Пептиды или их фармацевтически приемлемые соли, обладающие антагонистической активностью в отношение бомбезина

 

Использование, медицина, в качестве антагониста бомбезина Сущность изобретения пептиды общей формулы A-b-c-D-Gtu-Trp-Ala- Va - X - Y - Т - W. где А-водврод, ВОС и ацетильная группа. Lys - Gly, Lys (Boc) - Gly или простая связь; mMel или Leu - Gly, причем один из В или С представляет р - Met или mMet или простая связь, X « Gly или простая связь, у dPhe, His, ), T«heu или пропан связь. . MetNH2 или NHJCH CH или их фармацевтически приемлемые сопи. 3 табл.

(19) КЦ (11) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

Комитет Российской Федерации по патентам и товарным знакам (21) 4743471/04 (22) 20.03.90

{46) 30.10.93 Бюп N() 39-40 (71) Фармиталиа Карпо Эрба С рл. (lr)

{72) Роберто де Кастильоне(!Т); Мауро Гапантино((Т); Фабио Корради(!Т); Луиджа Гоццини(!Т), Марина Чомеи((Т), Изабелла Мопинари(!Т) (73) Фармиталиа Карло Эрба С рл ((т) (54) ПЕПТИДЫ ИЛИ ИХ ФАРМАЦЕВТ ИЧЕСКИ

ПРИЕМЛЕМЫЕ СОЛИ, ОБЛАДАЮЩИЕ АНТАГОНИСТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ В ОТНОШЕНИЕ БОМБЕЗИНА (5Ц5 С07К7 06 С07К 08

А61К 7 02 (57) Использование: медицина, в качестве антагониста бомбезина Сущность изобретения пептиды общей формулы А — Ь вЂ” с — О - Qu — Trp — Ah—

Ча! — Х вЂ” Y — Т вЂ” W, где А-водород. 80С и ацетильная группа, B mMet Lys - Qy, Lys (8ос) — Оу или простая связь, C=pMet, mMet или Leu — Gly, причем один из В или С представляет р — Met unu

mMet, 0=Thr ипи простая связь, Х Gly ипи простая связь, у dPhe, H(s, Н(в(0пр), Т те(.1 или простая связь, Ю/ОН, МеФН ипи NH(CH СН или их г 4 фармацевтически приемлемые сопи 3 та и.

2001918

Изобретение относится к пептидам или их фармвцевтичвски приемлемым солям— новым биологически активным соединениям, обладающим биологической активностью в отношении бомбеэина, которые могут найти применение в биологии и медицине.

Известны пептиды — антагонисты бомбезина, однако эти пептиды обладают слабой аффинностью по отношению к 10 бомбезиновым рецепторам, Цель изобретения — поиск новых производных в ряду пептидов. малотоксичных и обладающих более высокой активностью в отношении бомбезина. 15

Поставленная цель достигается описываемыми пептидами общей формулы 1:

А-В-С-D — Gln-Trp — А! а — Val — X-Y-T-И/, где А - водород, Вос и ацетильная группа

8 - m-Met, Lys-Gly, Lys (Вос)-Gly или простая связь.

С - р — Met. m-Met, или Leu-Gly, причем один из В или С представляет собой

p — Met или m — Met 25

О - Thr или простая связь

X - Gty или простая связь, У = DPhe, Hls, Hls (Dnp)

Т - Leu или простая связь

W - ОН. MetNHz, NH(CHz)4CHz, 30 или их фармацевтически приемлемые соли. обладающие антагонистической активностью в отношении бомбезина.

В описании использованы сокращения:

Трехбуквенные символы аминокислот обозначают L — конфигурацию хиральных аминокислот. 0 — аминокислоты обозначены маленькими буквами, например, аЬ =

0-Ala. Другие использованные символы и сокращения: АА — аминокислота; AcOEt — 40 этилацетат; AcOH — уксусная кислота; Вк — бензил; ВBS — бомбезин; Вос — т-бутилоксикарбонил; BuOH — бутиловый спирт; CCD— распределение против направления; DCC—

N,N-дициклогексилкарбодиимид; разл. — 45 разложение; D MAP — 4-метиламинопиридин; ДМФ вЂ” диметилформамид; Dnp — 2,4динитрофенил; ЕСС вЂ” эгилхлоркарбонат;

Et?O — диэтиловый эфир; Glp — (-пироглутаминовая кислота; h — GRP (или р-GRP) — чело- 50 веческий (или свиной} пептид, выделяющийся в желудочно-кишечном тракте: HCI/АсОН вЂ” сухой HCI в безводной уксусной кислоте; НО — 1-гидроксибенэотриазол; l.c.v. — внутрицереброжелудочковый; МеОН вЂ” метиловый спирт; т.пл.— температура плавления; гпМе = м-бис (2хлорэтил/амино-L-фенилаланин; н.о. — не определяли); NMM — N-метилморфолин; рМе(- и-бис(2-хлорэтил)амино-L-фенилаланин ЖХВД жидкостная хроматография высокого давления: OSu — N-гидроксисукцинимидил; ТФК вЂ” трифторуксусная кислота;

ТГФ вЂ” тетрагидрофуран; TCX — тонкослойная хроматография; ToS — и-толуолсульфонил; TSOH — и-толуолсульфокислота: Z— бензилоксикарбонил.

