса, однако использование соляной кислоты представляется наиболее удачным.

Для освобождения кислоторастворимой фракции от остатков микробной массы взвесь микроорганизмов 8 растворах соляной кислоты подвергают центрифугированию, нэдосадочную жидкость фильтруют.

Могут применяться и иные методы дополнительной очистки.

Иэ кислого экстракта белки могут быть осаждены органическими растворителями, Осажденные кислоторастворимые белки могут быть повторно растворимы в растворах кислот, подвергнутых дополнительному центрифугированию и осаждению. Фракцию освобожденных от примесей кислоторастворимых белков для удобства работы можно высушивать, например, путем лиофилиэации.

Поскольку целевой продукт используется для парэнтерального введения после или до высушиаания возможен этап его стерилизации. Остаточная влажность высушенного продукта составляет 3-5 ь, препарат полностью растворяется в воде.

Полученный препарат дает все характерные реакции на белки. Его мол.м. составляет от 14 кДа до 94 кДа. При дискэлектрофорезе в полиакриламидном геле установлено наличие нескольких индивидуальных белков.

Характер наблюдаемой биологической активности полученного препарата обусловлен, по-видимому, суммарным присутствием индивидуальных белков Для корректировки биологических эффектов допустимо фрэкционировэние целевого продукта.

Сродство полученных предложенным способом белков к опиатным рецепторам было доказано классическим налоксоновым методом (1).

Теоретически и практически доказано, что биологический эффект природных соединений опиэтной природы возникает в результате связывания опиоидных соединений со специфическими опиэтными клеточными рецепторами нескольких типов, 5

Известно также, что антагонист опиоидных соединений налоксон имеет большее сродство к опиатным рецепторам и поэтому вытесняет опиоидные соединения с их поверхности, тем самым "отменяя" биологические эффекты. обусловленные опиоидами.

Многочисленными экспериметами показано. что полученные предложенным способом белки при введении в организм экспериментального животного вызывают клиническую картину, соответствующую последствиям введения природных опиоидов.

Последующее введение налоксона полностью устраняет эффекты биологически активных белков.

Классическая реакция экспериметальных животных на нэлоксон и общая клиническая картина воздействия белков, полученных предложенным способом. однозначно подтверждают специфическое взаимодействие этих белков с опиатными рецепторами.

Анализ патентной и научно-технической литературы показал, что сведений об оригинальной способности белков кислоторастворимой фракции микроорганизмов связываться с опиатными клеточными рецепторами не имеется, Заявителем впервые установлена способность нового класса соединений — белков связываться с опиатными рецепторами и вызывать биологические эффекты, воспроизводящие эффекты природных опиоидов. Установленная заявителем закономерность априорно не вытекает из известного уровня знаний.

До настоящего времени был известен лишь один класс соединений — низшие пептиды, которые связывались с опиатными рецепторами. Наиболее известны и доступны лишь два нейропептида — энкефалин и эндорфин, дающие эффекты, сходные с эффектами опиоидов (1, 2, 3).

Способы получения этих нейропептидов сложны, а эффект воздействия энкефалина и эндорфина кратковременен.

Предлагаемый способ получения белков, обладающих сродством к опиатным рецептортам, несравненно проще способа получения нейропептидов с аналогичной функцией. а получаемые предложенным способом белки вызывают более разносторонний и более длительный эффект.

Разработанный способ открывает по крайней мере путь решения одной из наиболее актуальных проблем — безопасного длительного обезболивания.

Более подробно сущность предложенного способа поясняется следующими примерами.

2000060

Пример 1. Молочно-кислые бактерии

L,plantarum культивируют на среде КД-5 до концентрации 90-110 млрд микробных тел в 1мп.

Культуру в объеме 16 л центрифугируют

60 мин при 5 тыс. об/мин. Надосадочную жидкость отбрасывают.

Сырую микробную массу взвешивают в

3 л 0,2 М ацетат-уксусного буфера 0,14 M no хлориду натрия (рН 4,8).

Взвесь хорошо перемешивают и подвергают ультразвуковой обработке при частоте 25 кГц. Проводят 3 цикла обработки ультразвуком по 30 мин. Экстрагируют при комнатной температуре при периодическом перемешивании 48 ч. После этапа экстракции взвесь центрифугируют в течение

60 мин при 5 тыс. об/мин. Надосадочную жидкость отбрасывают. Осадок после промывания дистиллированной водой на центрифуге взвешивают в 1,5 л 80%-ного этанола 0,5 н. по соляной кислоте. Взвесь после перемешивания подвергают ультразвуковой обработке при частоте 25 кГц, Проводят 2 цикла обработки ультразвуком по 30 мин.

