Рекомбинантная плазмидная днк рва1418, кодирующая альфа- амилазу bacillus amyloliquefaciens и штамм-бактерий bacillus amyloliquefaciens - продуцент альфа-амилазы bacillus amyloliquefaciens

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения фермента альфа-амилазы. Сущность изобретения состоит в том, что методами генетической инженерии созданы плазмида, направляющая биосинтез альфаамилазы В. amyloliquefadens. и устойчивый к действию ряда распространенных флагов бактериальный штамм - продуцент альфа-амилазы. Штаммпродуцент устойчив к эритромицину и позволяет получать до 18 г/л альфа-амилазы. 2 са ф-лы, 1 ил, 2 табл.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Комитет Российской Федерации но патентам и товарным знакам (21) 5034792/.1 3 (22) 30.03.92 (46) 30.11:93 Бюл. Йв 4344 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов (72) Йомантас Ю.В.; Попов Д.Г; Азизбекян P.Р„.

Стеркин ВЭ„Козлов l0N; Дебабов В.Г (73} Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов (54) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК

РБА1418, КОДИРУЮЩАЯ АЛЬФА-АМИЛАЗУ

ВАСИ .1i ASerLOLIquEFAaENS И mTAMM(19) RU (И) 2003689 С1 (51) 5 C12N9 28 C12N15 32

C12N15 56 C12N15 75

БАКТЕРИЙ BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS—

ПРОДУЦЕНТ АЛЬФА — АМИЛАЗЪ| BACILLUS

AMYLOLIQUEFACIENS (57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения фермента альфа-амилазы. Сущность изобретения состоит в том, что методами генетической инженерии созданы плазмида, направляющая биосинтез альфаамилазы B. amyloliquefaciens, и устойчивый к действию ряда распространенных флагов бактериальный штамм — продуцент альфа-амилазы. Штаммпродуцент устойчив к эритромицину и позволяет получать до 18 г/л альфа-амилазы 2 сп. ф-лы, 1 ил„2 табл.

2003689

Изобретение относится к биотехнологии, генетической инженерии и микробиологии и представляет собой рекомбинантную плазмидную ДНК, кодирующую биосинтез альфа-амилазы

В.amytotiquefaclens, а также фагоустойчивый шгамм бактерий В.amyloliquefaclens— продуцент альфа-амилазы.

Альфа-амилаза — это фермент, расщепляющий амилозную компоненту крахмала.

Ее используют в пищевой и легкой промышленности, а также в сельском хозяйстве и медицине.

В настоящее время известны бациллярные штаммы — продуценты альфа-амилазы, созданные методами традиционной селекции, а также методами генной инженерии (1,2,3) .

Известен штамм В,svbtttts, содержащий рекомбинантную плаэмиду с геном альфа-амилаэы В.amytoliquefaciens А50 (4).

Однако использование этого штамма в промышленности затруднено вследствие низкого уровня биосинтеза фермента, плохого роста штамма на промышленных средах и нестабильности рекомбинантной плазмиды при выращивании штамма на среде без антибиотика.

В качестве прототипа выбран штамм

В.sub(itis 65 ВКПМ В-2387 (5), который используется в настоящее время для промышленных целей. Основным недостатком этого штамма является его низкая продуктивностью. Поэтому задача повышения уровня. продукции альфа-амилазы черезвычайно важна. Кроме того, существенным недостатком штамма В.э иЬМИэ 65 является его чувствительность к фагам, что приводит к потерям в производстве вследствие фаголизиса. Поэтому создание фагоустойчивого штамма-продуцента представляет собой важную задачу.

Получены рекомбинантная плазмидная

ДН К рВА1418, кодирующая биосинтез альфаамилазы и фагоустойчивый штамм Bactllus

a myloliquefaciens 65 OR28 (рВА1 418} —. и родуцент альфа-амилазы В.amylotiguefaciens.

Сконструированная рекомбинантная плазмида рВА1418 имеет размер 6,6 т.п.н, и содержит Вав Hl-фрагмет ДНК векторной плазмиды рВА4, размером 4,4 т.п.н., Bam

Hl — Clat — фрагмент ДНК хромосомы

В.amyloliguefaciens размером 2,2 т.п.н„содержащий ген альфа-амилазы

В,amytoliguefactens А50; Clat-BamHI — фрагмент ДНК плазмиды pBR322 размером 035 т.п.н,; а также участки расщепления следующих рестриктаз:

Bam Hl с координатами 0 т.п,н. и 2,55 т.п.н., 55 аэрации — интенсивную мутность.

Физиолого-биохимические признаки.

Клетки растут при температуре от 20 до

45 С при оптимуме рН от 6,8 до 7,5, В качестве источника углерода используют многие углеводы, спирты, органиче5

CtaI с координатой 0,35 т,п.н.; а также гены и генетические маркеры;

amy — ген., кодирующий альфа-амилазу

В.amytoliquefaciens А50, erm С вЂ” ген, кодирующий устойчивость клеток к эритромицину.