Химия.

Синтез пептидов по изобретению можно проводить классическими способами в растворе. Синтез включает в основном последовательную конденсацию замещенных аминокислот или пептидов, Конденсацию проводят до получения результирующего пептида, имеющего нужную последовательнОсть аминокислотных остатков, Аминокислоты и пептиды, которые можно кзнденсировать способами, известными в пептидной химии, имеют аминогруппы и кэг,боксильные группы. Не участвующие в образовании пептидной связи, блокирован":ле подходящими защитными группами, способными удаляться кислотной или щелочной обработкой либо гидрогенолизом.

Для защиты аминогруппы можно использовать. например, следующие защитные группы: бенэилоксикарбонил, т-бутоксикарбонил, тритил, формил, трифторацетил, с-нитрофенилсульфенил. 4-метоксибензилоксикарбонил, 9-фторфенилметоксикарбонил, 3,5-диметокси-a а диметилбензилоксикарбонил или метилсульфонилэтоксикарбонил, Для защиты карбоксильной группы можно испольэовать, например, следующие защитные группы: метил, этил. т-бутил. бензил, и-нитробенэил или фторфенилмвтил. амид, гидразид, т-бутоксикарбонилгидразид или бензилоксикарбонилгидразид.

Гидрокси-группы гидрокси-аминокислот и иминогруппы гистидина можно защитить подходящими защитными группами (в ходе всего синтеза или только на некоторых стадиях) или их можно оставить незащищенными. Для защиты гидрокси-группы можно использовать, например, следующие защитные группы; т-бутил, бензил, ацетил. Для защиты имидазольной иминогруппы можно использовать, например, следующие группы: 2.4-динитрофенил, тоэил, бензил. Реакции снятия защиты проводят способами, известными в химии пептидов.

Конденсацию аминогруппы одной молекулы с карбоксильной группой другой молекулы можно проводить с использованием активированных ацильных производных, таких, как смешанный ангидрид, аэид, или активированный эфир, либо прямой конденсацией карбоксильной группы с аминогруппой в присутствии конденсирующего

2001918 агента, такого, как дициклогексилкарбодиимид, используемый индивидуально или вместе с агентом, предотвращающим рацемизацию, таким. как N-гидроксисукцинимид или 1-гидроксибензотриаэол, либо вместе с активирующим агентом. таким, как

4-диметиламинопиридин. Конденсацию можно проводить в растворителе, таком. как диметилформамид, диметилацетамид, пиридин, ацетонитрил, тетрагидрофуран или N-метил-2-пирролидин.

Реакционная температура может лежать в интервале от — 30 С до комнатной температуры, Время проведения реакции составляет. как правило. от 1 до 120 ч.

Схему синтеза, защитные группы и конденсирующие агенты выбирают таким образом, чтобы избежать риска рацемизации.

Значе ия Rf определяют на покрытых пластинках с силикагелем 60 Fgs< (Merck), толщина слоя 0,25 мм. длина 20 см, с использованием следующих проявляющих систем:

Система А: этилацетат/бензол/уксусная кислота/вода == 500/500/100/50 по объему (верхняя фаза).

Система В. этилацетат/бензол/уксусная кислота/вора =- 500/500/200/75 по объему (верхняя фаза).

Система С; н-бутанол/уксусная кислота/вода = 600/150/150 по объему.

Система D хлороформ/метанол/NH40H 30 = 488/338/150 по обьему.

Система Е: хлороформ!метанол = 90/10 по обьему.

Система 6: толуол/этилацетат/уксусная кислота/вода =- 100/100/20/10 по обьему.

ТСХ-Анализ проводили при температуре 18-25 С, изменения значения Rf сосгаеляли+ 5, Жидкостную хроматографию высокого давления (ЖХВД) проводили с использованием хроматографа Hewlett-Packard 1084В с УФ-детектором, работающим на 210 нм, Пептиды разделяли на колонке Llchrosorb

RP 18 5 мкм размером 4 х 250 мм. Использовали следующие растворители:

А) 0,02 M KHgPOq, доведенный до рН

3,53 НзРО /СНзСИ = 9/1 по обьему.

В) 0,02 M КН2РОа доведенный до рН

3,53 о НзР04/СНзС1ч " 3/7 по объему.

Злюирование проводили по программе с линейным градиентом от 60 до 907ь В в течение 20 мин (система А) или от 30 до 70

В в течение 15 мин (система В) и затем в течение 15 мин при скорости потока 1 мл/мин, Пептиды характеризуют по времени уде ржи в ан и я (R Т).

Э5

Аминокислотный анализ проводят с использованием кислотных гидролиэатов (либо при 110 С в течение 22 ч в б í HCI+ 0.1 фенола, либо при 100 С в течение 16 ч в Э н. меркаптоэтансульфоки<;лоте. во всех случаях в атмосфере азота), Определяют остатки лишь природных аминокислот из-эа разложения в нормальных условиях гидролиза, триптофил определяют лишь в гидролиэатах с сульфокислотой.

