Рекомбинантная плазмидная днк рва1418, кодирующая альфа- амилазу bacillus amyloliquefaciens и штамм-бактерий bacillus amyloliquefaciens - продуцент альфа-амилазы bacillus amyloliquefaciens
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения фермента альфа-амилазы. Сущность изобретения состоит в том, что методами генетической инженерии созданы плазмида, направляющая биосинтез альфаамилазы В. amyloliquefadens. и устойчивый к действию ряда распространенных флагов бактериальный штамм - продуцент альфа-амилазы. Штаммпродуцент устойчив к эритромицину и позволяет получать до 18 г/л альфа-амилазы. 2 са ф-лы, 1 ил, 2 табл.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Комитет Российской Федерации но патентам и товарным знакам (21) 5034792/.1 3 (22) 30.03.92 (46) 30.11:93 Бюл. Йв 4344 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов (72) Йомантас Ю.В.; Попов Д.Г; Азизбекян P.Р„.
Стеркин ВЭ„Козлов l0N; Дебабов В.Г (73} Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов (54) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК
РБА1418, КОДИРУЮЩАЯ АЛЬФА-АМИЛАЗУ
ВАСИ .1i ASerLOLIquEFAaENS И mTAMM(19) RU (И) 2003689 С1 (51) 5 C12N9 28 C12N15 32
C12N15 56 C12N15 75
БАКТЕРИЙ BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS—
ПРОДУЦЕНТ АЛЬФА — АМИЛАЗЪ| BACILLUS
AMYLOLIQUEFACIENS (57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения фермента альфа-амилазы. Сущность изобретения состоит в том, что методами генетической инженерии созданы плазмида, направляющая биосинтез альфаамилазы B. amyloliquefaciens, и устойчивый к действию ряда распространенных флагов бактериальный штамм — продуцент альфа-амилазы. Штаммпродуцент устойчив к эритромицину и позволяет получать до 18 г/л альфа-амилазы 2 сп. ф-лы, 1 ил„2 табл.
2003689
Изобретение относится к биотехнологии, генетической инженерии и микробиологии и представляет собой рекомбинантную плазмидную ДНК, кодирующую биосинтез альфа-амилазы
В.amytotiquefaclens, а также фагоустойчивый шгамм бактерий В.amyloliquefaclens— продуцент альфа-амилазы.
Альфа-амилаза — это фермент, расщепляющий амилозную компоненту крахмала.
Ее используют в пищевой и легкой промышленности, а также в сельском хозяйстве и медицине.
В настоящее время известны бациллярные штаммы — продуценты альфа-амилазы, созданные методами традиционной селекции, а также методами генной инженерии (1,2,3) .
Известен штамм В,svbtttts, содержащий рекомбинантную плаэмиду с геном альфа-амилаэы В.amytoliquefaciens А50 (4).
Однако использование этого штамма в промышленности затруднено вследствие низкого уровня биосинтеза фермента, плохого роста штамма на промышленных средах и нестабильности рекомбинантной плазмиды при выращивании штамма на среде без антибиотика.
В качестве прототипа выбран штамм
В.sub(itis 65 ВКПМ В-2387 (5), который используется в настоящее время для промышленных целей. Основным недостатком этого штамма является его низкая продуктивностью. Поэтому задача повышения уровня. продукции альфа-амилазы черезвычайно важна. Кроме того, существенным недостатком штамма В.э иЬМИэ 65 является его чувствительность к фагам, что приводит к потерям в производстве вследствие фаголизиса. Поэтому создание фагоустойчивого штамма-продуцента представляет собой важную задачу.
Получены рекомбинантная плазмидная
ДН К рВА1418, кодирующая биосинтез альфаамилазы и фагоустойчивый штамм Bactllus
a myloliquefaciens 65 OR28 (рВА1 418} —. и родуцент альфа-амилазы В.amylotiguefaciens.