Зкстрагируют при комнатной температуре при периодическом перемешивании 48 ч. После этапа экстракции взвесь центрифугируют 60 мин при 5 тыс.об/мин. Надосадочную жидкость декантируют, Осадок промывают дистиллированной водой на центрифуге и взвешивают в 1 л 0,5 н. раствора соляной кислоты. Проводят два цикла ультразвуковой обработки при частоте

25 к Гц по 30 мин. Экстрагируют при периодическом перемешивэнии 48 ч. После экстрагирования взвесь центрифугируют 60 мин при 5 тыс,об/мин. Надосадочную жидкость декантируют. осадок отбрасывают.

Зтанольный и кислотный экстракты объединяют, подвергают осветляющей фильтрации через 8-10 слоев фильтровальной бумаги под вакуумом.

К осветленному фильтрату постепенно приливают 10 объемов охлажденного ацетона и оставляют на 18 ч для отстоя взвеси.

Осадок собирают на двойном бумажном фильтре, дважды промывают холодным ацетоном, снимают с фильтра, переносят в кристаллизатор и помещают в вакуумный сушильный шкаф, Сушку осуществляют при температуре 37 — 38 С в течение 4 ч.

Полученный сухой препарат измельчают до порошкообразного состояния и готовят его 2%-ный раствор в 0,1 M растворе лимонной кислоты, Дпя этого навеску продукта вносят в раствор кислоты и периодически перемешивают, После набухания белков, что наблюдается через 2 ч, сосуд

45 помещают в водяную баню. постепенно нагревают до 45 С и выдерживают 50 мин до г|росветпения жидкости. После раствоpeti«a белков и просветления раствора его центрифугируют в течение 40 мин при 5 тыс. об/мин.

Надосадочную жидкость подвергают осветпяющей, а затем и стерилизующей фильтрации через пластинчатые фильтры.

Раствор разливают по 3 мл в стерильные стеклянные ампулы по 10 мл. замораживают на протяжении 24 ч до температуры — 50 С и подвергают сублимационному высушиванию в течение 72 ч при начальной температуре — 35"С до конечной температуры 25 С.

Ампулы заполняют азотом H запаивают, Каждая ампула содержит 60 мг целевого продукта. а всего было получено 13,1 г npenapaтэ

В качестве экспериметальных животных использовали кроликов, кошек, павианов-гамадрилов.

Кроликам препарат вводили в ушную вену в дозе 20 мг/кг. Через 5 мин после введения препарата у всех животных (3 кролика) наступили кататонический ступор и глубокая araëüãåçèÿ в зоне черепно-мозговых и спинно-мозговых нервов и стойкая

\ вазодипятация микроциркуляторного русла ушных раковин. Анэльгезия тканей ушных раковин очень глубокая. Животные не реагируют на термический фактор даже при обугливнаии тканей. После развития эффекта (через 60 мин) двум кроликам подкожно в дозе 4 мг/кг был введен налоксон.

Через 6 мин наблюдалось восстановление двигательной активности животных, болевой чувствительности и исчезновение вазодилятации микроциркуляторного русла ушных раковин.

Изменения поведения кролика, не получавшего налоксон, не отмечалось на протяжении более 6 ч.

Кошкам препарат вводили в вену бедра

s дозе 20 мг/кг. Через 10 мин у всех животных (3 кошки) наступил кататонический ступор, исчезло чувство страха. Через 30 мин наступили глубокий сон и анальгезия е области черепно-мозговых и спинно-мозговых нервов.

После полного развития эффекта (через

60 мин) двум кошкам подкожно введен налоксон в дозе 4 мг/кг. Через 7 мин восстановились болевая чувствительность, чувство страха, прерван сон.

Изменения поведения кошки, не получавшей налоксон, не отмечалось нэ протяжении более 6 ч.

Павианам-гамэдрилам (3 павиана) препарат вводили е вену предплечья в дозе 20

2000()60 мг/Kr ЧРрез 5 мин после введения препарата у животных исчезли чувгтво страха и агрессивность. Через 15 мин наступила глубокая анальгезия в области черепно-мозГОВЫХ И СПИННО-МОЗГОВЫХ НЕРВОВ.