Пример 1. Boc-pMet-Glu-Trp — AlaVal Gly-ОН (III)

Стадия 1. BOC-рМеiОН (I)

0.684 r (1,85 ммоль) KpMet OSt.HCI u

0.485 г (2,2 ммоль) (ВОС) 0 растворяют в 40 мл воры и 8 мл т-бутанола. Раствор доводят до рН 10 1 н. NaOH, перемешивают 15 мин, затем прибавляют 40 мл воды и 110 мл

МеОН и рН доводят до 13,5 с помощью 1 н.

NaOK. Реакционную смесь перемешивают

1 ч при комнатной температуре, затем доводят до рН 8.5 с помощью 1 н. HCI и концентрируют под вакуумом. Водный раствор промывают н-гексаном (4 х 30 мл), затем охлаждают до — 5 С, подкисляют до рН 2 с помощью 1 н. HCI при перемешивании и экстрагируют охлажденным этилацетатом (4 х 30 мл).

Органические слои объединяют, промывают до нейтральной реакции насыщенным раствором хлорида натрия, сушат над безводным сульфатом натрия. Фильтруют и выпаривают под вакуумом. Остаток растворяют в смеси хлористый метилен/уксусная кислота 99/1 и очищают хроматографией на силикагеле, элюируя той же смесью растворителей. В виде масла получают 0.7 г (выход 77,8 ) продукта I; RFA - 0.70.

Стадия 2. BocpMet-Glu-Trp-Ala-ValGly-OBzl (II)

В 10 мл безводного тетрагидрофурана растворяют 0,6 г BocpMetOH (!) (1,48 ммоль).

Раствор охлаждают до — 20 С и послеровательно прибавляют 0,16 мл (1,48 ммоль)

NMM и 0,15 мл (1,48 ммоль) ЕСС, После 2 мин перемешивания при этой температуре прибавляют холодный раствор 1,02 г (1,48 ммоль) Н-6!о-Тгр-Ala-Ча)-Gly.OBzl.НCI, 0,16 мл (1.48 ммоль) NMM в 10 мл безводного диметилформамида . Реакционную смесь перемешивают 2 ч при температуре от—

10 С до — 15 С, фильтруют выпаривают под вакуумом.

Остаток растворяют в 20 мл диметил- формамида и по каплям выливают в 40 мл

10ф>-ного раствора лимонной кислоты при

5 С. Смесь перемешивают 1 ч при температуре ниже 1О С, фильтруют и промывают

2001918 водой до нейтральной реакции. Получают l,4 г (выход 91.57ь продукта II; Rfg - 0,48).

Стадия 3. BocpMet-Glu-Trp-Ala-Val61уОН (Itl)

0,44 г 10ф,-ного палладия на угле и 24 мл теплого раствора, полученного из 1,2 мл

HC00H,3,3 мл NMM и 100 мл МеОН прибавляют к раствору 1,2 г (1,16 ммоль) ВосрМв1-01п-Тгр-А!а-Val Gty-OBzt (II) в 24 мл безводного ДМФ. Реакционную смесь перемешивают 15 мин при 40 С, затем охлаждают до комнатной температуры. фильтруют и выпаривают под вакуумом. Остаток растворяют в ДМФ и осаждают этилацетэтом, получая 1,1 г сырого продукта.

Продукт очищают противоточным распределением в следующей системе растворителей: вода ДМФ (н-бутанол)этилацетата--40/3/20/80. Фракции, содержащие чистый продукт, соединяют и выпаривают под вакуумом. Остаток растирают в ДМФ, МеОН и этилэцетэте, получая 0,680 r (выход

63 ) продукта 111: RfD - 0,54; RTp, - 8,4; АА — отношения; Glu 0,93 (I), Gly 0,99 (I); Ala 0,99 (l). Yal (Тгр и pMet не определяют).

Пример 2. Вос-pMet-Glu-Trp-А!aVat-61у-HIs (Опр)-Leu-МеЮ Н2 (И).

К раствору 0,330 г (0,35 ммоль)

BocpMet-Gtu-Trp-Ata Val — GlyOH (I ti) в 3 мл безводного ДМФ, последовательно прибавляют 0,053 r (0,39 ммоль) безводного HOBt, 0.081 г(0,39 ммоль) DCC, 0,235 г (0,39 бемоль)

Н-His (0пр)-Leu-Met-МН2 HCI и 0,043 мл (0.39 ммоль) NMM. Реакционную смесь перемешивают 1 ч при 0 С и 30 ч при комнатной температуре. затем фильтруют г выпаривают под вакуумом, Остаток растворяют в 3 мл безводного ДМФ и Ilo каплям при температуре ниже 10 С прибавляют к

30 мл водного раствора 6 г хлорида натрия и 3 г лимонной кислоты. После перемешивания в течение I ч при температуре ниже

10 С суспензию фильтруют и продукт промывают до нейтральной реакции. Сырой продукт дважды выпаривают из 10 мл безводного ДМФ, растворяют в 3 мл безводного ДМФ и по каплям прибавляют к водному раствору 1,5 г йаНСОз и 6 г NaCI при температуре ниже 10 С, Смесь перемешивают

1 ч, фильтруют, промывают водой до нейтральности и получают 0,5 r (выход 95.67) продукте IV: Rfp - 0,84, ЙТА = 21,2; AA— отношения: Тгр 0,97 (t), Giu 1,00 (!), Gly i, Ala

1,00 (!), Vat 1,00 (I), Met 1.10 (!), 1.еи 1,04 (!) (pMet, His (Опр) не определяли).

