Способ лечения больных с опухолями
(21) 4356180/14 (22) 26.07.88 (46) 30.11.93 Бюл. 443 Н (71) Хам Рисерч, Инк. (0$) (72} Рилльям Р1. l
2003334
Изобретение относится к использованию двухнитевой рибонуклеиновой кислоты (РНК) отдельно или в комбинации с лимфоклинами для подавления пролиферации опухолевых клеток в теле животных и человека, коррекции нарушений в опухолевых и ра«овых клетках в теле животных и человека. и воздействия на нарушения иммунной системы, возникающие из-за предрасположенности некоторых организмов к опухолевым или раковым заболеваниям независимо от того, возникают ли они под действием генетических факторов или факторов окружающей среды. Изобретение относится к использованию PHK в комбинации с другими химическими и биологическими агентами для подавления воздействия этих факторов, 1. Интерфероны (ИФН) составляют,"". класс протеинов, способных ингибировать репликэцию вирусов в животных клетках.
Они имеют клеточную природу, могут быть продуцированы in vitro или ln vlvo и стимулируются большим количеством веществ (The Encyclopedia of Biochemistry, еб. by
Roger Nlitllams and Edwin Lansford, Reinhold
Publishing Company, 1967). ИНФ известен своим как противоопухолевым, так и противовирусным действием (Nature 262, 300, l978). способностью восстанавливать контактное торможение и подавление роста в полужидком агэре опухолевых клеток.
Двухнитиевые РНК являются индукторами различных молекулярных форм человеческого ИН Ф трех типов: альфа (лейкоцит), бета (фибробласт) и гамма (иммунный), которь1й может быть стимулирован обеими натуральной и синтетической двухнитиевыми РН К. Использование синтетической двухнитиевой РНК для образования комплексов полирибоинозиновой и полирибоциъидиловой кислот (дальше они обозначены как ri„rCn или иоли-iC) как индукторэ интерферона известно, например, из патента США М 3666646, выданного Lampsonet
al, Кроме своей роли как ИФН-индуктора, двухнитиевая РНК является активатором двух ИФ.Н-индуцируемых ферментов: протеинкиназы и 2-5-олигоаденилатсинтетазы (Proc. Natl. Acad, Sci,, 75, 5893, 1978). Молекулярные основания для антипролиферативного и противоопухолевого действия интерферонэ и их связи с двухнитиевой РНК до настоящего изобретения не были известны, кэк и антипролиферативные свойства двух нитиевой РНК, следующие из.ее роли как ИФН-индукторэ.
2, Синтетические "несовместимые" аналоги двухнитиевой РНК, Совсем недавно было обнаружено, что
ИФН может быть индуцирован также несовместимыми аналогами rln rCn. как описано в патентах N. 4130641 и N. 4024222. ".ыдан- . ными Т ЭО и Carter. Эти аналоги образованы модифицированными rln rCn для включения непарных оснований (урацила или гуанина) вдоль полирибоцитидилвтной (гСл) цепи или модифицированным позвоночным рибози10 лом полирибоинозиновой кислоты (rln). Несовместимые аналоги, особенно те, что модифицированы в rCn-цепи, сохраняют способность индуцировать ИФН так долго, насколько это отвечает структурным требо15 ваниям.
Длинные участки спаренных оснований двухнитиевой PHK. не являются необходимыми для индуцирования интерферона. Действительно, необходимым условием. для
20 синтеза быстро действующих интерферонов является сохранение 1/2 — 1-спирального витка сггаренных оснований двухнитиевой .
РНК(днРНК).
Увеличение скорости гидролиза отмеча25 лось,. когда несовместимые полимеры подвергались действию нуклеазы (J.Molec. Biol.
70,567, 1972), однако зти двухнитиевые РНК были почти также активны, как и немодифицированные г1л ICn, исходя из индукции
30 интерферона. Предполагалось, чтодлительное сохранение интактной двойной спиральной структуры может быть ответной для многих других биологических реакций на
РКН, обычно отмечаемых как лекарственйая
35 токсичность. Исследования "несовместимых" аналогов: rln r(Ci>-i4)n Arnpiigen зарегистрированного товарного знака of
HEM Research, 1пс„йосйчйе, 10852, CUBA, в различных животных системах показали, 40 что rln r (Ci>, U)n менее токсичен, чем rln—
rCn (см, Поли-1С с "несовместимыми" основаниями, исследования по терапии рака in
augmenting agents in Canar Therapy ео тео
Е.М.Н г е а1, Ра е Р е, Нью-Йорк, 177, 45 1981). В частности, повторное введение мышам rin r(C12, U)n показало еще меньшую токсичность по отношению к таким чувствительным органам, как костный мозг позвоночника. клетки печени, тимоциты, спленоциты (J.Molec. Biol., 70, 567, 1972), поскольку эффективность защиты против заражения разновидностью летального вируса сохранялась (Motec. Pharm, 12, 299, 1976).
Кроме того, rln r{C>>->e, U)n показывает
55. уменьшение {100-кратное уменьшение) пирогенеза по отношению к rln rCn у кроликов, снижение митогенеза (5-19-кратное уменьшение) мышиными и человеческими клетками in vitro и уменьшение образования
2003334 дцРНК-антител (5 — 10-кратное уменьшение) у кроликов и мышей. На фоне этого снижения клеточной токсичности rl r(C11-14, U)n сохраняет свою способность индуцировать интерферон, стимулируя функции клеток
"натуральных убийц" (НУ) (J.immunology, 124 1852, 1980) и активируя указанные внутриклеточные медиаторы 2 - 5 -олигоаденилатсинтетазу и специфическую протеинкиназу.
Поэтому очевидно, что в различных контрольных системах (кролик, мышь и человек) и при различных схемах дозирования измерения токсических и терапевтических эффектов показывают, что "несовместимый" аналог rl> °
r(C11-14, 0),(АгпрИдеп) имеет усилейныйтерапевтический индекс. Приготовление и получение этого индуктора/активатора описаны в J.Мо!ес. Biol.. 70, 567, 1972), Использование модифицированных
rt> rC>-аналогов с единственной целью индукции интерферона в животных клетках для противовирусного действия описано в патентах CLI!A N. 4130641 и М 4024222. Однако что касается их использования как противоопухолевого агента, то недостаток
ИФН-терапии (как и. других лимфокинов, вводимых в чистом виде) заключается в том, что она имеет лишь маргинальный эффект во многих организмах. В результате относительно большое количество лимфокинов, необходимое для введения ворганизм,,приводит к неестественно высокому уровню накопления лимфокинов в нем, которое не могло бы быть генерировано самим организмом в процессе нормальной ответной реакции человека на вирусную инфекцию, иммунной клеточной дифференциации или естественного механизма иммунозащиты против раковых, вирусных и других поражений, При таких высоких уровнях лимфокинов организм реагирует на них как на чужеродные тела и обладает способностью генерировать против различных лимфокинов типа ИФН-антитела. Образующиеся в результате этого антитела уничтожают остаточн ы и тера певтический полезный эффект.
Кроме того, неопластичные клетки, в частности, способн ы вы ра батые ать устойчивость к терапевтическим свойствам различных лимфокинов типа ИФН и других членов семейства лимфокинов, Как будет показано в дальнейшем, эта способность неопластических клеточных линий вырабатывать устойчивость к ИФН достигается не случайным фенотипом, поэтому это служит некоторым препятствием терапевтическим методам, предиазначенным для ингибирования полиферации. основанного на использовании лимфокинов в чистом аиде, Настоящее изобретение устраняет недостатки при использовании укаэанных те5 рапевтических средств благодаря открытию новых антипрофилиративных агентов и их составов, которые останавливают или значительно замедляют рост раковых клеток независимо от того, вырабатывают ли эти
10 клетки устойчивость к лимфокинам. Кроме того, в предлагаемом способе даны составы, содержащие интерферон, в которых степень содержания его хотя меньше в 20 — 50 раз, чем в описанных применениях, тера15 певтическая эффективность, достигаемая средствами, описанными в изобретении, не меньше, а даже больше. Так как составы, описанные в предлагаемом способе, содержат .синергетически действующую днРНК, 20 то терапевтический эффект от днРНК соответственно болев высокий, чем тот, что был описан в.иэвестных изобретениях, и действительно оказывал терапевтическое воздействие на опухолевые тельца костного матрикса, опухоль которого известна своей устойчивостью. к воздействию экзогенных лимфокинов, когда они используются в мономодальной терапии.
