Способ выделения альфа @ -макроглобулина и альфа @ - гликопротеина, ассоциированного с беременностью, из плазмы крови

 

Использование в биологии и медицине Сущность способа вначале проводят аффинную хроматографию на иминодиуксуснокислой агарозе со спейсером и элюируют с нее а -макрогпобулин, а затем несорбировавшийся на названной агарозе материал пропускают через иминодиуксуснокислую эгарозу без спейсера, элюируют с нее ассоциированный с беременностью а -гпикопротеин и дочищают его негативной иммуноаффинной хроматографией на 4-бета-оксиэтипсульфонип-2-аминоа низол-агарозе с иммобилизованными антителами против белков сыворотки крови мужчин

(ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ йН " 8| | -YBH5()gggg " |иоти<

К ПАТЕНТУ Э (Р

CO

CO

Q0

Комитет Российской Федерации по патентам и тоеариым знакам (21) 5004900/14 (22) 01.08.91 (46) 15.10.93 Бюп. N() 37-38 (71) Новокузнецкий государственный институт усовершенствования врачей (72) Зорин НА.; Жабин СГ (73) Зорин Николай Алексеевич; Жабин Сергей

Геннадьевич (54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ АЛЬФАЕ-МАКРОГЛОБУЛИНА И АЛЬФА9 — ГЛИКОПРОТЕИНА, АССОЦИИРОВАННОГО С БЕРЕМЕННОСТЬЮ, ИЗ ПЛАЗМЪ| КРОВИ (57) Использование в биологии и медицине Сущ(t9) RU (и) 2000809(„т (51) 5 А 61 К 37/04 А 61 К 39 395 ность способа вначале проводят аффинную хрома)ографию на иминодиуксуснокислой агарозе со спейсером и злюируют с нее а. -макрогпобулин, а г затем несорбировавшийся на названной агарозе материал пропускают через иминодиуксуснокислую агарозу без спейсера, элюируют с нее ассоциированный с беременностью а -гпикопротеин и дочиг щают его негативной иммуноаффинной хроматографией на 4-бета-оксиэтилсупьфонил-2-аминоанизол-агарозе с иммобипизованными антителами против белков сыворотки крови мужчин

2000809

Изобретение относится к биологической химии, а именно к биотехнологии, и может быть использовано в биологии и медицине. Ассоциированный с беременностью альфа2-гликопротеин (АБГ) и альфаг-макроглобулин (МГ) являются белками-гомологами, обладают способностью подавлять активность протеиназ и мощным иммуномодулирующим действием.

Цель изобретения — упрощение способа последовательного извлечения МГ и АБГ иэ плазмы крови беременных женщин путем сокращения количества этапов очистки и их общей продолжительности, а также получение белков высокой степени чистоты.

Способ осуществляют следующим образом. На первом этапе очистки проводятся цинк-хелатная хроматография на иминодиуксуснокислой агарозе со спейсером, состоящем из 6 атомов углерода (малое предприятие "Эстар". ЭССР). АБГ совершенно не взаимодействует с этим гелем, тогда как весь МГ сорбируется на нем. Элюцию МГ проводят в условиях градиента рН

7.0 — 5,0. Его чистота после этого превышает

95 7ь, а выход составляет 39 ь (1,1 г иэ 1 л плазмы крови), что существенно выше, чем в способе-прототипе, Белки, свободно прошедшие через иминодиуксуснокислую агарозу со спейсером, в том числе и АБГ без диализа пропускают через иминодиуксуснокислую агарозу без спейсера. Элюцию

АБГ осуществляют аналогично, как и МГ.

Фракции, содержащие АБГ, без концентрирования пропускают через колонку 4-P-о сиэтилсульфонил-2 -аминоанизолагарозы с иммобилиэованными антителами против сыворотки крови мужчин, Заключительный выход АБГ, имеющего чистоту более 95, составляют 30 (0,18 г из 1 л плазмы крови), что существенно больше, чем в способе; пэототипе, Пример 1, В 100 мл плазмы крови беременных женщин добавляют сухой хлористый натрий до концентрации 1 м и подтитровывают ее до рН 8,0. Затем наносят плазму на колонку (2,6 см х 10 см). содержащую 50 мл иминодиуксуснокислой агарозы со спейсером (6 атомов углерода). Иминодиуксуснокислую агароэу предварительно переводят в цинк-форму; последовательно пропускают через нее 200 мл 0,05 M раствора трилона Б, 200 мл дистиллированной воды, 200 мл 0,05 M раствора сульфата цинка, 200 мл дистиллированной воды, 200 мл 0,02

