Штамм бактерий escherichia coli - продуцент l-гистидина

 

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

Комитет Российской Федерации по патентам и товарным знакам (21) 5034791/13 (22) 30.03.92 (46)-30.1 1.93 Бюл. ¹ 43-44

P1) Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов (72) Клячко Е.В.; Шакулов P.Ñ„Äåáàáîâ В.Г„Козлов

Ю.И.

{73) Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов (в) RU (и) 2ООЗ677 С1 (51) 5 С ИЫ1 2,0 С 12Р13 24

{54) ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA CQLI—

ПРОДУЦЕНТ 1;ГИСТИДИНА (57) Использование: микробиологическая промышленность. Сущность изобретения: новый штамм бактерий Escherichiacoti ВКПБ  — 5945 продуцент

L-гистидина. Путем введения внеоперонных мутаций в один из штаммов Е coii создан продуцент незаменимой аминокислоты 1=гистидина. Штамм— продуцент устойчив к канамицину, стрептомицину и арсенату натрия и позволяет получать 10 — 1 2 г/л

L-гистидина в культурапьной жидкости. 3 табл.

2003677

Изобретение относится к микробиологической промышленности и биотехнологии и представляет собой штамм бактерий

Escherichta coll, продуцирующий незаменимую аминокислоту L-гистидин. L-гистидин используют в качестве компонента питательных смесей медицинского назначения, как ростовой фактор дпя ряда продуцентов первичных метаболитов, а также как реактив для биохимическои и фармацевтической промышленности.

Существуют различные штаммы бактерий-продуцентов L-гистидина. Наилучшим из известных в настоящее время продуцентов L-гистидина является штамм бактерий

Corynebacterium glutamicum.Этот продуцент бып получен в ходе мутагенеэа аналого-резистентных штаммов, способных накапливать за 72 ч до 13,8 г/и L-гистидина (патент США 3713977). Вместе с тем, до настоящего времени неизвестны эффективные продуценты L-гистидина на основе

Е.соИ. Наилучший штамм Е. соИ продуцирует до 2-3 г/л 1=гистидина за 72 ч ферментации и представляет собой рекомбинантный штамм, который содержит гистидиновый оперон или его фрагменты на мультикопийных ппазмидах (патент США 4388405). Этот штамм выбран в качестве прототипа.

Недостатком штамма-прототипа явля ется его низкая продуктивность, Представляется важным создать на основе наиболее генетически изученного в настоящее время микроорганизма — бактерии

Е.соИ продуцент незаменимой аминокислоты L-гистидина, который позволяет получать большие количества гистидина.

Предлагаемый штамм Е.соИ 24 дает возможность нарабатывать за 72 ч ферментации в лабораторных условиях 10-11 г/л гистидина.

Для создания штамма-продуцента в исходньiA штамм с мутацией в гене Ыэб вводят ряд внеоперонных мутаций, повышающих экспрессию гистидинового оперона. Этот исходный штамм накапливает в среде за 72 ч ферментации 0,3-0,5 г/л гистидина. Созданный штамм-продуцент

Е.coll 24 отличается от исходного штамма тем, что способен к более эффективной продукции гистидина с высоким коэффициентом конверсии. Данное отличие достигается целенаправленным изменением исходного штамма, приводящим к усилению транскрипции гистидинового оперона, а также внесением мутаций, обеспечивающих реэистентность к стрептомицину и арсенату натрия. Предлагаемый штамм позволяет получать 10-11 г/и гистидина за 72 ч ферментации в лабораторных условиях при тем6,05

2,0

0,2

1,0

2,0

Устойчив к канамицину, стрептомицину и арсенату натрия. Содержит мутацию по

АТФ-фосфорибозилтрансферазе (hisG), следствием которой является нарушение пературе 29-30 С. Гистидин накапливается в культуральной жидкости.

Полученный продуцент гистидина Е.coll депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов под регистрационным номером ВКПБ-5945.

Штамм бактерий Е. coll ВКПМ-5945— продуцент L-гистидина имеет следующие культурально-морфологические и биохимические признаки.

Культурально-морфологические признаки.

Грамотрицатеп ьная слабоподвижная палочка с закругленными концами длиной

1,5-2,0 мкм. Спор не образует.

На полноценной агаризованной среде (агар Луриа. агар Хоттингера) через 48 ч инкубации при 30 С образует круглые беловатые полупрозрачные колонии диаметром

20 2 мм. Поверхность колоний гладкая, края ровные, центр колоний приподнят, структура однородная, консистенция пастообраэная, легко эмульгируются.

На синтетической среде клетки проду25 цента требуют витамин В>, а также 1=пролин, Штамм поддерживают на чашках с плотной синтетической солевой средой следующего состава, г/л;

Глюкоза 10,0

Трис-(оксиметил)-аминометан

Сульфат аммония

Сульфат магния

Цитрат натрия

Калий хлористый

Калий фосфорнокислый одноэдмещенный 0,028

Тиамин 0,002

Пролин 0,1

Стрептомицин 1,0

Канамицин 0,05

Агар 20

45 Вода дистиллированная, л . До t, рН 7,4-7,6

Физиолого-биохимические признаки.

Штамм является ауксотрофом по проли50 ну. Факультативный анаэроб. При посеве уколом в полноценный агар хороший рост по всему уколу, Желатину не разжижает.

Усваивает глюкозу, мальтозу, маннит, галактозу, сорбит, глицерин, Не потребляет сахарозу. лактозу, рафинозу.

2003677 ретроингибирования первого этапа биосинтеза гистидинам, Усваивает азот в форме аммония, нитратов, а также азот некоторых органических соединений.