3. Клетки — "натуральные убийцы" как иммунозащитный противоопухолевый механизм.
Было опубликовано множество статей в поддержку главной роли популяции клеток - "натуральных убийц" (НУ) в иммунозащитном механизме против неопластических клеток. Мыши с высокой активностью НУклеток более устойчивы к опухолям с НКвосприимчивыми опухолевыми клетками, чем мыши с низкой активностью НУ-клеток (1пипцпо1. Rev., 44, 165, 1979). С57В1/6 бежевые мыши, которые были отобраны на
НУ-клеточный дефицит, показали более высокую восприимчивость к опухолевому росту, чем изогенные мыши с нормальной
45 НУ-клеточной активностью (Nature (Land,)
284, 622, 1980; Nature, 284, 624, 1980). Подобная ситуация наблюдалась у людей с синдромом Чедиака-Хигаси, предполагалось, что НУ-клеточный дефицит при этом заболе50 вании может стать причиной дальнейшего развития у этих больных лимфомой (J, Ехр.
Med, 151, 1039, 1980; J. Exp. Med., 151. 1049, 1980, Nature (Lond), 284. 553, 1980). Бол ьн ые с хроническим лимфолейкозом (ХЛЛ) отпи55 чаются более высокой частотой метастазирования, Zlegler и ЕагПп1 (int. J, Са сег, 27, 321, 1981) оценили НУ-клеточную активность в лейкоцитах, взятых от пациента с хронический лейкозом после удаленл лейкозных клеток, Важно отметить, imari гюль2003334 шинство пациентов, страдающих ХЛЛ, имеют минимальную или не поддающуюся обнаружению НУ-клеточную активность несмотря на присутствие лимфоцитов, связанных с НУ-восприимчивыми клеточными объекта- 5
«ми. Кроме того, реципиенты с пОчечным аллотрансплантантом, которым назначались. высокодоэированные иммунодепрессивные лекарственные средства, имели в 100 раэ больший риск злокачественного развития 10 болезни, у них отмечалась также предельно сниженная или полная потеря НУ-клеточной активности (Тгапзр1апюбоп, 29, 214, 1980). Напротив, опосредованные ан ителами клеточная цитотоксичность(АССС) у этих 15 реципиентов не подавлялась. Иэ этого сле; дует, что дефицит иммуноклеточной активности является. специфическим, и если он существует, то влечет за собой серьезную
20 сикергический и потенцирующий эффект относительно антипролиферативного воздействия.
Например,. использование "рассогласован- 30
40 вательно, они обладают слишком малым риском развития у них антител против 45
55 предрасположенность к злокачественному развитию/рецидиву болезни;
Настоящее изобретение содержит множество открытий, одно из которых заключается в том, что, если даже опухолевые клетки обладают ИФН-устойчивостью, использование специфических лимфокинов в сочетании с "несовместимой" дцРНК дает в результате ной" дцРНК в чистом виде или в сочетании с лимфокинами в организме, которые показывают лишь маргинальную реакцию на мономодальное воздействие лимфокиками, дает в результате усиление антипролиферативного/иммуномодулирующего эффекта дцРНК помимо того, который наблюдается при использовании в терапии дцРНК в чистом аиде. К тому же для многих индивидуумов терапия лимфокинами, например ИФН, представляет собой приемлемый метод лечения, т.е. эти пациенты не нуждаются в излишне высокой дозировке И Ф Н и, следолимфокинов или появления у них побочных эффектов на введение лимфокинов, так как эти побочные эффекты непосредственно зависят от дозировки лимфокинов. 8 этом смысле дцРНК усиливает действие лимфокинов и при этом придает методам ИФН-терапии большую эффективность. Поэтому терапевтические методы и составы, рассматриваемые в этом изобретении, улучшают существующие уже методы, основанные лишь ка лимфокинах, а также дают возможность применять эти методы к тем пациентам, которые по тем или иным причинам не могут воспользоваться известными.
В предпочтительном осуществлении этого изобретения дцРНК представляет собой "несовместимый" аналог rln гСп, Как указывалось, этот аналог является результатом разрыва той или иной цепи непарными основаниями, т.е. они не являются парными основаниями Уотсона-Крика, типа урацила и гуанина. Эти "несовместимые" аналоги являются предпочтительным осуществлением предлагаемого изобретения из-за того факта, что они сохраняют антипролиферативные действия немодифицированных rln rCn и в то же время обнаруживают значительное снижение тенденций к быстрому возникновению побочных эффектов, таких как повышение температуры, гибель неспецифических клеток, т,е, гибель нормальных клеток организма, и антигенность. Кроме того. обнаружено, что специфический несовместимый аналог
rln г(С»-i4, U)n дает сенсационный эффект, даже больше того, который уже описывался, в связи с антипролиферативными способно- ° стями типичной дцРНК типа rln гСр. В час тности, это позволяет в некоторых случаях исправлять дефекты в опухолевых клетках так, что они перепрограммируются и функционально преобразуются в нормальные.
Заявитель фактически отделял раковые клетки от пациента и неоднократно наблюдал это явление. Помимо этого, обнаружено, что Аптрйдеп может эффективно действовать как агент, кррмализующий раковую клетку, в тех ситуациях, когда существуют препятствия для использования лимфоки5 нов, Известно, что некоторые химические и биологические вещества обладают способностью к независимой нормализации раковых клеток, "Несовместимая" дцРНК, а именно rln r(C»-14; 0), расширяет эти возможности в нормализации раковых клеток, в то время как лимфокины часто оказывают противоположное действие, т,е. снижают или уничтожают процесс нормализации.
Кроме того, данное изобретение дает воэможность корректировать иммунные нарушения, выражающиеся в предрасположенности к раковым заболеваниям вследствие наследственных факторов или нарушений в иммунной системе, Эти свойства, очевидно, 0 ке относятся к действию ИФН, лимфокика, скорее всего Igx можко приписать действию
"кесовместимой" дцРНК на раковые клетки качественно иным способом, чем это делает лимфокин.
Эти терапевтические составы и методы применяются для лечения рака, опухолей и неопластических клеток, Лечение в этом контексте является термином, означающим профилактику рака, задержку в развитии
2003334
5
20
35 ао
55 опухоли (частично или полностью), устранение опухолевых рецидивов, перерождение опухолевых клеток в нормальные, коррекцию связанных с раком иммунных дефектов и обеспечение необходимой защиты от действия вирусных инфекций, а также различных аутоиммунных реакций на воспалительные
СОСТОЯНИЯ.
Важно отметить, что данное изобретение применяется не только для лечения опухопе рака, после того как они клинически обнаружены, но и превентивно для предотвращения малирйэации нэ ранней стадии проявления илФ- субклинического течения болезни,.т.е. предраковое состояние может длиться довольно долго, перед тем как появятся видимые признаки болезни, требующей терапевтических методов лечения.
Настоящее изобретение предназначено также для предупреждения рака, перед тем как он достигнет клинической стадии, например, в организмах, имеющих высокую степень наследственной предрасположенности к раку. Другими словами, рак можно представить как часть биологического континуума, который может существовать довольно долго, ранние стадии которого можно рассматривать просто как предрасположенность. Изобретение рассчитано не только для лечения клинического рака, но и позволяет использовать его превентивно задолго до появления видимых признаков болезни.
Целью изобретения является повышение эффективности лечения.