Сконструированная рекомбинантная плазмида рВА1418 имеет размер 6,6 т.п.н, и содержит Вав Hl-фрагмет ДНК векторной плазмиды рВА4, размером 4,4 т.п.н., Bam
Hl — Clat — фрагмент ДНК хромосомы
В.amyloliguefaciens размером 2,2 т.п.н„содержащий ген альфа-амилазы
В,amytoliguefactens А50; Clat-BamHI — фрагмент ДНК плазмиды pBR322 размером 035 т.п.н,; а также участки расщепления следующих рестриктаз:
Bam Hl с координатами 0 т.п,н. и 2,55 т.п.н., 55 аэрации — интенсивную мутность.
Физиолого-биохимические признаки.
Клетки растут при температуре от 20 до
45 С при оптимуме рН от 6,8 до 7,5, В качестве источника углерода используют многие углеводы, спирты, органиче5
CtaI с координатой 0,35 т,п.н.; а также гены и генетические маркеры;
amy — ген., кодирующий альфа-амилазу
В.amytoliquefaciens А50, erm С вЂ” ген, кодирующий устойчивость клеток к эритромицину.
Новый штамм Bacillus amyloliquefaciens
65 OR28 (рВА1418) — фагоустойчивый продуцент альфа-амилаэы, секретирующий 780 единиц активности фермента на 1 мл культуральной жидкости (активность фермента определяют .по методике Госстандарта (6), задепонирован, Его регистрационный номер ВКПМ В-5144 во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов.
Штамм продуцент Bacillus
amyloliquefaciens 65 OR28 (рВА1418) получают путем введения известным методом (7) новой рекомбинантной плазмиды рВА1418, кодирующей синтез альфа-амилазы Bacilius amyloliquefaciens А50, в протопласты бесплазмидного штамма Bacillus
arnylotiquefaciens 65 БКПМ В-2387, называемого ранее Bacillus subtitts 65 ВКПМ В2387. В процессе работы сданным штаммом было выяснено, что его следует называть
Bacxillus amyloliquefaciens 65, так как штамм способен усваивать лактозу и имеет систему рестрикции Bam, что является характерными признаками вида Bacillus
amyloliquefactens. Поэтому в дальнейшем штамм ВКПМ В-2387 называют Bacillus а пу)о iquefaciens, Путем отбора из штамма
В.amytoliquefaciens 65 (рВА1418) получают мутант 0R28, устойчивый к фагам Е25, Е26 и Е10, выделенным из промышленных фаголизатов.
Штамм Baciiius amyloquefaciens В-5144 характеризуется следующими признаками.
Морфологические признаки, Клетки прямые, палочковидные, размером 2,5 — 4,0 х 0,5 — 0,8 мкм, подвижные, грамположительные, спорообразующие. Размер спор 1,0 — 1,2 х 0,6 — 0,7 мкм.
Культуральные признаки.
Клетки хорошо растут на простых питательных средах, При росте на мясопептонном агаре, агаре Хоттингера — колонии шероховатые, круглые, матовые, желтоватосерые, край неровный, лопастной. При росте в жидких средах: мясопептонном бульоне, LB-бульоне без аэрации образуют сухую пленку безпомутнения среды, а при
2003689
10
30
55 ские кислоты, в частности D-глюкозу, Dфруктозу, лактозу. Не усваивают ацетат, гала ктозу.
В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной форме, так и в органической форме в виде пептона, аминокислот.
Желатину разжижают.
Индол не образуют, Уреазную активность не обнаруживает, Штамм проявляет устойчивость к эритромицину, обусловленную наличием плазмиды рВА1418.
Штамм устойчив к вирулентным фагам
Е10, Е25, Е26, выделенным из промышленных фэголизатов и препаратов субтилизина
ГХЗ.
Пример 1, Конструирование гибридной плазмидь1 рВА1418.
На чертеже представлена схема конструирования гибридной плазмиды рВА1418.