После полного развития эффекта (череэ

60 мин) двум павианам подкожно введен налоксон в дозе 4 мг/кг. Через 3,5 мин у животных появились страх и агрессивность, восстановилась болевая чувствительность.

Изменения поведения павиана-гамадрила, не получавшего налонсон, не отмечалось на протяжении более 6 ч.

Пример 2. Молочно-кислые бактерии

1.plantarum культивируют на среде КД-5 до концентрации 90-110 млрд микробных тел в1 мл.

Культуру в количестве 16 л центрифугируют 60 мин при 5 тыс.об/мин. Надосадочную жидкость отбрасывают. Сырую микробную массу взвешивают в 3 л 0,2 М ацетат-уксусного буфера 0,14 М по хлориду натрия (рН 4,8).

Взвесь хорошо перемешивают и подверга1от ультразвуковой обработке при частоте 25 кГц. Проводят 3 цикла обработки ультразвуком по 30 мин. Экстрагируют при комнатной температуре при периодическом перемешивании 48 ч.

После этапа экстракции взвесь центрифугируют в течение 60 мин при 5 тыс.об/мин. Надосадочную жидкость отбрасывают, Осадок после промывания дистиллированной водой на центрифуге взвешивают в 4,5 л 0,5 н. раствора соляной кислоты. Взвесь после перемешивания подвергают ультразвуковой обработке при частоте 25 кГц. Проводят 2 цикла обработки ультразвуком по 30 мин.

Экстрагируют при комнатной температуре при периодическом перемешивании

48 ч. После этапа экстракции взвесь центрифугируют 60 мин при 5 тыс.об/мин. Надосадочную жикдость декантируют. Осадок отбрасывают.

Надосадочную жидкость фильтруют через 8-10 слоев фильтровальной бумаги под вакуумом.

К осветленному фильтрату постепенно приливают 10 обьемов охлажденного ацетона и оставляют на 18 ч для отстоя взвеси.

Осадок собирают на двойном бумажном фильтре. дважды промывают холодным ацетоном. снимают с фильтра. переносят в кристаллиэатор и помещагот в вакуумный сушильный шкаф, Сушку осуществл от при температурР

37 - 38" С в течение 4 ч

Полученный сухой продук1 измельчают до пороьчкопбразного гпс. пчния и готоРя

55 его 2) -ный рзствор в О, l М растворе лимпнНОЙ КИСЛОТЫ.

Для этого навеску продукта вносят в раствор кислоты и периодически перемешивают, После набухания белков, что наблюдается через 2 ч, сосуд помещают в водяную баню, постепенно нагревают до 45"С и выдерживают 50 мин до просветления жидкости. После растворения белков и просветления раствора его центрифугируют в течение 40 мин при 5 тыс. об/мин, Надосадочную жидкость подвергают осветляющей, а затем и стерилиэующей фильтрации через пластинчатые фильтры.

Раствор разливают по 3 мл в стерильные стеклянные ампулы по 10 мл, замораживают на протяжении 24 ч до температуры—

50 С и подвергают сублимационному высушиванию в течение 72 ч при начальной температуре -- 35 С до конечной температуры

25 С.

Ампулы заполняют азотом и эапаивают.

Каждая ампула содержит 60 мг целевого продукта, а всего было получено 12,7 г препарата.

В качестве экспериметальных животных использовали кроликов, кошек, павианов-гамадрилов.

Кроликам препарат вводили в ушную вену s дозе 20 мг/кг. Через 5 мин у всех животных (3 кролика) наступили кататонический ступор и глубокая анальгеэия в зоне черепно-мозговых и спинно-мозговых нервов и стойкая ваэодилятация микроциркуляторного русла ушных раковин, Анальгеэия тканей ушных раковин очень глубокая. Животные не реагируют на термический фактор даже при обугливании тканей.

После развития эффекта (через 60 мин) двум кроликам подкожно в дозе 4 мг/кг был введен налоксон. Через 6 мин наблюдались восстановление двигательной активности. болевой чувствительности и исчезновение ваэодилятации микроциркуляторного русла ушных раковин.

Изменения поведения кролика, не получившего налоксон, не отмечалось на протяжении более 6 ч.