В способе используются терапевтические средства и методы для модуляции опухолевых клеток в сторону их нормализации и потери их злокачественного фенотипа путем введения экэогенной "несовместимой+ дцРН К в опухолевые клетки. Такими методами, например, являются введение "несовместимой" дцРНК и увеличение внутриклеточного уровня дцРНК. Опухолевые клетки, не реагирующие или мало реатирующие на лимфокины, становятся таким образом реактивными. Введение дцРНК можно осуществлять совместно с лимфокинами. Особенно поразительного эффекта можно достичь в передаче клеткам медленно развивающихся опухолей способности реагировать на антипролиферативное действие на них интерферона.
Как было отмечено, многие организмы не обладают удовлетворительной ответной реакцией на канцеротерапию. Основанную на применении ИФН в чистом виде. Следовательно, высокий уровень дозировки, необходимый для результативного эффекта для таких больных, может развить устойчивость организма к производству внутри себя естественного ИФН. Кроме того, тот факт, что резистентность иного вида может быть также развита неопластическими клетками в виде неслучайно приобретенного фенотипа, придает первостепенную важность в понимании значительного угучшения терапевтических методов и средств, полученных в настоящем изобретении, по сравнению с теми методами, которые использовались для подавления у больных опухолевой пролиферации путем применения лишь одного ИФН, Введение ИФН и какой-нибудь дцРНК. т.е. с парными основаниями или "несовместимыми, при осуществлении этого изобретения проводится в "сочетании", в котором оба агента вводятся либо вместе как терапевтическая смесь, либо отдельно, но одновременно, как бы отдельными системами для внутривенного вливания в один
Организм. Использование в "сочетании", кроме того, включает введение этих лекарственных средств отдельно, при котором одно из ниэ дается сначала, а второе — вскоре после первого. Все три из этих осуществлений изобретения имеют свои преимущества.
Раздельное, но одновременное введение их, например, позволяет Осуществлять независимый контроль над каждым агентом и получить оптимальное средство для каждого пациента.
Раздельное введение позволяет для чистого ИФН восстановить маргинальное действие на клетки, которое расширяется использованием дцРНК. Приготовление
ИФН и дцРНК как смеси дает быстрый доступ к этому терапевтическому средству при условии, если заранее определить ее оптимальный состав. Ранее были даны комментарии ко всем случаям, рассматриваемым в настоящем изобретении, включай формулу изобретения, где один терапевтический агент вводится в "сочетании" с другим;
Аналогично этому терапевтические агенты и их смеси, рассматриваемые в способе, могут вводиться в организм путями, обычно используемыми и известными в медицинской практике. Один иэ них — внутривенный, но существуют и другие; внутримышечный, подоболочечный, внутричереп ной и внутрибрюшинный.
Лимфокины имеют в своем составе: интерфероны {альфа, бета, гамма), предпочтительно эльфа, интерлейкины, специфические интерлейкины {1, 2 ипи 3) и рекомбинант интерлейкин-2 (rtL-2), опухолево-некротический фактор PNF). Сюда относятся также
2003334 активизированные лимфокином клетки
"убийцы" (LAK), образующиеся в организме в результате ответной реакции на действие ли 1фокина.
Если интерферон (альфа) используется, как лимфокин, то необходимое количество его составляет от 0,01 до 10000 ед. IR на мл жидкости человеческого тела. Если IL-2, а лучше rlL-2, является лимфокином, то вводимое количество должно составлять от 10 ед.
IL-2 на кг веса человеческого тела до величины, приближающейся к неприемлемому для пациента уровню токсичности, вплоть до 10 ед. И:2, Однако зти пределы — от 10з до 10 ед. IL-2 на кг веса тела человека.
Если оба агента дцРНК и лимфокин вводятся в сочетании, как было описано, то они могут быть введены в смеси, отдельно, но одновременно или один за другим. .;Ф
Если лимфокины и дцРНК вводятся в сочетании, то дцРНК может быть введена в количестве, которое приводит к уровню от
1-1000 мг дцРНК на мл жидкости в организме, т.е. раствора сыворотки, солей. витами-. нов и т.д., циркулирующего в организме.
Например, введение состава, содержащего
10 мг дцРНК в организм весом 1б0 стоун (72,4 кг), дает в результате степень содержания Р Н К около 1 мгl мл. Аналогичным образом количество интерферона при введении дцРНК вЂ” ИФН составит уровень в пределах 1-100000 ед, ИФН на мл жидкости в организме, Способ введения этого сочетания, как было описано, может быть выполнен следующим образом: в качестве смеси, отдельно, но одновременно или один за другим. Все дело в том, что введение этих агентов дает синергическое действие, в каком бы практическом воплощении этого сочетания их ни брать.
Под "несовместимыми" дцРНК подразумева отся те дцРНК, в которых водородные связи (упаковка оснований) между двойными спиралями относительно интвктны, т.е. они прерываются в среднем меньше, чем одна пара оснований в каждом 29 последовательном основном остатке. В соответствии с этим и следует понимать термин
"несовместимая" дцРНК, дцРНК может быть комплексом из полиинозината и полицитидилата, составляющих пропорцию оснований урацила и гунадина, например, от (1-5) до {1-30) (поли Поли (С4 — Сгд к х > 0 или G). С другой стороны, соответствующие олигонуклеотиды (малые нуклеотидные фрагменты) могут быть соединены с соответствующими комплементарным полинуклеотидами или олигонуклеотидами при некоторых обстоятельствах.
25 00ли (l) пОли (С4, 0) поли(!) поли (С7, U) поли (!) ЛОли (С)з, U) поли (!) поли (Сгг, 0) поли (!) поли (Сго, 6) поли (!) поли (Ср) 23 С > р.
Количество "несовместимой" дцРНК .вводится до статочно для достижения пика концентрации крови от 0,01р r на мл дцРНК до 1000р г на мл дцРНК в системе кровооб35 ращения вскоре после введения.
Как было установлено, в предлагаемом способе лучше всего использовать дцРНК типа rl> rC(Ct1-14, U)> для ингибированйя неопластических клеток, Было отмечено, что
40 "несогласованная" дцРНК дает более слабый фармацевтический эффект по сравнеwe с дцПНК, имеющей парные основания.
Была исследована также активность других типов ИФН помимо ИФН-фибробласта, 45 включая естественные человеческие лейкоциты и ИФН, продуцируемые в бактериях, при помощи ДН К-рекомбинант-технологии (rlFN). Bo всех случаях ИФН оказывают более слабое действие на опухолевые клетки
50 человека, когда они вливаются в чистом виде, чем когда они вливаются вместе или последовательно в нормальной или
"несогласованной" PHK. Максимум уменьшения человеческой опухоли составлял 33%
55 по ширине при впрыскивании ИФН концентрации 10 -3 10 ед. ежедневно, Напро5 . 6 тив, у животных, подвергнутых введению
ИФН в сочетании с дцРНК в количестве уже
10 ед. ИФН ежедневно, наблюдалось умень30 дцРНК может быть представлена основной фоРмУлой г!л ° r(C11-.!4, U)n и, в частности, г! (Сц, 0)л. Другие приемлемые примеры дцРНК обсуждаются ниже.
5. Несовместимые" дцРНК, наиболее подходящие для использования в настоящем изобретении, основаны на сополинуклеотидах, выбранных из поли (Сл, U) и поли (Сл, G), где и — целое число, принимающее
10 значения 4-29, и являются "несовместимыми" аналогами комплекса соединений полирибоцитидилата (гСл), например, образованного посредством включения остатков
2-О-метилрибозила. Эти "несовместимые"
15 аналоги rl" гСП, наиболее предпочтительным из которых является rl> . (C12, U)n, описаны
Carter и Тз о Ь патентах CLUA N. 4130641 и
t4 4024222. дцРНК, описанная там в общих чертах, является наиболее походящей для
20 использования в изобретении.