Растет при температуре 43 С и ниже.

Оптимальной для роста является температура 37 С..а для продукции гистидина

29-30 С.

Растет на жидких средах с рН от 6,0 до

8,0, Оптимальное значение рН 7,0.

Хранение штамма. Посевной материал смешивают с равным объемом 80%-ного глицерина и хранят при -70 С.

Пример 1. Введение мутации ЫзТ.

В штамм E.coll{hisG) с нечувствительной к гистидину АТФ-фосфорибозилтрансферазай трансдукцией вводят мутантный ген hisT. Ген hisT кодирует псевдауридилатсинтазу 1 — фермент, который превращает уридиновые остатки в антикоданавой области тРНК в псевдоуридиновые. Использованная мутация в гене hisT приводит к накоплению тРНК с пониженным содержанием псевдоуридиновых остатков. Наличие в клетках Е. соИ измененной тРНК вызыЫв вает усиление транскрипции гистидинового оперона. Активация транскрипции происходит, по-видимому, из-за замедления трансляции лидерного- пептида аттенюаторнай области his-аперана.

Трансдукцию проводят с помощью фага

Р1 так, как рекомендовано в руководстве

Миллера. У трансдуктантав определяют уровень накопления гистидина в культуральной жидкости через 72 ч культивирования. Культивирование проводят так, как описано ниже в примере 3. Среда для культивирования содержит компоненты, перечисленные в примере 3, за исключением стрептомицина, который в данном случае в среду не добавляется. Данные по накоплению гистидина в культуральной жидкости исходным штаммом и штаммом с gisT-мутацией приведены B табл.1.

Пример 2, Эффект введения мутации по гену rpsL, который придает клеткам устойчивость K стрептомицину (зтгй)..

В штамм Е.coll gfsG" hlsT трансдукцией вводят мутантный ген rpsL, Трансдуктанты становятся устойчивыми к.1-2 мгlмл стрептомицина. Эффект этой мутации на продукцию гистидина проверяют, культивируя трансдуктанты так, как описано ниже в примере 3, Данные по накоплению гистидина в культуральной жидкости приведены в табл.2, Пример 3, Отбор устойчивых к арсенату натрия мутантов. Накопление гистиди1,125

0,01, 0,001, 2,8, 0,5

1,0 на в культуральной жидкости мутантного штамма-и родуцента, Биосинтез гистидина — энергоемкий процесс, требующий участия АТФ и фосфо5 рибозилпирофосфата, Для стимуляции образования макрозргических метаболитав„ подобных АТФ, используют арсенат натрия — токсический аналог неорганического фосфата, Клетки, устойчивые к (АзО ), образу10 ют большее количество макрозрготических метаболитов, чем обычные.

Отбирают спонтанные мутации, обеспечивающие устойчивость к 4 мМ арсената Na.

Затем среди отобранных спонтанных му15 тантов выявляют такие, которые при культивировании накапливают в культуральной жидкости гистидлна больше, чем родительский штамм.

Культивирование проводят следующим

20 образом.

Посевную среду инакулиру ат бактериями, выращенными на минимальной агаризованной среде при 29 С в течение 48ч.

Посевной материал получают выращивани25 ем в пробирках объемом 50 мл, содержащих

2 мл среды, помещенных на термостатируемую круговую качалку(200-240 об/ мин), при

29 С в ечение 20 ч. Состав посевной среды, r/ë:

30 Глюкоза 56

Амман ий сернакислый 28

Калий фосфорнокислый одно35 замещенный 2125

Магний сернокисл ы й, 7-водн ы и

Железо (ll) сернокислое, 7-водное 0,01, 40 Марганец (il) сер«окисл ый, 4-водный

Тиамин

Автолизат дрожжей

45 Пралин

Стрептомицин

Вода дистиллированная, л До 1, рН 7,0

50 Затем в колбу обьемом 250 мл, содержащую 10 глл ферментацианной среды, вносят

5% посевного материала и инкубируют «а круговой качалке (300 аб /мин) при 30ОC.

Ферме«тационная среда отличается от по55 севной среды только добавлением 22 г мела на 1 л посевной среды, По окончании ферментации клетки отделяют центрифугираванием, а гистидин определяют колориметрически в культуральнай жидкости после хроматографии на пластинках Си2003677

Таблица1

Таблица2

Таблица3

В-5945 - продуцент1„-гистидина.

"Формула изобретения

Штамм бактерий Escherlchla соИ ВКПМ

Составитель P.Шакулов

Техред М.Моргентал

КоРРектоР П,Гереши

Редактор Л.Павлова

Тираж Подписное

НПО "Поиск" Роспатента

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Заказ 3308

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород. ул.Гагарина, 101 луфол. Через 72 ч ферментации культуральная жидкость содержит 11,6-11,8 r/n гистидина. Данные по накоплению гистидина родительским и арсенат-устойчивым штаммом в культуральной жидкости приведены в табл.3. (56) 1. Патент США М 3713977, кл. 195-29, 1973.

2. Патент США М 4388405, кл. С 12 N

1/20, 1983.

3. Аствацатурянц Г.В., Лисенков А.Ф., Смирнов 10.В., Шакулов P.Ñ. Генетика, т.

XXIV.1988, с. 1928-1934.

4. Лисенков В.Ф.. Аствацатурянц Г.В., 5 Смирнов Ю.В., Ежель С.А., Шакулов Р.С.

Молекулярная генетика, микробиология и

: вирусология, 1988, с. 37-43.

5. Миллер Дж. Эксперименты в молекулярной генетике. М.: Мир, 1976.