Новый штамм Bacillus amyloliquefaciens

65 OR28 (рВА1418) — фагоустойчивый продуцент альфа-амилаэы, секретирующий 780 единиц активности фермента на 1 мл культуральной жидкости (активность фермента определяют .по методике Госстандарта (6), задепонирован, Его регистрационный номер ВКПМ В-5144 во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов.

Штамм продуцент Bacillus

amyloliquefaciens 65 OR28 (рВА1418) получают путем введения известным методом (7) новой рекомбинантной плазмиды рВА1418, кодирующей синтез альфа-амилазы Bacilius amyloliquefaciens А50, в протопласты бесплазмидного штамма Bacillus

arnylotiquefaciens 65 БКПМ В-2387, называемого ранее Bacillus subtitts 65 ВКПМ В2387. В процессе работы сданным штаммом было выяснено, что его следует называть

Bacxillus amyloliquefaciens 65, так как штамм способен усваивать лактозу и имеет систему рестрикции Bam, что является характерными признаками вида Bacillus

amyloliquefactens. Поэтому в дальнейшем штамм ВКПМ В-2387 называют Bacillus а пу)о iquefaciens, Путем отбора из штамма

В.amytoliquefaciens 65 (рВА1418) получают мутант 0R28, устойчивый к фагам Е25, Е26 и Е10, выделенным из промышленных фаголизатов.

Штамм Baciiius amyloquefaciens В-5144 характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки, Клетки прямые, палочковидные, размером 2,5 — 4,0 х 0,5 — 0,8 мкм, подвижные, грамположительные, спорообразующие. Размер спор 1,0 — 1,2 х 0,6 — 0,7 мкм.

Культуральные признаки.

Клетки хорошо растут на простых питательных средах, При росте на мясопептонном агаре, агаре Хоттингера — колонии шероховатые, круглые, матовые, желтоватосерые, край неровный, лопастной. При росте в жидких средах: мясопептонном бульоне, LB-бульоне без аэрации образуют сухую пленку безпомутнения среды, а при

2003689

10

30

55 ские кислоты, в частности D-глюкозу, Dфруктозу, лактозу. Не усваивают ацетат, гала ктозу.

В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной форме, так и в органической форме в виде пептона, аминокислот.

Желатину разжижают.

Индол не образуют, Уреазную активность не обнаруживает, Штамм проявляет устойчивость к эритромицину, обусловленную наличием плазмиды рВА1418.

Штамм устойчив к вирулентным фагам

Е10, Е25, Е26, выделенным из промышленных фэголизатов и препаратов субтилизина

ГХЗ.

Пример 1, Конструирование гибридной плазмидь1 рВА1418.

На чертеже представлена схема конструирования гибридной плазмиды рВА1418.

Для того, чтобы клонировать ген альфа-амилэзы и экспрессировать его, проводят следующие манипуляции, 10 мкг ДН К хромосомы В,amyloliquefaciens

А50, выделенной так, как описано в руководстве Маниатиса и др. (9), обрабатывают эндонуклеазой рестрикции ЯаиЗА в стандартных условиях (9) и смешивают с обработанной таким же образом эндонуклеазой

BamHI ДНК плазмиды рМХ39 (11) в соотношении 1:1 и высаживают, добавляя 2,5 обьема этанола. Образовавшийся осадок растворяют в 100 мкл буфера, содержащего

50 мМ трис-С!, рН 7,5, 10 мМ MgSOn, 50 mM

NaCI, 0,5 mM АТР, и добавляют 5 ед, ДНКлигазы фага 74. Лигирование проводят при

14 С в течение 12 ч. Полученной смесью трансформируют клетки штамма В.subtilis

21гесЕ4 amy4, описанного ранее (12). Полученной смесью трансформируют клетки штамма B.subtilis 21гесЕ4 amy 4, описанного ранее (12), Трансформацию проводят следующим образом: ночную культуру клеток В.subtilis 21 recE4amy4, выращенных в жидкой среде Спицайзена 1 (0,8% глюкозы, 0,04% казаминовых кислот, 0,1% дрожжевого экстракта, 5 мкгlмл L-триптофаза, i,83% К2НР04 0,2% (NH<}2S0< 0,12%

NasCsHs0z х 5,5Т Н20, 0,01% MgSO

4,5 ч с аэрацией при 37 С. Затем клетки разводят средой Спицайзена 11, отличающейся от среды спицайзена 1 тем, что она не содержит дрожжевого экстракта, триптофана, а содержание казэминовых кислот и

М9504 составляет 0,02% и 0,07% соответственно, Клетки в такой среде растят 1,5 ч с аэрацией, после чего используют для трансформации, Препарат ДНК инкубируют с полученными клетками при 37 С 2 ч и высевают на агаризованную среду LB с эритромицином (10 мкг/мл) и амилопектиназуром (0,15%), Отбирают клоны, устойчивые к эритромицину и гидролизующие амилопектиназур. Из отобранных таким образом клонов выделяют плазмидную ДНК и называют ее рАА2. Плазмида рАА2 содержит ген альфа-амилазы B,amyloliquefaciens, ответственный за синтез секретируемой альфа-амилэзы, Анализ генетических ипокеров в плазмиде проводят следующим образом.