Определенные примеры "несогласованных" дцРНК для использования в настоящем изобретении включают:
2003334 i-4 шение опухоли на 65 7 больше у1-1еньше!!31я человеческой опухоли, Б соответствии с этим л!1РН К, применяемая в сочетании каким-либо одним видам ИФН, дает в результате качестве!Гно более высокий эффект. Кроме тога, челане(!еск31е ОГ!ухали требуют индивидуального ре>кима лечен31я для получения оптимального терэпенти !ескога эффекта, В дальнейшем усилия по инд«видуэлизации схем лечения привадяг к ожидаемому 10-кратному увеличени!о терапевтического эффекта там, где "несовместимая" дцРНК применяется в сочетании с
ИФН. Данные убедительно паказыва!От, что днРНК расширяет терапевтическую эффективность всех фарм ИФН, включая натура":üну!а, синтетическую и гибридную формы типа полученных частична из альфа, бета и гамма-И Ф Н. Б соответствии с этим сочетание днРНК. особенно "несагласаван !0А дцРНК, а именно Г4 г(С 1-и, U), с ИФН входит в технологию приготовления сильнаiI ..!ну още!о лекарства против рака, !!амного превышающего возможности чистого
ИФН. Кроме того, при изучении структуры человеческой опухоли становится очевидным, что содержание в ней различнога типа вирусной генетической информации безусловна вносит свой гклад в злокачественные и/«ли патологические процессы в человеческих тканях, являющихся причиной их нарушения «болезней. Поэтому важно, чта комбинация дцРНК вЂ” ИФН являетСя.не только противоопухолевым агентом, наи таким же эффективным средствам против вирусных 60лезней, Действительно, терапевт«ческис смеси, описанные в этом изобретении, будут эффект«вны против болезней, для которых показано лечение ИФН, включая вирусные заболевания в острой, подострой, лате!!тнай и хронической стадиях, а также заболевания, сняззннь!е с нарушением иммуннойl с«сте!.1ы, но которые могут исчезнуть при восстэ!!Овлсни«эутоиммунной защиты, Важно подчеркнуть, что роль дцРНК в с«нерплстическом усилении эффекта лечени при использован«и соединения дцРНК вЂ” ИФН не в то!л, что аиэ сти!лулирует ИФН, иначе этот синсргизм не набл!Одался.бы. Скорее всего
"несав!лест31мая" ДцРНК нносит специфическ«й в!лэд, который дополн лет действие VI<3 Í, делая его более пласти !3!ым и эффективным, чего нсльзя было бы добиться, используя при
ne«eн«31 раковых или flирусных заболеваний то!!ька 1 ФН или ДцРН К GTpeilbHO.
Были проведены наблюдения I;eK0Toрых пациентов с раком легких и пациентов с высоко« степенью наследственной предрасположе!!ности к раку, у всех отмечался расположенности к раку.
20 Далев приводятся примеры, поясняю35
5
5 низкий уровень активности НУ-клетак. ЗТ31 наблюдения описаны ниже. Было проверена, можно ли у пациентов с высоким наследственным факторам риска восстановить
НУ-клето ну!а а с1инность до нормальнога уровня при помощи добавок различных типов ИФН и/или "несовместимых" дцРНК.
Работы, появившиеся в последнее время, показывают расхажде !ие в эффективном увеличении НУ-клеток(клетки были взяты от нормальных организмов) среди натурал ьных типов (Bflt, J. Мае1п., 50, 85, 3982) и клан1лрованных падтипав интерферона (Can,-Res, 42, 3312, 1982), Было отмечено, чта "несовместимая" РНК имеет более ярка вы раженную способность к рестабилизации нормального уровня НУ-клеток у пациентов с высокой степенью наследственной предщие настаяшее изобьете ие, все доли и процентное содержание в которых берутся от веса, дцРНК (" несовместимая" ), которая используется в примерах, имеет
ФОРМУЛУ Г4 Г(С11-1Л, Цл, ИНОГДа ИЗВЕСтная как I ln (С12, U).
А, дцРНК вЂ” ноный механизм модуляции
ОП Xoilсй, Новый механизм модуляции опухолей посредством "несовместимой" дцРНК нс является лишь часть!о основного механизма-действ !я лимфокинов, Настоящее исследование демонстрирует широкие основания для использования при модуляции отклоненных оТ !!Ормы клеток человеческой опухоли, причем механизм этой модуляции отличается от !1еханизма, действующего при индуциравании ИФН. 0 частности, дцРНК-индукция ц«клическаго аденозинмо-!!офосфата (САМР) была обнэруж-..нэ в клетках, известных своей нечувсп ительностью к альфа-интерферону. Эт31 исследования были проведены с двумя cAMF киназаингибиторами, обознзчснны!1и как Н-7 и Н!Д "!004 (известные !.1етабали lccKI1е !1нг31б! ITopb! протеинкиназы С
31 сА (ь П к 31 н а 3 ы}, д л я Оценки и О н О Й f1 p QT! 1 B o" апухаленай мадулиру!О!Дей экт31лности несовместимой дцР! 1К в BI!äe резистентности к Одном одал ьнай л!лмфак«н-терап и и, использующей альф.-интерфсрон как прототип лимфокина. Для демонстрации
"несанмсстим031" ДцРНК не прОвОД«лось индуциравания нтерферанэ в ИФН-нечувстни тел ьн,lx клетках, для э ГОГО клетки человеческой Глиомь! (Опухали мОЗГа} (д 235} были обработаны дцРНК за различные промежутки времен«от "до 8 ч. ДцРНК удалялась и добэвля:!ась свежая среда в течение 24 ч, зато !и ти Гры и н т арфе рО !!э (РД, И Ф Н /мл) 2003334
16 щи использования антител к интерферону, который при его наличии в клетке был бы связан с антителом, антипролиферативный днРНК- вызванный эффектуменьшился бы, 5 Использовались три типа антител к интерферонам (альфа, бета, гамма) в 240 нейтрал. ед./мл и контрольные клетки. Анализ на ингибирование опухолевого роста был выполнен s соответствии с описанием Hubbell et
10 аЬ. Cancer Res. 44:3252-3257 (1984). Процентное содержание контрольной культуры антител было подсчитано следующим образом: е åêì О „1M контрольные клетки ч — контрольные клег ч глиомы, который может быть непосредст- 20 вают противодействие противоопухолевому 25 действию дцРНК, как это показано в табл. 3. дцРН К в чистом виде "работает" на уменьше- . 30 ние процента контрольных клеток, наличие
40
50 проверялись на цитопатический эффект (Flnter. N.G., J., Gen vlrol. 5: 419-427, 1969).
Результаты приведены в табл. 1, где нижний предел обнаружения составил 5 ед. ИФН/мл, Из этого следует, что дцРНК не индуци,ровала интерферон в этих нечувствительных к ИФН клетках.
Затем подобные клетки были подверг. нуты подкрепляющей проверке для того, чтобы определить, играет ли интерферон роль антипролиферативного действия s указанных клетках, вызванного воздействием на него днРН К. Это было сделано при помооб аботанные клетки 24ч — к (Х
Результаты представлены в табл. 2.
Эти.данные также. подтверждают, что дцРНК не индуцировала ИФН в исследуемых клетках.
Было найдено, что дцРНК индуцирует циклический АМР в клетках человеческой венно приписан кдцРНК, а не к ИФН-индукции в этих клетках, Три известных метаболических ингибитора: H-7, НА 1004 и коклюшный токсин — ингибируют или оказыБыл снова оценен процент клеточных культур для .получения низкого процента контрольных культур, как и в табл. 2. "Несовместимая" ингибитора увеличивает клеточную культуру
В табл. 3 показано противодействие метаболическими ингибиторами Н-7 и НА -1004 прот роопухолевому действию "несовместимой" дцРНК в клетках человеческой глиомы. Величины снова даны как процент контрольных клеток для дцРНК в концентрации от 0 (слепая проба или контрольная), 25 и 200 мгlмл.
