Штамм бактерий bacillus subtilis - продуцент инозина

 

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ

К ПАТЕНТУ.

Комитет Российской Федерации по патентам и товарным знакам (21) 5061178/13 (22) 01.09.92 (46) 30.11.93 Бюл. Йа 43-44 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов (72) Казариновэ IlA. Преображенская Е.С„. Шакупов

P.Ñ„Màðêîâ В.Ф„Ципанов Н.П„Гуляева ДА; Савина

Н.Н. (73) Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS SUBTILIS—

ПРОДУЦЕНТ ИНОЗИНА (57) Область иаюльзования: изобретение относится к микробиологической промышленности и касается микробиологического способа получения инозина (рибоксина). Сущность изобретения: новый штамм

Bacillus subblis AS115 — ? (ВКПМ В - 6134) получен генетикоселекционным путем после обработки (В) RRU U(11) 2003678 С1 (5Ц 5 C 12 N 1 ZO С 12 Р 19 40 штамма В. Subtitis ВНИИгенетика 72 нитрозогуанидином и введения в его геном ряда последова— тельных мутаций — реверсии по признаку ауксотрофности по урацилу и резистентности к повышающимся концентрациям арсената (до 3 мМ.). Полу— ченный штамм приобрел вследствие мутации ре— зистентности ряд полезных свойств, улучшающих его технологические характеристики по сравнению с исходным штаммом ВНИИгенетика 72. Штамм AS

115 — 7 отличается улучшенным ростом, повышенными стабильностью и продуктивностью. Максимальный уровень накопления инозина в оптимальных условиях культивирования составляет у штамма

AS 115 — 7 40 — 45 г,п, тогда как у штамма ВНИИгенетика 48 — 30 — 40 г/л. Наиболее ценным свойством, отличающим штамм As — 115 7, является его способность к активному накоплению инозина при недостаточном снабжении среды кислородом.

2 табл.

2003678

15

25

35

45

55

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается способа получения инозина (рибоксина) методом микробиологического синтеза.

Инозин — пуриновый рибонуклеозид используется в медицине при лечении ряда заболеваний, связанных с нарушениями в деятельности сердца, печени, клеточного метаболизма. Лекарственный препарат рибоксин, созданный на.основе инозина, оказывает стимулирующее действие на окислительно-восстановительные процессы в клетке, улучшает ее энергетический баланс. Инозин может быть использован как сырье при получении других высокоэффективных лекарственных препаратов (сафинора, ЛМФ, АТФ и др.) и как предшественник в синтезе инозиновой кислоты, которая находит широкое применение в пищевой промышленности в качестве вкусовой добавки.

Разработка путей наиболее экономичного получения этого соединения в промышленных масштабах является наиболее актуальной задачей.

В способах получения инозина, описанных в патентной литературе, используются мутантные штаммы микроорганизмов, полученных с применением различных селекционных подходов, В ряде патентов описаны мутанты Bacillus ЯцЬ|йз и Bacillus pumilis, ауксотрофные по аденину, накапливающие значительные количества инозина.

Введение этих штамов мутации реэистентности к структурным аналогам пуринов (азаксантину, азагуанину, декоинину, псикофуранину) позволило ограничить строгий негативный контроль биосинтеза пуринов— главное препятствие в накоплении инозина в избыточных количествах (патент США №

3616206, 3616207, 3620922, 3625825, 3912587, 3960661, 4283346, 4452889; евр. патент № 00808644; патент Японии ¹

41915/1982, 175493/1983, 17592/1983). В некоторых патентах предложены способы получения инозина с использованием мутантов B.Subtliis, резистентных к сульфамидным препаратам (патент США ¹

3960661; патент Японии № 55162998А), Другой способ селекции продуцентов инозина, предложенный в патентах США N 4701413, Франции N 2531100 и Великобритании ¹

3185372, основан на отборе высокопродуктивных мутантов, устойчивых к антифолатам.

С развитием генно-инженерных подходов появилась возможность целенаправленного молекулярного клонирования генов, ответственных за биосинтез пуринов. В патентной литературе появились сообщения о конструировании штаммов-продуцентов инозина, содержащих клонированные гены, связанные с биосинтеэом пуринов (патент США N- 4749650; патент Великобритании N 3185372; евр. патент № 0273660, 0286303А, 0412688Af; патент Японии № 58158197, 5928470), Однако уровень накопления инозина продуцентами такого типа остается все еще недостаточно высоким для их коммерческого использования.