Кошкам препарат вводили в вену бедра в дозе 20 мг/кг, Через 10 мин у всех животных (3 кошки) наступил KBTATQHM÷åñêèé ступор, исчезло чувство страха. Через 30 мин наступили глубокий сон и анальгезия в области черепно-моэговых и спинно-мозговых нервов.

После поного развития эффекта (через

60 мин) двум кошкам подкожно введен налоксон в дозе 4 мг/кг Через 7 мин восстановилась болевая чувстви и ллиус Гь чуял тнс страха, прерван rn>i

2000060

50

Изменения поведения кошки, не получавшеи налоксон, не отмечалось на протяжении более 6 ч.

Павианам-гамадрилам (3 павиана) препарат вводили в вену предплечья в дозе 20 мг/кг. Через 5 мин после введения препарата у животных исчезли чувство страха и агрессивность, Через 15 мин наступила глубокая анальгезия в области черепно-мозговых и спинномозговых нервов. После голного развития эффекта (через 60 мин) двум павианам подкожно был введен налоксон в дозе 4 мг/кг, Через 3,5 мин у животных появились страх и агрессивность, восстановилась болевая чувствительность.

Изменения поведения павиана-гамадрила, не получавшего налокгон, не отмечалось на протяжении более 6 ч.

Пример 3. Мопочно-кислые бкатерии

L.plantarum культивируют на среде КД-5 до концентрации 90-110 млрд микробных тел в1 мл.

Культуру в количестве 16 л центрифугируют 60 мин при 5 тыс.об/мин. Надосадочную жидкость отбрасывают. Сырую микробную массу взвешивают в 3 л, 9,2 М ацетат-уксусного буфера 0,14 М по хлориду натрия (рН 4,8).

Взвесь хорошо перемешивают и подвергают ультразвуковой обработке при частоте 25 кГц. Проводят 3 цикла обработки ультразвуком по 30 мин. Экстрагиуют при комнатной температуре при периодическом перемешивании 48 ч.

После этапа экстракции взвесь центрифугируют в течение 60 мин при 5 тыс.об/мин.

Надосадочную жидкость отбрасывают. Осадок после промывания дистиллированной водой на центрифуге взвешивают в 4;5 л

0,25 н, раствора соляной кислоты, Взвесь после перемешивания подвергают ультразвуковой обработке при частоте 25 кГц. Проводят 2 цикла обработки ультразвуком по 30 мин.

Экстрагируют при комнатной температуре при периодическом перемешивании

48 ч. После этапа экстракции взвесь центрифугируют 60 мин при 5 тыс.об/мин, Надосадочную жидкость декантируют. Осадок отбрасывают.

Надосадочную жидкость фильтруют через 8-10 слоев фильтровальной бумаги под вакуумом, К осветленному фильтрату постепенно приливают 10 обьемов охлажденного ацетона и оставляют на 18 ч для отстоя взвеси.

Осадок собирают на двойном бумажном фильтре, дважды <т роMûâаloò xîèîäным ацетоном, снимают < Фильтра переносят в кри5

45 с аллизатор и помещают в вакуумный сушильный шкаф. Сушку осуществляют при темгерату1те 37 — 38"С в течение 4 ч, Получен<ый сухой продукт измельчают до порошкообразного состояния и готовят его 2ф,-ный раствор в 0,1 M растворе лимонной кислоты.

Для этого навеску продукта вносят в раствор кислсты и периоди <вски перемешивают. После набухан«.я белков, что наблюдается через 2 ч, сосуд помещают в всдяную баню, постеп нпо нагревают до 45 С и выдерживаю 50 мин до просветления жидкости. Г!осле растворениг белков и просветления раствора его центрифугируют в течсние 40 мин при

5 тыс. об/мин, Надосадочну<о жидкость подвергают осветляющей, а затем и стерилизующей фильтрации через пласт инчатые фильтры.

Раствор разливают по 3 мл в стерильные стеклянные ампулы по 10 мл, замораживают на протяжении 24 ч до тепературы

-50"C. и подвергают сублимационному высушиванию 0 течение 72 ч при начальной температуре -35"С до конечной температуры

25" С, Ампулы заполняют азотом и запаивают, Каждая ампула содержит 60 мг целевого продукта, а всего было получено 12,2 r препа рата.