Аналогичным образом ниже показано, как предварительная обработка клеток человеческой глиомы коклюшным токсином и нгибирует дц P HK-индуцируемую антипролиферацию. В табл. 4 дан процент контрольной культуры за 24 ч в клетках, предварительно обработанных коклюшным токсином в течеwe 4 ч до добавления дцРНК. Это показывает, что Н-7 и НА 1004 — два известных ингибитора оказывают минимальноедействие на опухалевае ингибирование в клетках, обработанных альфа-интерферанам, в та время как каклюшнйй токсин, имеющий, по-видимому, двухфазовое действие, не изменяет ингибирования опухолевых клеток альфа-интерфе- . роном при больших дозах и усиливает антипролиферационное действие в малых дозах.. . ИФН-альфа не увеличивает внутриклеточный сАМР-уровень в такйх же клетках на протяжении 24 ч, как показано в табл. 5. В этой методике клетки человеческой глиомы (А. 1235) подвергались действию интерферан.- альфа в количестве 0 (контр.), 250 и 1000 ед. ИФН/мл в течение 24 ч от начала эксперимента.
B этой таблице даны величины пмЬль сАМР/мг протеина; предел точности определения — 0,02 пмоль сАМ P/ìã протеина.
Внутриклеточный уровень сАМР определялся затем косвенным методом путем измерейия каталитической активности аденилата (пмоль сАМР, образованного за 15. мин) в клетках человеческой глиамы сразу после обработки их антипралиферативнай дозой дцРНК (25 и 200 г/мл) в течение 30 мин и 24 ч. В этой процедуре клетки обрабатывались "несовместимой" дцРНК, 25 (сплошной треугольник) или 200 (сплашнай квадрат),и г/мл "несовместимой" дцРНК, В соответствующей точке времени обработки (0,5-30 мин и 0,5-25 ч) среда была удалена,. а клетки быстро заморожены сухим льдом.
Активность аденилатциклазы в гамагенатах, полученных из клеток при воздействии ультразвука. была исследована методом
Jonng..et а! Molec. Enfocrlnol. 1:884-888, 1987. Клетки были сосчитаны в течение 24 ч для проверки антипралиферативнай активности, Индукция сАМР в дцРНК-обработанных клетках человеческой глиамы (A 1235} измерялась непосредственно как.пикамаль
2003334
18 сАМР на микрограмме протеина, результаты более 30 мин и более 24 ч. В этом методе
А 1235-клетки обрабатывались 25 (треугольники) или 200 (сплошные квадраты) р г/мл
"несовместимой" дцРНК. В соответствую- 5 щих временных точках среда удалялась и . внутриклеточный сАМР отверждался в 0,1
HO. Уровни сАМР определялись при помощи РИА-метода, как описано Relsine et al, J.Ceil. Biol. 102: 1630-1637, 1986. Уровни 10 сАМР в контрольных клетках и клетках, обработанных 1р г/мл днРНК, были ниже.границы точности обнаружения, Клетки считались 24 ч для проверки антипролиферативной активности. 15
Было замечено ярко выраженное увеличение сАМР после всего лишь 30 с действия дцРНК, этот уровень сохранялся в течение
30 мин.
Исследования подтверждают увеличе- 20 ние сАМР-уровня, что непосредственно связано с действием дцРНК, так что дцРНК не являлась ИФН-индуктором в используемых клетках. Антипролиферативные дозы днРНК индуцировали.активность аденилат- 25 циклазы через 30 с после начала испытания.
Аналогичным образом, внутриклеточный уровень сАМР .увеличивался в зависимости от антипролиферативной дозы через 30 с..
Предварительная обработка клеток коклюш- 30 ным токсином, а также ингибитора внутриклеточного сАМР с последующей обработкой дцРНК подавляет дцРНК-индуцированный опухолевый ингибитор, Напротив, антипролиферативные дозы натурального человече- 35 ского ИФН-альфа не увеличивают внутри клеточных cAMPóðîâíåé за 24 ч экспе-. римента. Кроме того, два известных ингибитора Н-7 и НА 1004 оказывают минимальное воздействие на опухолевое ингибирование в 40 клетках, обработанных ИФН-альфа, в То время как коклюшный токсин обладает, по-видимому, двухфазным действием, как было указано выше.
Исследуя сАМР-системы с ИФН-индуцированной пролиферацией (Pannlers et al, J. Cell Sci., 48:259, 1981, Banerjee et al, Virology 129:230, 1983, Ebsworth et al, J, СеП
Physlol. 120:146, 1984), обнаружено, что 50 сАМР не связан со степенью антипролиферующего состояния, Что касается дцРНК в этих же системах, то эти исследования ранее не проводились, Исследования, проведенные в настоящем изобретении, 55 подтверждают заключение, что а) днРНК и лимфокины, прототийом которых является
ИФН, имеют разные механизмы действия и в) дцРНК-индуцированная антипролиферация связана с сАМР-системой (в то время как лимфокины — нет).
В этом смысле сАМР является убиквитарной системой по существу, т,е. более или менее все клетки обладают генетической информацией, необходимой для синтеза сАМР при соответствующих стимуляторах.
Эти эксперименты показывают широкие воэможности для использования "несогласованной" дцРНК в модуляции отклоненных от нормы клеток, которые частично или полностью резистентны к ИФН или другим лимфокинам, применяемым в чистом виде.
Кромй того, эти результаты позволяют предположить, что "несогласованная" днРНК действует при помощи двух последовательных механизмов: первый посредством сАМР-киназы, второй посредством модуляции продеинкинаэы C.
В. Синтез протеина.
Внутриклеточный протеин изменяет в дцРНК-обработанных клетках рефлективную прогрессирующую дифференциацию и потерю фенотипа злокачественных клеток, противолимфокинных свойств.
Нормализация клеток после обработки днРНК в некотором смысле изучалась
Soslau et а1, Biochemical and Biophysical Research Communications, 119:941-948, 1984, Метод, в котором клетки опухоли головного мозга (А 1235) обрабатывались антипролиферативной дозой "несовместимой" дцРНК (100,и мlмл) или натуральным человеческим
ИФН-альфа (100 р м/мл), показал значительные различия в характере синтеза протеина в течение периода 72. ч. Синтез протеина является важным параметром, так как показывает нормализацию обработанных атипичных клеток и время продолжительности терапевтического действия, Синтез протеина оценивался путем счета меченных радиоактивным изотопом клеток
А 1235 по отношению к заранее установленному числу клеток. Зти клетки не были обработаны, обработаны лишь ИФН-альфа в концентрации 100,и м/мл, дцРНК в конц.
200р м! мл совместно ИФН-альфа с дцРНК.
Измерения проводились за 24, 48 и 72 ч.
За 24 ч измерений изменения в синтезе протеина по сравнению с контрольным образцом были незначительны, измерения в течение 48 ч показали значительное увеличение синтеза протеина, стимулированного обоимиагентамидцРНКи ИФН, причем при дцРНК-обработке это увеличение значительно выше, чем при ИФН-обработке. Поразительно, что эа 72 ч измерения синтез протеина а клетках, обработанных рцРНК, увеличивается е 3 раза по сравнению с кон2003334
20 трольными, в то время как D клетках, обработанных L4©Н, уровень этот падает до контрольного, Сохранение увеличения в синтезе протеина в клетках, ОбработанныхдцРНК, повидимому, отражает значительные изменения В типах Определенных протеинов, получаемых в результате дцРНК-индуцируемых изменений В клетках к более дифференцирОвэнному или нормализованнОму клеточному фенотипу, Исследование фосфорилирования протеина В карцинаме мочевого пузыря человека, обработанной ИФН-альфа, показало значительные изменения в фосфорилировании количества прОтеинов по сраВнению с необработанными клетками (Soslau et a!, Biochem, В!Орйу, Acta, чо!. 119, 3984, р. 941).