Пример 3. HpMet-Glu-Trp-Ata-VatGly-Hls (Dnp)-Leu-Мет14Нг HCI (V)

0,100 r (0,067 ммоль) ВоС-pMet-GtuTrp-Аlа-Val-Gly-His (Dnp)-1.еи-MetNH2 (I V) вводят в реакцию с 1 мл 1-,33 í. HCI/уксус5

55 ная кислота, содержащим 0,2 мл 2-меркаптоэтанола и 0,1 мл анизола, Реакционную смесь перемешивают 30 мин при комнатной температуре и выпаривают под вакуумом, Остаток растирают с эфиром и получают

0.080 г (выход 83,5 ) продукта Y: Rfc - 0,57;

RTA = 9,3; АА — отношения: Glu 0,99 (1), Gly

0,98 (I), Ata 1,04 (1). Vat 1,10 (1), Met 0,82 (1), Leu

0.81 (I). (Trp, p Met u His (Опр) не определяли).

Пример 4. Вос-pMet-Glu-Ala-ValGly-Н1з-Leu-MetNHz (И)

0,4 г (0,27 ммоль) Вос-pMet-Glu — Trp—

Ata-VaI-Gly His (0np) 1еи-Met-NHz (IV) растворяют в 400 мл безводного ДМФ и затем прибавляют 5.36 мл 0,1 М КН2Р04 (с рН. доведенным до 8.1 с помощью 1Н КОН) и 20 мл 2-меркаптоэтанола, Реакционную смесь перемешивают 2 ч при комнатной температуре и концентрируют под вакуумом. Остаток очищают противоточной экстракцией в следующей системе растворителей: вода/н-бутанол/уксусная кислота = 40/35/1, Фракции, содержащие чистый продукт. собирают и выпаривают под вакуумом,.получая 0,35 г (теоретический выход) продукта Ч1: Rfc = 0,63; Rfo - 0,82:

ВТд = 14,2; AA — отношения: Glu 1, Gty 1.00 (I); AIa 1,04. (I), Val 1.04 (1); Met 0,94 (1), Leu 1,02 (I), His 0,95 (I), Trp 0,88(I)(pMet не определяли).

Пример 5. Н вЂ” pMet-Glu-Trp-Ala — ValGiy — His-t eu-Met — NHz 2НС! (Vll)

С 0,1 г (0,075 ммоль) Вос-pMet GluТтр-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2 (VI) cwмают защиту аналогично примеру 3 и получают 0,089 г (выход 91 ) продукта VII:

RI = 0,45; RTB = 11,3; АА — отношения: Glu

1,06 (!), Gly 1.00 (I), Ata 0.99 (i), Val, Met 0,94 (I), Leu 0,96 (!), His 0,94 (I) (Trp и pMet не определяли).

Пример 6. Вос-pMet.Glu-Trp-А!aVai- Gly-Phe-Leu MetNHg (Vill)

0,15 г (0,16 ммоль) Вос-рМес-Glu-TrpAia-Vai Gly-0H (lll) растворяют в 12 мл безводного ДМФ и прибавляют 0,023 r (0,169 ммоль) безводного HOBt. К раствору, охлажденному до 0 С, последовательно прибавляют 0,041 r (0,177 ммоль) ОСС, 0,085 г(0,192 ммоль) Н вЂ” Phe -Leu-Met-МН2 НО и 0,022 мл

NMM (0.192 ммоль).

После перемешивания 15 мин при 00С прибавляют 0,02 г (0,016 ммоль) ОМАР. Реакционную смесь перемешивают 1 ч при 0 С и ночь при комнатной температуре, затем фильтруют и выпаривают под вакуумом. Остаток растворяют в 3 мл безводного ДМФ и по каплям прибавляют в 30 мл водного раствора 3 г лимонной кислоты и 6 г хлорида натрия при температуре ниже 10 С. После перемешивания в течение 1 ч осадок от2001918

10 фильтров-, вают и промывают водой до нейтральной реакции. Затем продукт растворяют в 10 мл безводного ДМФ и выпаривают г>од вакуумом. Остаток растирают с эфиром и получают 0,190 г (88,8 ) сырого продукта

VIII. Образец очищают обращенно-фазовой полупрепаративной ЖХВД с линейной градиентной системой 0,05 ТФК (А) и 0,05

ТФ К (С!-!зСМ = 3/7 (В) от 70 до 907 . B; Rfc:=0,85, RTA = 18,4; АА-отношения: Glu 0,90 (!), Gly 1,14 (I), Ala 1.02 (!), Val 0,99 (I); Met 0,91 (!), 1.ец 1,08 (I), РНе 0,96 (I), Тгр 0,96 (!) (pMet не определяли).