Из всех описанных в литературе штаммов В subtills наиболее активным является штамм ВНИИгенетика 48 (ВКПМ В-1796 ), описанный в авт, св, СССР N- 790781, который накапливает до 30-40 r/ë инозина. По совокупности признаков (вид продуцента, состав питательной среды) и достигаемому эффекту (уровень накопления инозина) штамм ВНИИгенетика 48 следует рассматривать как прототип изобретения.

Особенность штамма-прототипа состоит в том, что указанный выход достигается в лабораторных условиях лишь при интенсивной аэрации. Неоднократные испытания способа получения инозина по авт. св. СССР

N..790781 на Пензенском комбинате "Биосинтез" показали, что максимальный уровень накопления . иноэина в производственных условиях не воспроизводится из-за аппаратурных ограничений, не позволяющих обеспечить достаточно высокий уровень снабжения среды кислородом, Поэтому в настоящее время инозин производят на Пензенском комбинате "Биосинтез" при использовании штамма В subtllls

ВНИИгенетика 72 (ВКПМ В-3157), описанного в патенте N. 1228491. Максимальный уровень накопления инозина этим штаммом в производственных условиях составляет 27 г/л. Вместе с тем культура штамма ВНИИгенетика 72, так же как и штамма ВНИИгенетика 48, для максимального накопления инозина требует интенсивного снабжения среды кислородом. В условиях недостаточной аэрации клетки преждевременно стареют, их жизнеспособность снижается и наступает лизис, Недостатки штамма-прототипа заключаются в следующем: недостаточно высокий уровень накопления инозина; низкая эффективность использования углеводного сырья на единицу продукции; потребность в интенсивном снабжении среды кислородом.

Целью изобретения является улучшение технологических свойств штамма-продуцента, а именно увеличение максимального уровня накопления инозина;

2003678

40

55 снижение расхода глюкозы на единицу продукции; снижение потребности в интенсивной аэрации.

Это достигается получением нового штамма Bacillus subtllis As 115-7, депонированного во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов под номером

ВКПМ В-6134, Штамм As 115-7 получен генетико-селекционным путем после обработки штамма В.subtllis ВНИИгенетика 72 нитрозогуанидином и введения в его геном ряда последовательных мутаций — реверсии

rI0 признаку ауксотрофности по урацилу и резистентности к повышающимся концентрациям арсената (до 3 мМ).

Полученный штамм As 115-7 приобрел вследствие мутации резистентности ряд полезных свойств, улучшающих его технологические характеристики по сравнению с исходным штаммом ВНИИгенетика 72. Заявляемый штамм As 115-7 отличается улучшенным ростом на плотных агаризованых средах, повышенными стабильность1О и продуктивностью. Максимальный уровень накопления инозина в оптимальных условиях культивирования составляет у штамма As

115-7 40-45 г/л, тогда как у штамма-прототипа ВНИИгенетика 48 — 30-40 г/л. Наиболее ценным свойством, отличающим штамм

As 115-7 от штамма-прототипа, является его способность к активноГлу накоплени1о инозина при недостаточном снабжении среды кислородом.

Культурально-морфологические признаки.

Грамположительная палочка размером

3,5-5,0 х 0,7-0,8, Способность к спорообразованию резко снижена. Штамм Аз 115-7 отличается от штамма ВНИИгенетика 48 по морфологии колоний. На агаризованной среде Хоттингера после 1-2 сут культивирования при 34-37 С штамм As 115-7 образует более крупные желтовато-серые 4 колонии диаметром 7-8 мм с умеренно извилистым краем. В отличие от блестящих и слизистых колоний штамма-прототипа колонии штамма As 115-7 плотные матовые с шероховатой крупинчатой поверхностью, строго локализованным уплотнением к центру типа "пуговички"и широким уплотнением к периферии в виде валика. На косяках

Хоттингера штрих белесый, матовый, более густой и плотный по сравнению со штаммом-прототипом, На мясопептонном агаре штамм As 115-7 образует колонии диаметром 6-7 мм с уплотнением в центре и к периферии. Штрих густой и плотный. На белково-витаминном агаре (БВА) колонии более крупные и плотные, чем на агаризованной среде Хоттингера и на мясопептонном агаре, На косяках БВА штрих очень густой и плотный, При инкубации в течение 24 ч при 37 С на жидких полноценных средах без встряхивания наблюдается помутнение среды. На поверхности образуется пленка.