Исследования, проведенные в настоящем изобретении {гели полйакриламида не покаЗВНЬ1) С rtA Г(а1-14 U)A ПОКаэаЛИ ИЗМЕНЕ ния, целиком отлича(ощиеся от результатов, полученных для Обработанных интерферовом клеток. Эти данные, кроме того, более наглядно показывают молекулярные различия между днРНК и лимфокинами исходя из механизма модуляции клеток опухоли, возвраьцения их к более ноомальному ф8нотипу и фундаментальные различия в путях использования В модуляции иммунодифференциации и иммунной активности.
Для специалистОВ Онкологов/иммунологов в практической части изобретения описан ряд способов по выбору определенных протеиновых характеристик злокачественного процесса для данного типа клетки или характеристик регенерации злокачественных клеток давнОГО типа, а также контрольные изменения для ВыораннОГО протеина или Группь. протеинов в свете описаний, представленных в настоящем изобретенИИ (РВКТООЫ, М8НЯЮЛЦИеся QT Ч8ЛОВВКа l( человеку, могут предьявлять собственные требования к дцРНК в течение времени, oqвако это не снижает преимущества изобретения. Надо отметить — наличие необычно высокого уровня нуклеазы или Фосфодиэстеразы мож8т стать поводом для клинициста изменить концентрацию дцРНК В требуемой терапии в противоположность той, что указана в примерах и экспериментах, Исследования синтеза протеина дают
Возможность проследить м8хавизмы, лежащие а его основе. динамику действия лекарственных средств, определить степень этого действия, устанавливая, например, количество нормализОванных KileTOK, Aep_#_" од действия лехэрстeellèî(o .ПР8парата и C какОГО вр8мсни начался ПОЛОжительный эффект, Все з(О почти ве освещалось В известных до настоящего времени работах в этой области.
С. "Собственная" дцРНК, необходимая для противоопухолевой ИФН-активности в опухолевых клетках
Было определено, что противоопухолеВая активность ИФН в опухолевых клетках встречается довольно редко и главным образом, когда ИФН-чувствительные клетки имеют предраннюю "собственную" дцРНК, присущую этим клеткам. Недостающую противоопухолевую активность или достаточное количество собственной дцРНК в клетках можно возместить введением дцРНК для создания условий для необходимого ее присутствия В достаточном количестве.
Известно, что интерфероны индуцируют связанный с дцРНК фермент 2,5 -олигоА-синтетазу, который вовлекается s
20 клеточный ингибитор роста. Открытие, сделанное в настоящем изобретении, показывает, что двухнитиевые РНК "работают" главным образом как кофакторы для.активации фермента, что явно отличается.от того утверждения, что интерфероны индуцируют этот фермент, Эти действия ошибочно совмещают, значительно уменьшая потенциальные возможности для успеха в лечении при помощи каждого агента отдельно или в их сочетании. Было показано, что дцРНК в естественном виде встречается в периферических кровлях мононуклеарных клетках (ПУМК) некоторых индивидуумов с лейкозным ретикулоэндотелиозом, хотя они не были найдены в ПКМК нормальных индивидуумов..Действительно, присутствие дцРНК в "волосатых" клетках {H8La) пациентов с лейкозом, видимо, объясняет в первом приближении известную эффективность иниспользуется отдельно и обеспечивает решающую добавочную дихотомию между
ИФН и дцРНК, которая может быть использована терапевтически. Клиническая эффективность интерферона обусловлена индуцированием фермента (2,5 олиго-А-синтетаза) в присутствии предранней внутриклеточной натуральной дцРНК, в то время как экзогенная дцРНК "работает" в значител ьной степени посредством активации ферментов, осуществляя таким образом контроль клеточного роста.
Для подтверждения этой новой гипотезы ядерная PHК была выделена из контрольных и обработанных r ИФН-аА "волосатых" клеток (HeL а), фракционированных на градиенты сахарозы и тестированных на способность активировать Очищенную высокомолекуляр40 терферона в тех случаях, когда интерферон
И 03334
22. ную 2,5 А синтетазу. Ни одна из фракций необработанных MeLa-клеток РНК не могла активировать синтетаэу. Однако гетерогенная ядерная РНК-фракция обработанных
ИФН клеток активировала синтетазу зави- 5 сящим от дозы образом. Горячая денатурация гяРНК устраняла эту активацию. Анализ ферментного продукта, сделанный при помощи жидкостной хроматографии высокого давления (ЖХВД), показал, что были получе-. 10 ны биологически активные 2,S -А тримеры и тетрамеры. Была также фракционирована мононуклеарно-клеточная ядерная РНК из
"волосатых" клеток оольных лейкемией, которые были весьма чувствительны к ИФН- 15 терапии и обнаруживали высокий. уровень 2, 5 А-синтетазы, активирующей дцРНК в гя РН К-фракции. ЖХВД-анализ показал о6разование биологически активных 2,5 А тримера, тетрамера, пентамера и гекаамера 20 (их отношение 53:15:4.1 соответственно).
Нормальная мононуклеарно-клеточная ядерная РНКне показала никакойактивности. Эти результаты показывают, что натуральная ядерная РНК существуетлишь в релевантных 25 клетках, неопластических или, иначе говоря, когда может участвовать в регулирОвании роста посредством ИФН. До настоящего времени существует скрытая и настоятель-. ная потребность в "интерферонном ответе". 30
Это позволило сделать вывод, что недостаток дцРНК.может привести к неэффективности инте рферона, которую можно компенсировать экзогенной дцРНК, Это утверждение вполне можно проверить и под- 35 твердить в клинических условиях, Для большей убедительности, можно . еще раз отметить, что для ИФН-активности необходимо присутствие редкой дцРНК—
"обитателя" в клетках, требующих противо- 40 опухолевой активности. Здесь, по-видимому, для опухолевых клеток требуется восприимчивость/чувствительность к ИФН-терапии.
Некоторые авторы ошибочно группируют
ИФН и дцРНК вместе. Из настоящих иссле- 45 дований очевидно, что дцРНК является кофактором, который активирует фермент
2,5-олиго А синтетазу. Опухолевые клетки, Не-чувствительные к ИФ Н, 6ри добавлении экэогенной дцРНК становятся восприимчивыми к Й дцРНК-терапии. В клетках, реагирующих на действие ИФН, дцРНК, очевидно, имеет трехмерную структуру подобно "несовместимой дцРНК, а именно eon г(С11-14. 0)п.. на основе их биологического и каталитиче- 55 ского сходства, отсутствия токсических свойств, усиленные иммунные функции, сравнимые с цитотоксическими функциями, а также другие характеристики типа сАМР и параметры их противоопухолевого действия.
- Клетки, невосприимчивые к лимфоки. нам главным образом и к интерферонам в частности восстанавливаютсвою восприимчивость сначала при добавлении эффективного количества экзогенной дцРНК для. индуцирования синтеза необходимой внутриклеточной дцРНК, которая участвует в регулировании клеточного роста в сочетании с интерфероном. а затем при добавлении теперь уже терапевтически действующего
ИФН, как уже содержащего необходимую добавку дцРНК.
Д. Реактивность человеческого ксенотрансплантанта опухоли почки.
Восприимчивость человеческого ксенотрансплантанта почки к ИФН и дцРНК абсолютно иная, как показывают описанные ниже исследования на основании наблюдений эа оставшимися долгое время в живых животными.
Использование человеческого опухоле-. вого ксенотрансплантанта у атимичных мышей дало неожиданные и разные реакции на интерферон и дцРНК. Например, человеческая карцинома почки показывала прогрессирующий .рост опухал и и не увеличивала время выживаемости в течение интерферон-альфа-обработки, в то время как при дцРНК-обработке она демонстрировала значительное уменьшение в размерах и черезвычайно увеличивался срок выживания организма. Действительно. после смерти в 2-4-летнем возрасте от естественных причин 95$ всех дцРНК-обработанных мышей не обнаруживали в гистологии, проведенной после вскрытия,,наличия опухоли.
Это было весьма неожиданно, так как лимфокины (например, ИФН) вызывают очень короткую ремиссию рака и имеется всего лишь несколько, если вообще есть. экземпляров животных, у которых не находили опухоли даже по прОшествии нескольких месяцев. Получение 957 выздоровевших по гистологическим критериям и времени выживания явилось весьма неожиданным.