Для того, чтобы клонировать ген альфа-амилэзы и экспрессировать его, проводят следующие манипуляции, 10 мкг ДН К хромосомы В,amyloliquefaciens
А50, выделенной так, как описано в руководстве Маниатиса и др. (9), обрабатывают эндонуклеазой рестрикции ЯаиЗА в стандартных условиях (9) и смешивают с обработанной таким же образом эндонуклеазой
BamHI ДНК плазмиды рМХ39 (11) в соотношении 1:1 и высаживают, добавляя 2,5 обьема этанола. Образовавшийся осадок растворяют в 100 мкл буфера, содержащего
50 мМ трис-С!, рН 7,5, 10 мМ MgSOn, 50 mM
NaCI, 0,5 mM АТР, и добавляют 5 ед, ДНКлигазы фага 74. Лигирование проводят при
14 С в течение 12 ч. Полученной смесью трансформируют клетки штамма В.subtilis
21гесЕ4 amy4, описанного ранее (12). Полученной смесью трансформируют клетки штамма B.subtilis 21гесЕ4 amy 4, описанного ранее (12), Трансформацию проводят следующим образом: ночную культуру клеток В.subtilis 21 recE4amy4, выращенных в жидкой среде Спицайзена 1 (0,8% глюкозы, 0,04% казаминовых кислот, 0,1% дрожжевого экстракта, 5 мкгlмл L-триптофаза, i,83% К2НР04 0,2% (NH<}2S0< 0,12%
NasCsHs0z х 5,5Т Н20, 0,01% MgSO 4,5 ч с аэрацией при 37 С. Затем клетки разводят средой Спицайзена 11, отличающейся от среды спицайзена 1 тем, что она не содержит дрожжевого экстракта, триптофана, а содержание казэминовых кислот и М9504 составляет 0,02% и 0,07% соответственно, Клетки в такой среде растят 1,5 ч с аэрацией, после чего используют для трансформации, Препарат ДНК инкубируют с полученными клетками при 37 С 2 ч и высевают на агаризованную среду LB с эритромицином (10 мкг/мл) и амилопектиназуром (0,15%), Отбирают клоны, устойчивые к эритромицину и гидролизующие амилопектиназур. Из отобранных таким образом клонов выделяют плазмидную ДНК и называют ее рАА2. Плазмида рАА2 содержит ген альфа-амилазы B,amyloliquefaciens, ответственный за синтез секретируемой альфа-амилэзы, Анализ генетических ипокеров в плазмиде проводят следующим образом. 1, Устойчивость клеток В. subtilis 21 гесЕ4 amy/4, содержащих плазмиду рАА2, анализируют на среде с содержанием эритромицина от 5 мкг/мл до 10 мкг/мл. Данные клетки растут на средах с такой концентрацией эритромицина, 2, Наличие секретируемой альфа-амилазы в клетках B,subtilis 21 гесЕ4 amy/4, содержащих плазмиду рАА2, устанавливают следующим образом: клетки из отдельных клонов наносят а чашку Петри с LB-агаром, содержащим 0,15% амилопектиназур, в виде точек или полос и инкубируют при 37 С 18 — 24 ч. Вокруг выросшей массы клеток образуется прозрачная зона гидрозованного амилопектиназура, Клетки исходного штамма, не содержащие плазмиды, зон гидролиза аминопектиназура не образуют. Активность эльфа-амилазы в культуральной жидкости определяют по методике Госстандарта СССР (6) во время ферментации по гидролизу 1%-ного растворимого крахмала в 10 мМ Na-К-фосфатном буфере, рН 6,0, 0,3 мМ CaClz и 33 мм NaCI, Реакционная смесь содержит 10 мл 1%ного растворимого. крахмала, растворенного в 15 мМ Na-К-фосфэтном буфере, рН 6,0, и 5 мл исследуемого образца (разведенного в 2 мМ ацетатном буфере, рН 6,0, 03, мМ CaCb, 100 мМ NaCl), Контроль вместо исследуемого образца содержит 5 мл буфера для разведения фермента. Пробы инкубируют при 30 С 10 мин. Реакцию ocTaHaaflvlaaloT добавлением к 1 мл реакционной смеси 