M фосфатного буфера, рН 8,0, содержащего

1 М хлористого натрия. Затем после внесения плазмы крови колонку отмывают стартовым буфером и проводят элюирование в градиенте рН 7,0-5.0. Для э1ого используют

0.02 М фосфатный буфер рН 7,0 содержащий 1 Мхлористого натрия и 0,,02 М фосфатно-лимоннокислый буфер, рН 5.0, а также содержащий 1 М хлористого натрия. Суммарный объем обоих буферов равен 300 мл.

Фракции объемом 5 мл определяют с помощью ракетного иммуноэлектрофореза и затем их собирают. Концентрированные препарата МГ, как правило, не проводятся, поскольку белок снимается с иминодиуксуснокислой агарозы достаточно "острым" пиком, Белковый материал, не связанный со спеисерированной иминодиуксуснокислой агарозой, без диализа наносят на колонку (2,6 см х 10 cM), содержащую 50 мл иминодиуксуснокислой агарозы беэ спейсера (малое предприятие "Эстар". ЭССР), находящуюся в цинк-форме и предварительно уравновешенную 0,02 М фосфатным буфером, рН 8.0 с 1 M хлористого натрия, Примесные белки удаляют с геля стартовым буфером, затем проводят элюирование связавшихся с агарозой белков е градиенте рН

7,0-5,0 описанным способом. Фракции, содержащие АБГ, находят с помощью ракетного иммуноэлектрофореза, сливают их и наносят на колонну (1 см х 20 cM), заполненную 14 мл 4-/3-оксиэтилсульфонил-2-аминоаниэол-агарозы с присоединенными аффинноочищенными козьими антителами против белков сыворотки крови мужчин, Для синтеза последнего сорбента используют смесь сывороток крови мужчин с низким уровнем АБГ, Белки из этой смеси присоединяют к 4-P- оксиэтилсульфонил-2-аминоаниэол-агарозе путем диазотирования с помощью полученного сорбента извлекают антитела из козьей антисыворотки против всех белков сыворотки крови человека, данные антитела аммобилизуют на 4-,В-оксиэтилсульфонил-2- аминоанизол-агарозе путем диазотирования.

Заключительный выход МГ после 10 экспериментов колебался от 38 до 42 /, в среднем 39 (1,1 г из 1 л плазмы крови), а АБà — от 28 до 31, в среднем 30 (0.18 г иэ 1 л плазмы крови), Для оценки чистоты и нативности полученных препаратов АБГ и МГ использовали комплекс электрофоретических методов, различные варианты иммуноэлектрофореза, аминокислотный анализ, излучали реакции белков с различными ферментами. По данным электрофореза в градиенте пор полиакриламидного геля мол. м. МГ составляет 720 КДа, АБГ 360 КДа. При исследовании полученных препаратов белков электрофорезом в полиакриламидном геле в восстанаоаливающих

2000809

Составитель Л.Пуришева

Редактор Г.Мельникова Техред M.Moðråíòàë Корректор Н.Кешеля

Тираж Подписное

НПО "Приск" Роспатента

113035, Москва, Ж-35, Раушская нэб., 4/5

Заказ 3097

Произвсдс; л :, нл-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул,Гагарина. 101 условиях с додецилсульфатом натрия определено, что мол. M. полипептидных цепей, как МГ так и АБГ равняется 180 КДэ, При окрашивании полиакриламидных гелей с помощью высокочувствительных методов. в 5 частности импоегнирования серебром, примесные белки в препаратах АБГ и МГ не обнаружены. При изозлектрическом фокусировании в градиенте амфолитов в агарозном гелеизозлектрическая точка обоих 10 белков находится в зоне pH 4,7, что соответствует известным данным. В соответствии с ними находятся также полученные характеристики аминокислотного и углеводного составов, Тестирование препаратов АБГ и 15

МГ с помощью перекрестного иммуноэлектрофореза показало, что выделенные белки имеют подвижность эльфа2-глобулинов и не содержат примеси иных белков, Последние данные были получены при использовании 20 гетерологических энтисывороток (козьих, бараньих, кроличьих). Выделенные белки ингибировали протеолитическую активность плэзмина, тромбинэ, коллагеназы, трипсина и других протеиназ в соотношени- 25 ях, близких к эквимолярным, что свидетельствует об их высокой нативности.