Кроме того, .активность селезеночных клеток "натуральных убийц" (НУ) увеличивалась при дцРНК-обработке животных, в то время как при обработке мышей ИФН НУ-активность не:увеличивалась.
Подобное различие в ингибировании роста опухоли наблюдалось между интерферон-гамма и дцРНК в двух других моделях ксенотрансплантанта, ощутимая разница наблюдалась также при oavrax с челове <еской карциномой РТ4 мочевого пуз иря и человеческой опухолью головного моз а—
35 глиомой А 1235, как было описана, Во всех случаях статистически значительное ингибирование апухалеваго раста наблюдалась у животных, обработанных дцРНК, и минимальное при obp860TKG интерферон-гам"
t48 использованным в чистом виде, Значительная разница наблюдаласьтак>ке в активности селеэеночных НУ-клеток с увеличением НУ-активности при обработке дцРНК и отсутствием увеличения при обработке интерферон-гамма.
Подобный эффект наблюдался в связи с возрастанием иммунаактивнасти, результаты опытов с глиамой представлены в табл.
6. Дозировка: 20000 ед. ИФН/интерферан ежедн. T,р. rin r(C»-34. U) по 2 или 3 раза в неделю (200-500,и r на дозу). Тщательное исследование проб крови, полученных последовательно на протяжении всего времени испытаний из вены хвоста, показала, что днРНК, химический класс которой описан в другом месте настоящего изобретения, мажет быть введена на неопределенное время, не оказывая при атом какого-нибудь неблагоприятнога действия на функции пачек, головного мозга и иммунофункции, т,е, на функции органов, наиболее подверженных токсическим агентам, 8 табл. 6, которая приводится ниже, представлены данные па иммуноактивности клеток селезенки мышей, обработанных
ИФН-гамма и! Или дцРНК. В табл. 6 указаны отношения компонентов исследованной смеси клеток: клеток эффекторав(иммунные клетки, полученные хирургическим путем иэ селезенки животных, которым введен человеческий опухолевый ксенотрансплантайт) и клеток-мишеней (в этом случае опухоль голавнага мозга человека), Клетки зффектаp6i явля1атся иммунными клетками иммуна" системы, а клетки-мишени — клетками исследуемых опухолей, Результаты представлены в аиде процента цитотоксичности в результате обработки ИФН, дцРНК или обоими агентами вместе. Более высокий процент токсичности показывает увеличение ликвидированных опухалевых клеток, Любопытно, чта в этом эксперименте
"убитых" клеток после обработки ИФН-гамма даже меньше, чем контрольных (необработанных), а эффект после обработки отдельно взятой дцРНК больше, чем при обработке комбинаций дцРНК+ ИФН-гамма.
Эффективность дцРНК„особенна rfn г(С11-14, U)n, против человеческой опухоли
f0лавнОго мозга, npvlavlrogf атимичным мышам, сравнивается с эффективностью ИФНгамма. Опухоли измерялись на 10-й день и
rfo 3j-й день.после начала эксперимента, дцРНК оказалась более эффективной a огношении уменьшения размеров опухали па сравнению с эффективностью ИФ,-3, которая оказалась чуть ли не меньше контроль най, Е. Клинические г3римеры лимфакин-устойчивых опухолей, которые восприимчивые к днРНК.
Была разработана альтернативная методика, отличная от методики для моделей работы с животными, для оценки ОпухалеBOA восприимчивости или резистентнОсти, в которой представлена возможная клиническая синергия для комбинации ИФН и дцРНК-терапии. Одним из таких методик является метод калогеннага анализа, разработанного Harnburber u Salmon (Prima.ry
Bioassay of Human Tumor Strm Cells Science
197:461-463, 1977), который может реально предсказать восприимчивость или резистентнасть организма и-3циента v. лекарственным противоапухалевым средствам с высокой точностью 90 — 95 надежности для неактивных средств и 75 — 80;4 для активных.
В соответствии с методикой, разработанной НатЬаг9ег и SalfT)on, калагенный анализ проводится следующим образам, Иэ свежих опухалевых клеток или клеток, взятых от больных лейкемией, приготавливается манаклеточная смесь. Заранее определенная концентрация выбранного терапевтического агента, прасчитанная из литературных источников или методических рекомендаций, вносится в чашку с агаравай или метилцалгпалазнай средой или в клетки после посева. Клетки, очищенные и в fees!Iные в агаровую или метилцеллюлаэную ñðeду, инкубируются в чашке Петри при 37 С, ЧТО ПОЗВОЛЯ8Т ПОЛУЧИТЬ КОЛОНИЮ КЛЕТОЧНЫХ культур, В соответствии с определенным заранее периодом клеточного роста колании клеток наблюдаются визуально при помощи микроскопа и числа их в каждой чашке Петри просчитывается. Биологически и клетачные смеси колоний изучались весьма тщательна, включая марфалаги а клетки, .:эриалаги,а, иммунологию и поведение клеток в атимичных мышах. Клетки исследовались при помощи манакланальных ангител проб нуклеиновыми кислотами. Калагенный анализ представляет собой надежное !1i)! ближение к анализу опухалевых клеток на химическую чувствительность in нага, Калагенный анализ на нескольких Опухолевых образцах мажет быть праведен в лаборатории, В противоположность Ожидаемому недостатку противоопухолевой GK тивнаст л, отмеченной ff различных рабатах
2003334
26 по раковым исследованиям (Compilation of
Phase 0. Results with single Antineoplastlc
Agents. U.S. Departmen of Health and Human
Services, Public Health Service, National
Institutes of Health, volume 4, 1985), которые описывают около 100 образцов животных, полученных поли I поли С-обработкой и оказавшихся абсолютно нечувствительными или . частично чувствительными к используемому агенту, в настоящем исследовании наблюдалось 42% из предсказанных реакций на обработку "несовместимой" дцРНК в широком спектре разновидностей твердых человеческих опухолей, «оторые известны своей нечувствительностью к полинуклеотидной терапии, По предварительным клиническим оценкам опухоли. рассматриваемые как чувствительные показатели, дают более 60% уменьшения в числе опухолевых клонов.
Большое количество подобных тестов как в лабораториях, так и в клиниках было проведено на индивидуумах для определения их опухолевой чувствительности к различным генетически классам ИФН и/или различным типам интерлейкинов. В частности, пациенты, участвующие в дцРНК-экспериментах, до этого были подвергнуты безуспешному клиническому лечению мнтерфероном или интерлейкинами дозами, обосновано взятыми из опубликованных медицинских данных. Во всех этих примерах применение определенных лимфокинов оказалось безуспешным для предупреждения роста опухоли, в большинстве примеров иммунные клетки оставались неизменными, во многих примерах наблюдалось фактическое уменьшение опухоли в размерах по сравнению с ее размерами до обработки лимфокинами в чистом виде.
Лабораторно-клинические исследования настоящего изобретения установили по крайней мере три неожиданных результата:
Выбранная "несовместимая" дцРНК эффективна, когда неэффективен поли I поли С.
Выбранная "несовместимая" дцРНКзффективна, когда неэффективен ИФН, испол ьзуе мы и отдел ь но.
Синергизм имеет место, когда выбранная "несовместимая" дцРНК и лимфокин используются в сочетании.
В табл. 7 преДставлены относительные значения восприимчивости различных гистологических типов человеческих опухолей к "несовместимой" дцРНК. Эксперименты показывают более. чем 40% восприимчивости к несовместимой" дцРН К, т.е. дцРНК со специфической молекулярной структурой, различного класса опухолей, особеннотвер10
20 были использованы для количества rln ф/ц
45 ма, 50% рака груди. 80% рака я ич ника и 65% рака почкидля комбинированной ИФН-аль50
35 дых опухолей, при этом устойчивые к "чистым" лимфокинам опухоли являются в то >ке время восприимчивыми к "несовместимой" дцРНК.