Пример 7, Вос-mMet Glu-Trp-А!аVa I-6 !у О Н (I X)

Целевое соединение получают аналогично примеру 1, исходя из Вос-и Мет--ОН, полученного из H-mMet-OH . Rfo = 0,56:

RT>t = 0,5о; AA-отношения Clu 0 93 (!), Gly

0,95 (I), Ala 0.95 (!), Val (Tr p u mMet не определя ли), >1 г. и с р 8. BocmMet eu -Gly Thr

Glu-Òrð -AIa-Val Gly- Leu- MetNI t (Х! >>)

Стадия 1. Вос Leu Gly OBzl (X)

2,33 мл (20,7 ммоль) NMM и 2,9 мл (20, 7 ммоль) изобутилхлоркарбоната последовательно прибавляют к раствору. охл:.>жденному до — 25 С, 4,8 г (20,7 ммоль) Бг>с Låu ОН в 70 мл безводного ТГФ. Поспи пе!>емешивания реакционной смеси 3 мин при >емоературе около — 12"C прибавля>о> олпдныи раствор 6,98 г (20,7 ммо»,) II Gly

OBzI,ÒsOÍ и 2,33 мл (20,7 ммоль) ГJMM в 50 мл безводного ДМФ. Реакционную смесь перемешивают 45 мин при температуре около — 12 С и 90 мин при 0"С, фильтруют и выпаривают под вакуумом. Остаток растворяют в этилацетате и несколько раз тщательно последовательно промывают

10 -ным водным раствором лимонной кислоты, раствором соли, 5 -ным раствором

МаНСОз и снова раствором соли. Органический слой сушат над безводным сульфатом натрия, растворитель удаляют под вакуумом и получают 7,8 г (выход 100 ) соединения Х в виде масла; Rfr =- 0,83: РТд — 13.6, Стадия 2. HLeu-Gly -OBzl. HCI (XI)

С, 7.4 r (19,6 ммоль) Вос-Leu -Gly-OBzl (X) снимают защиту так. как описано в примере 3. Остаток в виде масла несколько раз растирают с петролейным эфиром и получают 3,94 г (выход 63,8 ) соединения XI: Rfc =

=0 59.

Стадия 3. Вос-mMet-Leu -Gly-OBzl (XII), 5,7 г (12,51 ммоль) Вос mMet-OH u

3.94 r (12,51 ммоль) Н-Leu-Gly-OBzl, НС! (XI) хонденсиру>от так, как описано в примере 1 (стадия 2), Остаток растворяют в этилацетате и несколько раэ последовательно промывают 10 -ным раствором лимонной

55 кислоты, раствором соли, 5 -ным раствором МаНСОз и снова раствором соли. Органический слой сушат над безводным сульфатом натрия и растворитель удаляют под вакуумом, Остаток очищают колоночной хроматографией на силикагеле, элюируя смесью этилацетат/серный эфир 1/7. В виде пены получают 6,25 r (выход 75 ) продукта XII; Rfp - 0,80, Стадия 4. Boc-mMet-Leu-Gly-OÍ (XIII).

6.0 г (9.0 ммоль) Boc-mMet-Leu-Gly0Bzl (XII) обрабатывают так, как описано в стадии 3 примера 1. Остаток растирают в смеси этилацетат/серный эфир/петролейный эфир и получают 4,3 г (выход 837,) соединения XIII; Rft = 0,43.

Стадия 5. Вос- mMet-! eu-Gly-Thr-GluTrp-А!а-Val-Gly-I eu- Jlet- ИН2 (XIV), 0 092 г (О 16 ммоль) Boc-mMet-t eu — GlyOH (XIII) и 0,105 r (0.16 ммоль) HThr-GluTrp Ala \/а! Gly Leu- MetNHz HCI конденс>1py>ot аналогично примеру 2, После выпаривания растворителя остаток растворяют в

10 мл ДМФ. по каплям прибавляют к 100 мл

10 /,-ного раствора лимонной кислоты, перемешивают 15 мин. фильтруют и промывают до нейтральной реакции. Сырой продукт растворяют в 30 мл ДМФ и выпаривают под вакуумом. Остаток растирают со смесью

ДМФ/МеОН (зтилацетат/серный эфир) и получают 0,17 г (выход 72.7 ) сырого соединения XIV. Образец очищают полупрепаративнои ЖХВД. как описано в примере 6;

Rfc 0,84: ЯТд =- 16,5; АА-отношения: Thr

0.94 (I), Glu 1,06 (!), Gly 2,12 (2), Ala 0,94 (1).

Val 0.94 (1). М>;т 1,00 (1). Leu 2, Trp 0,87 (1) (mMet н.о.).

Аналогичным образом синтезируют также следующие пептиды.

X V — Н -p M et-G lu- T rp-Ala-Va I-G lyPhe-Leu-Met-МН2 Н С!

Rfc 0,72; RTA 9,6

ХИ вЂ” Вос-mMet-Glu-Тгр-Ala-Val-GlyH s (Dr> p)-Leu-MetNHz

Rfp 0,86; НТд 21.5; АА-отношения. Glu 1;

G I y 0,99 (1); Ala 1,03 (1), Val 0,99 (1), Met 1,03 (1), I eu 1,04 (1), Тгр 1,05(1)(mMet и His (Опр) н.о.).