При росте на синтетических жидких и агаризованных средах нуждается в добавке аденина. гистидина и тирозина, Культуру поддерживают на косяках с агаризованной средой Хоттингера с добавкой аденина в концентрации 10 мг на 1 л среды.

Физиолого-биохимические и ризнаки, Аэроб, Желатину разжижает.

Крахмал гидролизует слабо.

Молоко пептонизнрует.

На ломтиках картофеля рост умеренный.

Клетчатку не разрушает и не усваивает.

Усваивает глюкозу. галактсзу, 11актозу, фруктозу, мальтозу, маннозу, рамнозу, сахарозу, глицерин, маннит. Не усваивает арабинозу и ксилозу.

Антагонистических свсйсть не обнаруживает. Непатогенен, Устойчив к арсенату в концен-рации 3 мМ. Штамл1 As i I5-7 Обладает наиболее высокой активностью накопления инîзина среди извесTff.,fx Ltз патентной литературы штаммсв. Кроче того, он более эффективно использует глюкозу на образование целевого продукта.

Как следует из данных, приведенных в табл, 1, при культивиpованип штамMë As

115-7 в лабораторных условиях в колбах í" качалке он образует дс 35-45 г/л инозина, в то время как штал1Гл-прототип накапливает

30-40 г/л. При этом степень конверсии глюкозы в целевой продукту заявлясмсго штамма выше, чем у штамма-прототипа.

Для более полной оценки преимуществ предлагаемого штамма в табл.2 привод тся характеристика его активности в сравнании с активнссть1О штамл1а прототипа в услсви ях недостаточной аэрации, К 1 к видно 113 табл.2, за я вл я е мы и ILITA MM

As 115-7 в отличие От штамГ-1а-прототип» при значительном ухудшении условий а,":рации (до 1,0 r 02/л/ч) cox pafff.= I L1LICGl ук1 биосинтетическую активность. Крома тсгс, штамм Аз 115-7 обладает спсссбнсстГ О более эффективно использовать гл1скозу ча синтез инсзина даже в недостаточном снабжении среды кислородом, чтс повышает экономичность процесса и позволяет снизить энергозатраты в процессе культивирования штамма, 2003678

Таблица 1, Сравнение основных показателей, характеризующих заявляемый штамм и штамм-прототип.

Пример . Культуру Bacillus subtllls As

115-7 со скошенного агара Хоттингера переносят в жидкую посевную среду следующего состава, мас. Д:

Глюкоза техническая 2,0 5

Пептон 1,0

Дрожжевой экстракт 1,0 йаО 0.25

Вода До 100

Посевной материал выращивают в кол- 10 . бах емкостью 250 мл, содержащих 20 мл среды, на качалке, делающей 240-260 об/ мин, при 34 С в течение 24 ч. Посевной материал в количестве 4 об.;4 переносят в ферментационную среду следующего соста- 15 ва, мас.%;

Глюкоза техническая 14,0.

Белково-витаминный концентрат . 2,5 20

ИНаИОз 3,0

Mg SOq 0,5

Мел 3,0

Вода До 100 рН среды подводят до 7,3 раствором 25

KOH перед стерилизацией. Среду стерилизуют при 0,8 атм в течение 30 мин.

Процесс ферментации осуществляют в колбах емкостью 250 мл. содержащих 10 мл среды, на качалке, делающей 240-260 об/мин, что соответствует скорости растворения кислорода 4.0 г 02/л/ч, при 34 С.

После 144 ч ферментации в культуральной жидкости накапливается 44,4 г/л инозина.

Таким образом, заявляемый штамм

ВасИ!цэ subtliis As 115-7 обладает следующими преимуществами по сравнению со штаммом-прототипом: превосходит штамм-прототип по максимальному уровню накопления инозина;

Отличается бдлее высокой эффективностью использования глюкозы на единицу продукции, что повышает экономичность процесса; обладает улучшенным ростом и повышенной жизнеспособностью клеток; сохраняет высокую биосинтетическую активность при недостаточном снабжении среды кислородом, что позволяет снизить энергозатраты в процессе ферментации. (56) Патент США М 4749650, кл. С 12 Р

19/40, 1988.

2003678

Таблица2

Накопление инозина заявляемым штаммом и штаммом-прототипом в зависимости от условий азрации

Формула изобретения

Штамм бактерий Bacillus subtilis ВКПМ

;В-6134 - продуцент инозина.

Составитель Л.Казаринова

Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор П.Гереши

Редактор Л.Павлова

Заказ 3308

Тираж Подписное

НПО "Поиск" Роспатента

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул, Гагарина, 101