10 мл 0,1 М раствора XCl. Из полученной смеси отбирают 1 мл и переносят в 10 мл раствора йода, содержащего 0,0025% J и 0,025% KJ, Реакционную смесь выдерживают при 20 С.20 мин и измеряют оптическую плотность раствора при длине волны 656 нм, Контрольный раствор имеет синюю окраску, а опытные образцы приобретают фиолетовый цвет, Контрольный раствором при калориметрировании является дистиллированная вода, Количество прогидролизованного крахмала определяют по формуле 2003689 10 5,885 ХС вЂ” 0,00167 Хп, 55 где 01 — оптическая плотность контрольного раствора; D2 — оптическая плотность опытного раствора; 0,1 — количество субстрата, взятое в пробу, г. Если количество прогидролизованного крахмала меньше 00,2 г или больше 0,06 t, то испытания повторяют, подбирая разведения фермента. Ам и нолитичес кую акти вн ость (АС) в ед/мл определяют по формуле где С вЂ” количество прогидролизованного крахмала, г. n — величина разведения. За единицу активности амилолитических ферментов (АС) принято такое их количество, которое в стандартных условиях расщепляет 1 г растворимого крахмала до декстриноов различной молекулярной массы. Затем ДНК плаэмид рАА2 и pBR322 (9) обрабатывают рестриктазами Hami- и Clal, ДНК плазмиды pUB110 (10) — ферментом BamHl, все смешивают и обрабатывают лигазой, как описано выше, и трансформируют компетентные клетки штамма В,subtilis 21 amy4 гесЕ4 по методу, описанному выше. Трансформанты отбирают на агаризованной среде, содержащей 5 мг/мл канамицина и 0,15 амилопектиназура, Отбирают клоны, устойчивые к канамицину и продуцирующие альфа-амилазу. Из отобранных кло- нов выделяют плазмидную ДНК и называют ее рАА1 (чертеж). ДН К плазмид рАА12 и рВА4 (8) обрабатывают рестриктаэой BamHi, затем лигазой (как описано выше) и трансформируют компетентные клетки штамма В.subtilis 21 amy4 гесЕ4 по методу, описанному выше, Трансформанты отбирают на агариэованной среде, содержащей 10 мкг/л эритромицина и 0,15 амилопектиназура, Отбирают клоны, устойчивые к эритромицину, и гидролизующие амилопектинаур, Из отобранных таким образом клонов выделяют плазмидную ДНК и называют ее рВА1418. Плазмида рВА1418 содержит ген альфа-амилазы В,amylollquefaciens, ответственный за синтез секретируемой альфаамилазы и клонированный на векторе рВА4, который обеспечивает стабильное наследование в отсутствие селективного давления. П р и ме р 2. Конструирование штамма Bacillus amyloliquefaciens 65 (рВА1418). Для трансформации В. amylollquefaciens 65 плазмидой рВА1418 используют метод, описанный в (7). Трансформацию протопластов клеток В.amyloliquefaclens 65 проводят следующим образом. 1 мл с суспензии ночной культуры В,amyloliquefaciens 65 вносят а 9 мл питательного бульона PC и выращивают до титра 10 кл/мл, Клетки собирают центрифугированием (5000 об/мин, 10 мин„200С)., дважды промывают специальной средой SMMP (7), а затем ресуспендируют в среде SMMP, содержащей 100 мгlмл лизоцима, и инкубируют 30 мин при 42 С. Образовавшиеся протопласты промывают средой SMMP добавлением 0,1%-ного бычьего cl вороточного альбумина и испольэу;от для трансформации. Плазмидную ДНК рВА1418 (2-10 мкг) инкубируют 2 мин при ОоС с протопластами клеток В.amyloliquefaciekns 65 и 22o -ным полиэтиленгликолем 6000, приготовленным на буфере SMMP. После