XV!! HmMet-Glu Òãð-А!а-Val Gly-His (Dr>p)-Leu-MetNHz НС!

Rfc 0,74; RTA 9,4; АА-отношения: Glu

0,99 (1), Gly 1,04 (1), Ala 1,02 (1), Val (1), Met

0,96 (1), еи 0,96 (1) (His (Dnp) Trp u mMet н,о.).

ХИ!! Boc — mMet — Glu — Trp — Ala-Val-GlyHis Lеи-MetNHz СГзСООН

Rfc 0,55; Rfct 0.80; ЯТд 14,4; AA-отношения: Glu (1), Gly 0,99 (1), Ala 0.99 (1), Val 1,06 (1j, Met 1,05(1), Leu 0,97 (1), His 0,90(1), Trp

1.03 (1) (mlVlet н.о.).

2001918

XIX HmMet — Glu-Trp-Аlа-Val-G ly-HlsLeu — Met14Hz 2НС!

Rfc 0,44; ВТц 11.3; АА-отношения; Glu

1,00 (1), Gly 1.00 (1), Ala 1,05 (1), Val (1), Met

0,91 (1). Leu 0,89 (1), His 0,99 (1). (mMet и Тгр 5 н.о.)

ХХ Вос — mMet-Glu-Trp-Àià-Val-G IyLeu-МеЮНг

Rfr. 0,74; RTA 15,4. АА-отношения; Glu

1,03 (1). Gly 1, Ala 1,04 (1), Val 0,96 (1). Met 10

0,93 (1), Leu 1,02 (1), Тгр 0,94 (1) (mMet н.о.).

ХХ! HmMet-Glu — Тгр-А1а — Val-Giy LeuMetNHz НС!

Rfc 0,65; RTA 5,7

ХХ!! HmMet — Leu — Gly — Thr — Glu-Trp-А1а- 15

Val GIy LeuNHz ÍCI

Rfc 0,52; RTA 6,6

XXIII Н вЂ” pMet — Leu-Thr-Gtu — Trp-AlaVal-Gly-Leu Met NHz HCt

XXIV Н вЂ” pMet-Тгр-А!а-Val-а1э-Н/S- 20

Leu-Met-NHz 2Н CI

ХХЧ Н-pMet — Asn-Glu- Trp-Ala- Val—

G iy — Leu Nie — М Нг H Cl

XXVI Н вЂ” pMet-Asn — G lu-Trp-Ala-ValGly-Leu-NH(CHz)4CHq H CI 25

XXVII Н-pMet-Arg-Leu-Gly-Asn -GiuTrp-Ala-Val-Gly-Leu-Met- NHz HCI

ХХЧ!!! Н-pMet-Glu-Arg — Leu-Gly- AsnGlu — Trp — Ala-Val-Gly — Leu-Met- МНг 2НС!

XXIX Н вЂ” pMet Clu-Arg-Leu-Gly -Asn 30

Trp-Ala-Val-afa-!.eu- Nle- МНг HCI

XXX Н-Glp — Arg-G ly-pMet-Asn -GinAla Ча1-Gfy-Leu-Nle — ЙНг HCI

XXX! Н-Leu-Gly"pMet-Gin-Тгр-. !а

Val — Gly — phe-Leu — Ме-NHz H Cl 35

XXXII Н вЂ” Leu — Gly — pMet-Glu-Trp-А!аЧа1-6!у-ala-Leu-Nle-МНг НС!

XXXI! l Н-pMet-Asn — Glu-Trp- Ala-Ча!

Gly Leu-Leu-NH-й Н г Н С!

XXXIV Boc-pMet-Clu-Trp-Ala-Чai б!у 40

Leu-Met-NHz

Rfc 0,86; ЯТд 15,3; AA-отношения. Glu

1,02 (1), Gly 1,07 (1), Ata 1,10 (1), Val (), Met

0,92 (1), Leu 0,98 (1) (Тгр и pMet н.о.).

ХХХЧ Н-pMet-Giu- Тгр-Ala Val Gló- 45

Leu-Met МНг HCI

Rfc 0,57: ВТв 16,8; АА-отношения Giu

1.08 (1), Gly 1,01 (1), А1а 0,98 (1). Val (1), Met

0,90 (1), Leu 0,94 (1) (Тгр и pMet н.о.), XXXVI Boc-Lys (Вос)-Gly-pMet Gin- 50

Trp-Ala-Val-Gly-Leu-Met-NHz

Rfc 0.73; RTA 18,7; АА-отношения. Glu

1.07 (1), Gly 2,02 (2), Ala 1,18 (1), Vai (1), Met

0,88 (1), Leu 0.95 (1), Lys 1,08 (1) (Trp и рМет н.о,). 55

ХХХЧ!! Н вЂ” Lys-Gly-pMet-Glu-Trp-А1эЧа1-6!у-Leu-Met-ИНг 2СГдСООН

Rfp 0,71; ВТАБ 15,4; АА-отношения: Glu

0,99 (1), Gly 2,02 (2), Ala 1,00 (1). Val (1), Met

О,UB (1); Leu г1,91 (1), Lys 1,15 (1), Тгр 0,91 (1) (pMet н,о,).