Эти результаты являются неожиданными по двум причинам: известной биоинертности дцРНК вообще и клинического отсутствия пользы в лимфокинах, Были изучены результаты воздействия
ИФН-альфа, ИФН-бета и "несовместимой" днРНК в кологенном анализе для меланомы. Процентное содержание контрольных клеток выведено по отношению к дозе
rl> (611-14, U)n в микрограм мах из мл и в ед.
ИФН/мл для интерферонов.
Рассмотрено также синергистическое антипролиферативное действие ИФН-альфа и rln г(Си. U)n в человеческой карциноме почки в тех же единицах. В комбинации
0)п50и 100 рг/мл. Концентрация ИФН-альфа колеблется s пределах от 0 до 3000 ед.
ИФН/мл, которая значительно выше нормальной ИФН-альфа терапевтической концентрации.
В начале отсчета имеется разрыв линий, обозначающий отсутствие действия на контр. колонии для О ИФН, около 62% для
50 и 50% для 100 r4 ф.1, U)n и затем для
100 ед. ИФН/мл ИФН-альфа.
Как показывают эти данные, ИФН-альфа в чистом виде не.эффективен в клинически приемлемых дозах, его эффективность наблюдается при более высокой дозировке на цитотаксичном уровне, уровне слишком высоком для клинического использования.
Результаты этого исследования показали, что для эффективности терапия количество ИФ Н должно быть уменьшено до клинически приемлемого уровня и, вероятно, дополнено или заменено другими антипролиферативными агентами.
Определенные примеры синергистического действия наблюдались 63% меланофа + гЬ г(С 2. U)n-терапии, Таким образом, из этих результатов можно заключить, что а) применение определенной "несовместимой" дцРНК в лимфокин-устойчивых состояниях будет иметь пользу в клинической терапии, в) в случае резистентности организма к.дцРНК в чистом виде приемлемая комбинация слимфокинами оказала бы благоприятное терапевтическое действие в большинстве случаев.
Г. Три клинических преьмера, под1верждающих эффективность настоя щего изоб ретения
2003334
Пациент 1 — злокачественная меланома.
Пациент 1 — мужчина средних лет, имеющий злокачественную меланому, клинически невосприимчивую к ИФН и 1
2-терапии. Введение днРНК(300 мгдважды в неделю) в результате привело.к полному рассасыванию опухоли (рассчитывалось количество массы опухоли) за период 86-дневной терапии. Этот благоприятный эффект сохраняется приблизительно 2,5 года ет начала лечения. В настоящее время поддерживается доза между 50 и 100 мг 2 раза s неделю.
Дозировка определялась при учете клиниче; ской восприимчивости в свете лаб@мторных параметров, включающих относительный уровень 2,5 А-синтетазы и способность обнаруживать активные биохимические посредники в дцРН К-индуцируемом эффекте„ таких как циклические АМР-уровнй, описанные выше, или существование определенных классов 2,5 -А молекул, в также . усиление иммуноклеточной активности, Наблюдалось почти одновременное увеличеwe 2,5 -А синтетазы, сАРМ и биоактивных
2,5 -А олигомеров, в то время как ни один из них не был обнаружен при лимфацит-терапии или в период неэффективного лечения, Различные олигомеры измерялись в интервале 25 дней до терапии и 1. 23 и 55 дней после начала днРНК-терапии. Низкий молекулярный вес олигомеров 2,5 -А (димеры), определенный в лаборатории заявителя и в другом месте, делает его особенно биоинертным в отношении антипролиферативных, противовирусных и иммуноусиливающих свойств.
Подобный биохимический феномен обьясняется длительным увеличением активируе мой лимфокинами акти вностй клеток-"убийц" (! AK); в результате чего наступает стабильное состояние болезни и/или значительная регрессия опухоли, которая измерялась повышенной I AÊ-активностью(как ф расщепления 5 Cr) у пациентов при стабильном состоянии болезни (карциноидный рак}, после 30-месячной терапии дцРНК и для сравнения у пациентов, не получивших дцРНК-терапию, и нормальных или контрольных пациентов. Эти данные использовались для контроля относительного количества терапевтических агентов, требуемогодляблагоприятного клинического эффекта в течение ной дозы всего лишь 1,5 м ед. ИФ Н и 300 мг дцРНК, вводимой дважды в неделю. Подобно случаю с хронической лейкемией зта лечебная схема вызвала продолжительную ремиссию у большого количества (по процентному содержанию) пациентов, в то время как у пациентов, получивших лечение лишь ИФН-альфа, такого эффекта не наблю- . далось, Пациент 3.
Пациент 3 — мужчина средних лет с
ИФН-резистентной опухолью почки, у которого в самом начале лечения наблюдалось быстрое уменьшение опухоли одновременно с изменением профиля 2,5 -А олигомеров, быстрое нарушение пути метаболизма
30 в сАМР и резкое увеличение иммуноактивности. Эти важные клинические и лабораторные данные сохранялись в течение 36 мес, никаких побочных эффектов данная те35 рапия не обнаружила
Подобное, благоприятное клиническое действие описанной терапии наблюдалось у большинства лимфокин-устойчивых опухолей, включая наиболее летальный и неактив40 ный типы . рака легких. Приведены зависимости НУ-клеточной активности (в литических единицах) и соответствующие размеры медистианальной опухоли {в мм ), измеренные СТ-сканированием. Результаты были получены в начале и после завершения длившейся около 400 дней терапии "несовместимой" дц РНК. Пациент показал пол ную восприимчивость к терапии, что подтвердилось измерениями размера опухоли.
50 (56) Патент ЕР М 0113162, кл, А 61 К 31/70, 1984. длительного периода времени. например для поддержания терапии после начала контроля даже при лимфокинной резистентности.
5 Пациент 2.
Особого внимания заслуживает тот факт, что опухолевые метастазы в костях могут быть в значительной степени редуци рованы при помощи терапии дцРНК и ИФН, 10 взятых в сочетании друг с другом. Напри мер, пациент 2 с раком почки и обширными костными метастазами показал быструю и продолжительную восприимчивость к укаэанной терапии после получения им днев29
2003334 дцРНК может быть поли I п оoл и С, 0 в
Таблица 1
Индукция интерферона в дцРНК-обработанных клетках человеческой глиомы котором отношение С к 0 составляет около 6
Таблица 2
Антитела к интерферонам не ингибируют вызванную дцРНК антипролиферацию в клетках человеческой глиомы
П р и м е ч а н и е, Результаты представлены впроцентахот контрольной культуры за 24 ч.
НД . не делалось..
Таблица 3
2003334
Таблица 4
Таблица Б
Таблица 6
33 .
И)03334
Продолжение табл. 6
Таблица 7
Число Воспри- Число p83NcT. восприимч. им.
Гистологический тип
Рак матки
Глиобластома
Карцинома легких
Рак почки
Карциноид
Карцинома предстательной железы
Рак яичника
Рак молочной железы
Меланома
Рак прямой кишки
Саркома
Рак пищевода
Эндотиэлома
Рак поджелудочной железы
Рак желудка
Медуллообластома
420
Всего целью повышения зффективности лечения, в качестве рибонуклеиновой кислоты используют Амплиген в количестве, достигающем 50- 300 мг на 1 мл крови сразу же после. введения лекарства или после его введения в сочетании с интерфероном, Составитель С.Мельникова
Редактор М. Стрельникова Техред М.Моргентал Корректор Е. Папп
Тираж ПодпиСное
Н ПО "Поиск" Роспатента
113035, Москва, Ж 35, Раушскаа наб., 4/5
Заказ 3291
Производствен но-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул. Гагарина, 01
Формула изобретения
СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ БОЛЬНЫХ С ОПУХОЛЯМИ путем коррекции иммунных нарушений двухцепочечной рибонуклеиновой кислотой, отличающийся тем, что, с
3
33
4
1
0
0
1
1
9
2:
52
36
36
36
13
0
0