Многократная иммунизация кроликов препаратами данных белков в течение 1 года продемонстрировала их высокую чистоту: 30 после каждой реил1мунизации кролики продуцировали моноспецифические антитела против указанных белков. При исследова-. нии методами перекрестного иммуноэлектрофореза и имл унодиффузии препарата 35

Формула изобретения

СПОСОБ ВЫДЕЛЕ t tt t ß АЛЬФА-МАКРОГЛОБУЛИНА

И АЛЬФА-ГЛИКОПРОТЕИНА, АССОЦИИРОВАННОГО С БЕРЕМЕННОСТЫО, ИЗ ПЛАЗМЫ КРОВИ ПУтем хромотографического разделения, отличающийся тем, что проводят аффинную хромотографию на иминодиуксуснокислой агароэе со спейсером, элюируют альфа2макроглобулин, несорбировавшиеся белки

АБГ и антисыворотки против МГ, а также препарата МГ и энтисыворотки против АБГ какая-либо перекрестная реактивность не обнаружена, Последние результаты свидетельствуют об отсутствии какой-либо контаминации АБГ и МГ друг другом. Таким образом полученные данные указывают на то, что чистота АБГ и МГ превышает 95 ф, и их нэтивность практически не изменяется в ходе очистки.

Пример 2. К 100 мл сыворотки ретроплацентарной крови (ретроплацентарная кровь — это кровь беременных женщин, которая вытекает свободно в процессе родов и может содержать небольшие примеси крови плода и околоплодных вод) добавляют сухой хлористый натрий до концентрации 1

М и подтитровывают ее раствором трехзамещенного фосфата натрия до рН 8,0. Дальнейшие этапы очистки также аналогичны таковым в примере 1. Выход МГ и в 10 экспериментах колебался от 37 до 43 $, в среднем 39 (1,1 гиэ1л), выходАБГот29 до

31 6, в среднем 30 о(, (0,18 г иэ 1 л). Весь перечисленный в примере 1 комплекс иммунохимических и биохимических методов свидетельствовал о высокой нэтивности

АБГ и МГ, а также о том, что их чистота превышала 95 . (56) Sand О and ect Characterlzarlon of human

pregnancy zone protein. Comparison with

Ruman alpha2-macroglobulin llJ. Biol.

Chemistry.-1985. - Vol. 260.— P.15723 — 15735. пропускают дополнительно через иминодиуксуснокислую агароэу без спейсера, элюируют с нее ассоциированный с беременностью альфа2 - гликопротеин с последующей очисткой на

4-бетаоксиэтилсульфонил-2-аминоанизолагарозе с иммобилиэованными антителами против белков сыворотки крови мужчин.

Способ выделения альфа @ -макроглобулина и альфа @ - гликопротеина, ассоциированного с беременностью, из плазмы крови Способ выделения альфа @ -макроглобулина и альфа @ - гликопротеина, ассоциированного с беременностью, из плазмы крови Способ выделения альфа @ -макроглобулина и альфа @ - гликопротеина, ассоциированного с беременностью, из плазмы крови 

 

Похожие патенты:

Изобретение относится к медицине и касается серотерапии вирусных заболеваний , может быть внедрено в практику работы клиник нервных болезней

Изобретение относится к медицине, в частности к эндокринологии
Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, и может быть использовано для иммунотерапии и иммунопрофилактики бактериальных и вирусных заболеваний, в том числе ротавирусной инфекции

Изобретение относится к медицине, а именно, к фармакотерапии инфекционных болезней

Изобретение относится к педиатрии, в частности к лечению инфекционных заболеваний

Изобретение относится к биологической химии и касается способа получения трофобластического бета 1-гликопротеина

Изобретение относится к медицине, а именно к фармакологии, Цель изобретения - придание композиции противовирусного и иммуномодулирующего свойств

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для активации естественных защитных сил организма
Наверх