Соединение XXXVII!: Ac- Lys (Вос) — Glyл-Met Glu-Trp — Ala-Vai-Giy-Leu-Met-МНг, Rfc 0,77: ВТд 11,9; отношения аминокислот: Glu 1,05 (1);

G ly 1,97 (2), Ala 0,98 (1), Val (1), Met 0,98 (1), Leu 0,92 (1), Lys 0,92 (1), Тгр 0,88 (1), и-Met не определялось.

Соеди iение ХХХ1Х: Ас-Lys-Gly-n-MetG lu-Trp-Ala--Va1-Gly-Leu-Met-NHz СОО Н, Rfcr 0,78; RTa 16,2; отношения АК: Glu(1), Gly

2,11 (2), А1а 0,99 (1), Val 0,89 (1), Met 0,91 (1), Leu 0,92 (1), Lys 1,1 (1), Тгр и n-Met не определялись, Соединение XL: Нос-м-Met Leu GlyThr- Gru — Гr p — А1а — Val- His (Опр)-Leu; Н(С - г}4Г Н д, R fc 0,88; RTA 24,2; отношения

Ar . . TIrr 1.04 (1}, Glu 0,96 (1), Gly (2), Ala 1,03 (! Val 0,95 (1), Leu 1,92 (2), His (Dnp), Trp u м Met не определялись.

Соединение XLI: Н -м-Met-Leu-Glyr! r G lu- Тгр-А 1 а-Val-His (Dnp)-Leu—

МН(СНг)4СНз НCI, Rfc 0,5; ИТд 18,7; гпношения АК: Thr 0,92 (1), Glu 0,97 (1), 61у

2,04 (2), Ala 1,04 (11, Val (1), Leu 1,88 (2), His (0np), Trp» м-Met не определялись.

Соединение Xiii: Ас-I ys (Bnc)-Gly-nMet - G iu- - Trp -Ala — Val-G Iy--Leu-Met- М Нг, Rfc 0,77, RTr, 11,9, отношения аминокислот.

GJu 1,05 (1). Giy 1,97 (2), Аlа 0,98 (1), Val (1), Mar 0,98 (1), i eu 0.92 (1), l уз 0,92 (1): Trp 0,88 ! 1) n-Met не определялось.

Соединение XLIII: Ас-Lys- Gly-n-MetGIu-Тгр- А!а- Val-Gly-Leu-Met-МНгх хСFзСООН Rfg 0,78, ЯТе 16,2, отношения

АК. Glu (1), Giy 2,11 (2). Ala 0,99 (1), Val 0,89 (1). Met 0.91 (I). Leu 0,92 (1), Lys 1,1 (1), Trp u и -Уе! «е определялись.

Сосдинение XI IV: Вос-м — Met-Leu-Gly—

Тhr -Glu-Trр-Аlа — Val-His (Dnp)-Leu—

N1!(СНг)4СНз, Rf() 0,88. ВТд 24,2, отношения

АК Thr 1,04 (1), Giu 0,96 (1), Gly (2), Ala 1,03 (1), Val 0,95 (1), Leu 1,92 (2). His (Опр), Trp u и - Met не определялись.

Г оеди нен ие XIV; Н-м-Met-Leu-GlyГhr Clu-Тгр-А1а-Val — His (Опр)-Leu

NH(CHz)4C 4s HC,I, Rfc 0,5, ИТд 18,7, отношения АК; Thr 0,92 (1), Glu 0,97 (1), Gly

2,04 (2) Ala 1,04 (1), Vai (1), Leu 1,88 (2), Hls (Г)пр). Trp и м-Met не определялись, Соедине ие Х .Ч1: Вос-и-Met-Leu-GlyThr- С!и- frp-Ala-Val — Gly-His (Dnp)-LeuNH(C Нг)4СНл R fc 0,83; RT 26,41; отношения

АК: Thr 7,02 (1), Giu (1), Gly 2,04 (2), Ala 0,99 (1), \/ai 0,95 (1), Leu 1,91 (2), His (Опр), Trp u и- Met не определялись.

Биология, Свяэывающую аффинную активность соединений по изобретению по отношенм

2001918

10 Пептиды сравнения:

BBS

Спантид

10000

Патент США М 4331661, кл. С 07 С 103/52. опубл. 1982, Таблица 1

Аффинное связывание бомбесиновых алкилированных аналогов на фибробластах мышей ЗТЗ к бомбесиновым рецепторам определяют с использованием фибробластов мышей

SWISS ЗТЗ (табл.1).

Влияние нв митогенез определяют на спокойных и сливающихся клетках SWISS

ЗТЗ в свободной от сыворотки среде. В первой серии экспериментов испольэовали только аналоги или в сочетании с бомбесином. Во второй серии экспериментов клетки предварительно обрабатывают алкилированными пептидами, промывают. выдерживают 24 ч при 37 С и затем обрабатывают бомбесином. В обоих случаях оценивают синтез ДНК по введению (ЗН)-тимидина (табл.2).