десятикратного разведения средой SM M P с 0,1 -ным альбумином трансформированные протопласты выса>кивают центрифугированием {2000 об/мин, 10 мин, 20"С), суспендируют в 1 мл той же среды, инкубируют 2 ч при 30 С и высевают на агаризованную среду ОМЗ с эритромицином (5 мкг/мл). Отбор трансформантов производят 48 ч роста при 37 С. Отбирают клоны, устойчивые к эритромицину (10 мкг/мл), Пример 3, Получение фагоустойчивого мутанта штамма В.amyloliquefaciens 65 ОR28 (pВА1418), Для получения фагоустойчивого мутанта штамма В.amyloliouefaciens 65 (рБА1418) клетки этого штамма в вегетативной фазе роста смешивают с фагами, выделенными из промышленных фаголизатов {множественность инфекции 10), способ выделения фагов описан в (13). Смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 3 ч, высевают на поверхность твердой питательной среды, содержащей 10 мкгlмл эритромицина, и инкубируют 18 ч при 30 С. Выросшие клоны, устойчивые к фагам, после очистки переводят в споры, суспензию спор прогревают при 85 С 20 мин и высевают на поверхность твердой питательной среды для получения отдельных колоний, Отобранные клоны испытывают на чувствительность к фагам Е10, Е25 и Е26, выделенным из промышленных фаголизатов. Чувствительность к фагам оценивают качественно, используя капельный метод, заключающийся в том, что на поверхность твердой питательной среды высевают верхний слой полужидкого 0,70 агара, содержащего клетки испытуе 2003689 5 20 мого штамма в титре 10, и наносят фаголиа эат (14), По наличию зоны лизиса судят о фагочувствительности. Используют также количественный метод двухслойного титрования. Для этого на поверхность твердой питательной среды наносят 0,7 -ный агар, содержащий клетки испытуемого штамма в титре 10 и соответствующие разведения а фагов (14) . Клоны, устойчивые к фагам. оценивают по уровню продукции секретируемой альфа-амилазы, B результате экспериментов был отобран штамм OR28, который продуцировал альфа-амилаэу на уровне исходного штамма и был устойчив к фагам, выделенным из фаголизатов, Результаты этих экспериментов представлены в табл, 1. Пример 4. Получение альфа-амилазы с помощью рекомбинантного штамма Bacillus amyloliquefaciens 65 OR28 (рВА1418) ВКПМ В-5144). Накопление альфа-амилазы В.amyloliquefaciens в культуральной жидкости штаммов В.amyloliquefaciens 65 OR28 (рВА1418) (ВКПМ В-5144) — заявляемый штамм и в культуральной жидкости В.amyloliquefaciens 65 ВКПМ В-2387(прототип) изучают при культивировании их в промышленных ферментационных средах следующего состава, г/л: картофельный крахмал, осахаренный альфа-амилазой, 100, кукурузный экстракт 24, белково-витаминный концентрат или пивные дрожжи 3, лактоза 2,8; (NH 7Н О 0,14, CuSO< 0,0038, NaCI 0,3, рН 7,2, Штамм В.amyloliquefaciens OR28, содержащий стабильно наследуемую плазмиду рВА1418, выращивают на среде без антибиотика, как и штамм-прототип, не содержащий плазмиду. Процесс ферментации проводят в качалочных колбах объемом 750 мл, содержащих по 100, мл ферментационной среды, Колбы инкубируют при 37 С на качалке с интенсивной аэрацией (240 об/мин), Активность фермента в ходе ферментации определяют по методу, описанному в примере 1, Данные по накоплению альфа-амилазы В.arnyloliaquefaciens в культуральной >кидкостью А.amyloliquefaciens 65 OR28 