В качестве экспериментальных животных использовали кроликов и кошек, Кроликам препарат вводили в ушную вену в дозе 20 мг/кг. Через 5 мин у всех животных (3 кролика) но тупили кататонический ступор, глубокая анальгезия в зоне черепно-мозговых и спинно-мозговых нервов и стойкая вазодилятация микроциркуляторного русла ушных раковин.

Анальгезия тканей ушных раковин очень глубокая. Животные не реагируют на термический фактор даже при обугливании тканей.

После развития эффекта (через 60 мин) двум кроликам подкожно в дозе 4 мг/кг был введен налоксон. Через 6 мин наблюдалось восстановление двигательной активности, болевой чувствительности и исчезновение вазодилятации микроциркулярного русла ушных раковин.

Изменения поведения кролика, не олучавшего налоксон, не отмечалось на протяжении более 6 ч.

Кошкам препарат вводили в вену бедра в дозе 20 мг/кг. Через 10 мин у всех животных (3 кошки) наступил кататонический ступор, исчезло чувство страха. Через 30 мин наступили глубокий сон и анвльгезия в об2000060

12 ласти черепно-мозговых и спинно-мозговых нервов.

После полного развития эффекта (через

60 мин) двумя кошкам подкожно введен наклоксон в дозе 4 мг/кг. Через 7 мин восстановились болевая чувствительность, чувство страха, прерван сон, Изменения поведения кошки, не получившей налоксон, не отмечалось на протяжении более 6 ч.

Пример 4. Сенную палочку (Вас.subtllls) культивируют на мясопептонном бульоне до концентрации 30-40 млрд микробных тел в 1 мл.

Культуру в количестве 16 л центрифугируют 60 мин при 5 тыс. об/мин. Надосадочную . жидкость отбрасывают. Сырую микробную массу взвешивают в 3 л 0,2 M ацетат-уксусного буфера 0,14 М по хлориду натрия (рН 4,8).

Взвесь хорошо перемешивают и подвергают ультразвуковой обработке при частоте 25 кГц, Проводят 3 цикла обработки ультразвуком по 30 мин, Экстрагируют при комнатной температуре и ри периодическом перемешивании 48 ч.

После этапа зкстракции взвесь центрифугируют в течение 60 мин при 5 тыс.об/мин.

Надосадочную жидкость отбрасывают. Осадок после промывания дистиллированной водой на центрифуге взвешивают в 4,5 л 0,5 н. раствора соляной кислоты. взвесь после перемешивания подвергают ультразвуковой обработке при частоте

25 кГц. Проводят 2 цикла обработки ультразвуком по 30 мин.

Экстрагируют при комнатной температуре при периодическом перемешивании

48 ч.

После этапа экстракции взвесь центрифугируют 60 мин при 5 тыс.об/мин. Надосадочную жидкость декантируют. Осадок отбрасывают, Надосадочную жидкость фильтруют через 8-10 слоев фильтровальной бумаги под вакуумом.

К осветленному фильтрату постепенно приливают 10 объемов охлажденного ацетона и оставляют на 18 ч для отстоя взвеси.

Осадок собирают на двойном бумажном фильтре, дважды промывают холодным ацетоном, снимают с фильтра, переносят в кристаллиэатор и помещают в вакуумный сушильный шкаф. Сушку осуществляют при температуре 37 — 38 С в течение 4 ч.

Полученный сухой продукт измельчают до порошкообразного состояния и готовят его 27-ный раствор в 0,1 M растворе лимонНОЙ KVIctIоты.

60 мин) двум кошкам подкожно был введен налоксон в дозе 4 мг/кг. Через 7 мин восстановились болевая чувствительность, чувство страха, был прерван сон.

Для этого навеску продукта вносят в раствор кислоты и периодически перемешивают, После набухания белков, что наблюдается через 2 ч, сосуд помещают в водяную

5 баню, постепенно нагревают до 45 С и выдерживают 50 мин до просветления жидкости. После растворения белков и просветления жидкости ее центрифугируют в течение 40 мин при 5 тыс.об/мин.

10 Надосадочную жидкость подвергают осветляющей, а затем и стерилизующей фильтрации через пластинчатые фильтры.

Раствор разливают по 3 мл в стерильные стеклянные ампулы по 10 мл, заморажи15 вают на протяжении 24 ч до температуры

-50 С и подвергают сублимационному высушиванию в течение 72 ч при начальной температуре -35 С до конечной температуры

25 С.

20 Ампулы заполняют азотом и запаивают.