Митогенное действие бомбесина и его аналогов оценивают также по активации протеинтирозиновой кинаэы, фосфорилирующей 115 кД-белок (р115) связанный с бомбесиновым рецепторным комплексом.

Кроме того, действие этих пептидов в концентрации О,1 — 50 мкМ вызывает существенное замедление роста клеток линии

$С1 С (таких, как NCI-H345. ИСНЧ592 и NCIH128), а также клеточных линий карциномы простаты (таких, как 00 145 и РС3).

Парэнтеральное введение этих пептидов s дозах от 10 нг/кг до 10 мг/кг голым мышам вызывает заметное снижение роста укаэанной трансплантированной человеческой SCLC и клеточных линий карциномы простаты.

Периферийное и центральное действие оценивали для крыс, соответственно !и

vitro, как сокращение мочевого пузыря и in

vlvo при!.с.v.-введении как брачное поведение в обоих случаях как в присутствии. так при отсутствии бомбесина.

Результаты испытаний приведены в табл.1-3.

Пептиды сравнения:

5 BBS 12.6:+3.8

Спантид 11,100 (pf o ) Спандит 14,000

fl eu + (CHg-NH)Leu )BBS 214 30

Иэ приведенных таблиц вытекает, что

15 при введении алкильного радикала в структуру агониста (соединения Vl, Vll, XVIII, XIX) результирующие алкилированные аналоги повышают введение тимидина при их индивидуальном исполнении, являются слабыми

20 антагонистами при использовании вместе с

BBS и являются сильными антагонистами при введении эа 24 ч до прибавления BBS.

Если алкильный фрагмент вводят в

BB S-аналог. который сам по себе неактивен

25 (соединения tll и IV) или является слабым антагонистом (соединения IV. Ч, Ч!Н, XIV, XVII. ХХ), то результирующее алкилированное соединение не усиливает введение тимидина и обычно ведет себя как сильный

30 антагонист как при одновременном введении с BBS. так и при введении через 24 ч после обработки BBS. (56) Патент США N. 4207311, 35 кл. С 07 С 103/52, опубл, 1980.

2001918

Продолжение табл, 1

Таблица 2

Введение (Н 1-тимидина в фибробласты мышей Swiss ЗТ3

Соедине- Превышение базового уровня. раз ние

500 нМ 5000 нМ

5нМ

50 нМ

500 нМ

5000 нМ 500 нМ

5000 нМ

64 «+1О 27+14

39+7

57+13

17 4

44+12

22+3

17+4

57+14

87+9

54 +1

58й13

21+3

6+2

4,7

2,1

61 «+9

ЧИ

26 8

19 7

83+6

XIX

ХЧН

9+5

62+

2,9

62 1

20+7

20+ 3

67":3

8,0

4.1

34+

59++3

81

7.0

ХУН!

5.4

14+3

37++7

77 11

35+3

32 ="8

60+5

19 11

4 2

3+2

3+1

1,6

1,2

XVI

Vill

47+10

56"-3

41+ 1

37+4

68 8

14+2

85 2

28+6

39» 1

1,0

ХХ

1,2

XlV

ХХХЧ

XXXVI

XXXVIII

ХХХУИ

6+2

46+-9

52 "=5

14 -8

24 «-0

46 26

25 15

44 12 27+ 10

1.4

36+0

91 «+2

86+.1

40 19

31 «+14

89+4

78 + 11

XX IX

1,2

4,3

1.4

4,3

4,2

7,0

1,7

7.3

3,1

1,2

1,5

1,3

1,О

1,1

1,5

1,2

1,0

1.3

4,8

1.8

4,4

3.9

6.6

2,3

5,4

3.9

1,2

1,2

1,2

1.0

1.4

1,2

1,4

$ Ингибирования в присутствии 25

HM BeS

2001918

Продолжение i6n. 2

Таблица 3

Фосфорилирование р115-белка, связанного с бомбесиновым рецептором

Примечания:

А — аналоги вводят в сочетании с BBS;

 — клетки предварительно обрабатывают аналогами. отмывают, выдерживают 24 ч при

37 С и затем обрабатывают 8BS.

2001918

Продолжение табл 3

Формула изобретения

Составитель В. Волкова

ТехРед М.МоРгентал КоРРектоР Q, Гугти

Редактор Т, Пилипенко

Заказ 3154

Тираж Подписное

НПО "Поиск" Роспатента

113035, Москва, Ж-35. Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Пептиды общей формулы А - 8 - С - О - Gin

-Тгр-Ala-Val-X- Y--Т-W, где А - водород. Вос и ацетильная группа:

8 - m-Met, Lys - Gly, Lys (Boc) - Gly или простая связь

С - р-Met. в-Met или Leu - Gly, причем один из.В или С - р-Met или m-Met;

О - Thr или простая связь:

Х вЂ” Gly или простая связь; у — D - Phe, Hit. His (Dup):

Т - Leu или простая связь;

W - ОН, MetNH> или НН(СНр) СНз, или их фармацевтически приемлемые соли, обладающие антагонистической активностью в отношение бомбезина.