50 (р ВА1418) (В КП M В-.5144) и В.amyloiiquefaciens 65 во время ферментации суммированы в табл. 2, Из анализа данных, представленных в табл. 2, ясно, что предлагаемый в данной заявке рекомбинантный фагоустойчивый штамм — продуцент альфа-амилазы— B,amyloliquefaclens 65 OR28 (рВА1418) (ВКПМ В-5144) позволяет получать в 2 раз больше секретируемой альфа-амилазы, чем штамм-прототип (до 80 ед/мл) без селективного давления. Удельная активность альфаамилазы В.amyloliquefaciens составляет 50 ед. ГОСТ/мг, Таким образом, штамм B,amyloliquefaciens В-51454 продуцирует до 18 г/л альфа-амилазы, В.amyloliquefaciens В-5144 продуцирует до 18 г/z, альфа-амилазы. Штамм продуцент хорошо растет на стандартных промышленных средах. (56) 1. Патент США ¹ 3808102, кл, 195— 65. 2. Авторское свидетельство СССР N538024,,кл. С 12 N 13/10. 3, Патент ФРГШ N 2218733, кл. С 12 М 13/10. 4. Сорокин А.В. и др. Молек. ген., микрбиол. вирусолог., 6. 27-29, 1986, (56) 5. Авторское свидетельство СССР N 1089118, кл, С 12 N 9/28, 1986. 6. Методы определения амилолитической активности ГОСТ 20264. 4-74, 7. Vehmaanpera J. FEMS Microbiol.Lett., 49, 101, 1988. 8. Авторское свидетельство СССР N 1615180. 9, Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. M,: Мир, 1984. 10. Keggins R.V„et ai, Proc, Nat.Acad, Sco., 75, 1423-1427, 1978, 11. Rabinovich P,М. et al, in; Plasmids in Bacteria. Eds: Helinsky D,R. et. а!. р. 635— 656, New York, 1985. 12. Смирнова Н,A. и др. Молекулярная биология, 22, N 5, 1257-1265, 1988, 13. Авторское свидетельство СССР N 1412290. 14, Дж. Миллер, Эксперименты в молекулярной генетике, M.: Мир, 1976. 2003689 Таблица 1 Определение фагочувствительности штаммов В. arnyiotlquefaciens 65 (рВА1418) и 65 OR28. (p ВА1418) Таблица 2 Накопление альфа-амилазы В; amyloliquefaciens, продуцируемой штаммами. В. amyloliquefaclens В-5144 и В, amylollquefaciens В-2387 во время ферментации. Формула изобретения 1. Рекомбинантная плазмидная ДНК рВА 1418, кодирующая альфа-амилазу Bacillus amyloiiquefaciens размером 6,6 т.п,н. и содержащая Bam Hl - фрагмент ДНК плаэмиды рВА 4 размером 4,4 т.n,í.; Bam Hl - Gal - фрагмент ДНК хромосомы В,arnyloliquefaclens А - 50 размером 2,2 т.п.н.; Ctal - Bam Hl - фрагмент ДНК плазмиды pBR 322 размером 0,35 т.п.н., участки расщепления следующих рестриктаз: - Bam Hl с координатами 0 т.п.н, и 2,55 т.п.н, - Оа) с координатой 0,35 т.п.н.; а также гены и генетические маркеры: - Amy - ген, кодирующий альфа-амилаэу В, amyloliquefaclens А 50; - erm С - ген, кодирующий устойчивость клеток к эритромицину. 2, Штамм бактерий ВасНЬз amyfoliquefaclens ВКПМ В-5144 - продуцент альфа-амилазы . Bacillus amyloliquefaclens. 2003689 Barn H I Sav3A $0ЯЭА Sam H1 1)МХ:Ю )3 kl) ! l 111 h :> <) L1g ase Barn H I / !)! 1!! ! () ! ) 1,!) !< (SamH) С)а1 ! ! ВаmH1 Sam H1 + C1a1 L1gaso.-. C l a1 - .,Г, - Bam H I Аmy Bam й1: - . l)hh1, . " I,li Г / ! ! )!) ),4, 1,!) Вам Н1 Sam H1 LJgase Вап) Н! Редактор С,Кулакова Тираж Подписное НПО "Поиск" Роспатента 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5 Заказ 3309 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 паж Н! С !а1!! ) Е >,.",-. I / C1af cia(.., .:: samíi / Amy (l)hh" l< l) Em / ! )!)Л! 11В 6,0 kl) Составитель Ю.Иомантас Техред М.Моргентал Корректор Л.Пилипенко