Каждая ампула содержит 60 мг продукта, а всего было получено 7,8 г препарата, В качестве экспериметальных животных использовали кроликов, кошек, павиа25 нов-гамадрилов.

Кроликам препарат вводили в ушную вену в дозе 20 мг/кг. Через 5 мин у всех животных (3 кролика) наступили кататонический ступор, глубокая анальгезия в зоне че30 репно-мозговых и спинно-мозговых нервов и стойкая вазодилятация микроциркуляторного русла ушных раковин.

Анальгезия тканей ушных раковин очень глубокая. Животные не реагируют на

35 термический фактор даже при обугливании тканей.

После развития эффекта (через 60 мин) двум кроликам подкожно в дозе 4 мг/кг был введен налоксон. Через 5 мин наблюдалось

40 восстановление двигательной активности, болевой чувствительности и исчезновение вазодилятации микроциркуляторного русла ушных арковин.

Изменения поведения кролика, не пол45 учавшего налоксон, не отмечалось на протяжении более 6 ч.

Кошкам препарат вводили в вену бедра в дозе 20 мг/кг. Через 10 мин у всех животных (3 кошки) наступил кататонический сту50 пор, исчезло чувство страха. Через 20 мин наступили глубокий сон и анальгезия в области черепно-мозговых и спинно-мозговых нервов.

После полного развития эффекта (через

2000060

5

1О

30 а нов-гам адрилов

40

50

55 нервов.

Изменения поведения кошки, не получившей налоксон, не отмечалось на протяжении более 6 ч.

Павианам-гамадрилам (3 павиана) препарат вводили в вену предплечья в дозе 20 мг/кг. Через 5 мин после введения препарата у животных исчезли чувство страха и агрессивность, наблюдалась сильная ваэодилятация микроциркуляторного русла головы. Через 15 мин наступила глубокая анальгезия в области черепно-мозговых и спинно-мозговых нервов.

После полного развития эффекта (через

60 мин) двум павианам подкожно был введен налоксон в дозе 4 мг/кг. Через 5 мин у животных повысились страх, агрессивность, восстановилась болевая чувствительность.

Изменения поведения павиана-гамадрила, не получавшего íàлоксон, не омтечалось на протяжении более 6 ч.

Пример 5, Уробактерии (В,Su1fureum) культивируют на мясопептонном бульоне до концентрации 30 — 40 млрд микробных тел в 1 мл, Культуру в количестве 16 л центрифугируют 60 мин при 5 тыс.об/мин. Надосадочную жидкость отбрасывают, Сырую микробную массу взвешивают в 3 л 0,2 М ацетат-уксусного буфера 0.14 М по хлориду натрия (рН 4,8).

Взвесь хорошо перемешивают и подвергают ультразвуковой обработке при частоте 25 кГц. Проводят 3 цикла обработки ультразвуком по 30 мин. Экстрагируют при комнатной температуре при периодическом перемешивании 48 ч.

После этапа экстракции взвесь центрифугируют в течение 60 мин при 5 тыс.об/мин, Надосадочную жидкость отбрасывают. Осадок после промывания дистиллированной водой на центрифуге взвешивают в 4,5 л

0,5 н. раствора соляной кислоты.

Взвесь после перемешивания подвергают ультразвуковой обработке при частоте

25 кГц. Проводят 2 цикла обработки ультразвуком по 30 мин.

Экстрагируют при комнатной температуре при периодическом перемешивании 48 ч.

После этапа экстракции взвесь центрифугируют 60 мин при 5 тыс. об/мин, Надосадочную жидкость декантируют. Осадок отбрасывают.

Надосадочную жидкость фильтруют через 8 — 10 слоев фильтровальной бумаги под вакуумом.

К осветленному фильтрату постепенно приливают 10 объемов охлажденного ацетона и оставляют на 18 ч для отстоя взвеси.

Осадок собирают на двойном бумажном фильтре. дважды промывают холодным ацетоном, снимают с фильтра, переносяг в кр л сталлизатор и помещают R вакуумный сушильный шкаф.

Сушку осуществляют пр л температуре

37 — 380С в течение 4 ч, Полученный сухой продчкт измельчают до порошкообразного состоя., я и готовят

ere 2",ь ный раствор в 0 1 M рлстьорл лимонной кислоты, Для этого навеску продукта вносят в раствор кислоты и периодически i-еремешивают. После набухания белков, что наблюдается через 2 ч, сосуд помещают в водяную баню, постепенно нагревают до 45 С и выдерживают 50 мин до просветления жидкости, После растворения белков и просветления жидкости ее центрифугируют в течение 40 мин при 5 тыс.o6/мин. Надосадочную жидкость подвергают осветляющей, а затем и стерилизующей фильтрации через пластинчатые фильтры.

Раствор разливают по 3 мл в стерильные стеклянные ампулы по 10 мл, заморажио вают на протяжении 24 ч до температуры -50 С и подвергают сублимационному высуши ванию в течение 72 ч при начальной температуре—

35" С до конечной температуры 25 C.

Амулы заполняют азотом и эапаивают.

Каждая ампула содержит 60 мг продукта, а всего было получено 6,9 г препарата.

R качестве экспериметальных животных использовали кроликов, кошек и павиКроликам препарат вводили в ушную вену в дозе 10 мг/кг. Через 3 мин у всех животных(3 кролика) нАступили кататонический ступор, глубокая анальгезия в зоне черепно-мозговых и спинно-мозговых нервов и стойкая вазодилятация микроциркуляторного русла ушных раковин. Анальгезия тканей ушных раковин очень глубокая.

Животные не реагируют на термический фактор даже при обугливании тканей, После развития эффекта (череэ 60 мин) дву л кроликам подкожно в дозе 4 мг/кг был введен налоксон. Через 5 мин наблюдалось восстановление двигательной активности. болевой чувствительности и исчезновение вазодилятации микроциркуляторного русла ушных раковин.

Изменения поведения кролика, не получавшего налоксон, не отмечалось на протяжении более 6 ч, Кошкам препарат вводили в вену бедра в дозе 20 мг/кг, Через 10 мин у всех животных (3 кошки) наступил кататонический ступор, исчезло чувство страха. Через 20 мин наступили глубокий сон и анальгезия в области черепно-мозговых и спинно-мозговых

2000060

Составитель Е. Наймытенко

Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор В. Патраш

Редактор Л. Павлова

Заказ 3052

Тираж Подписное 1ПО "Поиск Роспатента

113035. Mor.êeà, Ж-35. Раушская наб 4/5

Прои аодсз в нно-ичдаепгский комбинат "Патенг < Ужгород. уп Гагарина 101

Посла полного развития эффекта (через

60 мин) двум кошкам подко.кно бып введен напоксон в дозе 4 мг/кг. Через 5 мин восстановились болевая чувствительность, чувство страха, был прерван сон. 5

Изменения поведения кошки, не получавшей напоксон, не отмечалось на протяжении более 6 ч, Павианам-гамадрилам (3 павиана) препарат вводили в вену в дозе 15 мг/кг. Через 10

5 мин после введения препарата у животных исчезли чувство страха и агрессивность, наблюдалась сильная ваэодилятация микроциркуляторного русла головы, Через 15 мин наступила глубокая аналь- 15 гезия в области черепно-мозговых и спинномозговых нервов, После полного развития эффекта (через

60 мин) двум павианам подкожно был введен налоксон в дозе 4 мг/кг. Через 5 мин 20 у животных появились страх и агрессивность, восстановилась болевая чувствительность.

Изменения поведения павиана-гамадрила, не получавшего налоксон. «е отмеча- 25 лось на протяжении более 6 ч.

Формула изобретения

1. Способ получения белков. обладающих сродством к опиатным рецепторам, отлича ющийся ТрМ чтов качегтве белков. обладающих сродством к опиатным рецепторам, используют фракцию кислоторастворимых белков микробной массы с мол,мас. 14 — 94 кД.

2. Способ по п.1. отличающийся тем, что в состав микробной массы включают молочнокислые бактерии, уробактерии, сенную палочку.

3. Способ по и.1, отличающийся тем, что фракцию кислоторастворимых белков получают путем зкстрагирования микробной массы подкисленной водой или подкисленными органическими растворителями с последующим осаждением этой фракции органическими растворителями.

4. Способ по и 1, отличающийся тем, что для подкисления воды или органического растворителя используют соляную кислоту, 5. Способ по п.1, отличающийся тем, что фракцию кислоторастворимых белков подвергают сушке.

6. Способ по пп.1 и 5, о тл и ч а ю щи йс я тем, что перед сушкой или после сушки фракцию киспоторастворимых белков подвергают стерилизации.