1, Устойчивость клеток В. subtilis 21 гесЕ4 amy/4, содержащих плазмиду рАА2, анализируют на среде с содержанием эритромицина от 5 мкг/мл до 10 мкг/мл. Данные клетки растут на средах с такой концентрацией эритромицина, 2, Наличие секретируемой альфа-амилазы в клетках B,subtilis 21 гесЕ4 amy/4, содержащих плазмиду рАА2, устанавливают следующим образом: клетки из отдельных клонов наносят а чашку Петри с LB-агаром, содержащим 0,15% амилопектиназур, в виде точек или полос и инкубируют при 37 С

18 — 24 ч. Вокруг выросшей массы клеток образуется прозрачная зона гидрозованного амилопектиназура, Клетки исходного штамма, не содержащие плазмиды, зон гидролиза аминопектиназура не образуют.

Активность эльфа-амилазы в культуральной жидкости определяют по методике

Госстандарта СССР (6) во время ферментации по гидролизу 1%-ного растворимого крахмала в 10 мМ Na-К-фосфатном буфере, рН 6,0, 0,3 мМ CaClz и 33 мм NaCI, Реакционная смесь содержит 10 мл 1%ного растворимого. крахмала, растворенного в 15 мМ Na-К-фосфэтном буфере, рН 6,0, и 5 мл исследуемого образца (разведенного в 2 мМ ацетатном буфере, рН 6,0, 03, мМ

CaCb, 100 мМ NaCl), Контроль вместо исследуемого образца содержит 5 мл буфера для разведения фермента. Пробы инкубируют при 30 С 10 мин. Реакцию ocTaHaaflvlaaloT добавлением к 1 мл реакционной смеси 10 мл 0,1 М раствора XCl. Из полученной смеси отбирают 1 мл и переносят в 10 мл раствора йода, содержащего 0,0025% J и 0,025% KJ, Реакционную смесь выдерживают при

20 С.20 мин и измеряют оптическую плотность раствора при длине волны 656 нм, Контрольный раствор имеет синюю окраску, а опытные образцы приобретают фиолетовый цвет, Контрольный раствором при калориметрировании является дистиллированная вода, Количество прогидролизованного крахмала определяют по формуле

2003689

10

5,885 ХС вЂ” 0,00167

Хп, 55 где 01 — оптическая плотность контрольного раствора;

D2 — оптическая плотность опытного раствора;

0,1 — количество субстрата, взятое в пробу, г.

Если количество прогидролизованного крахмала меньше 00,2 г или больше 0,06 t, то испытания повторяют, подбирая разведения фермента.

Ам и нолитичес кую акти вн ость (АС) в ед/мл определяют по формуле где С вЂ” количество прогидролизованного крахмала, г.

n — величина разведения.

За единицу активности амилолитических ферментов (АС) принято такое их количество, которое в стандартных условиях расщепляет 1 г растворимого крахмала до декстриноов различной молекулярной массы.

Затем ДНК плаэмид рАА2 и pBR322 (9) обрабатывают рестриктазами Hami- и Clal, ДНК плазмиды pUB110 (10) — ферментом

BamHl, все смешивают и обрабатывают лигазой, как описано выше, и трансформируют компетентные клетки штамма В,subtilis

21 amy4 гесЕ4 по методу, описанному выше.

Трансформанты отбирают на агаризованной среде, содержащей 5 мг/мл канамицина и 0,15 амилопектиназура, Отбирают клоны, устойчивые к канамицину и продуцирующие альфа-амилазу. Из отобранных кло- нов выделяют плазмидную ДНК и называют ее рАА1 (чертеж).

ДН К плазмид рАА12 и рВА4 (8) обрабатывают рестриктаэой BamHi, затем лигазой (как описано выше) и трансформируют компетентные клетки штамма В.subtilis 21

amy4 гесЕ4 по методу, описанному выше, Трансформанты отбирают на агариэованной среде, содержащей 10 мкг/л эритромицина и 0,15 амилопектиназура, Отбирают клоны, устойчивые к эритромицину, и гидролизующие амилопектинаур, Из отобранных таким образом клонов выделяют плазмидную ДНК и называют ее рВА1418. Плазмида рВА1418 содержит ген альфа-амилазы В,amylollquefaciens, ответственный за синтез секретируемой альфаамилазы и клонированный на векторе рВА4, который обеспечивает стабильное наследование в отсутствие селективного давления.

П р и ме р 2. Конструирование штамма

Bacillus amyloliquefaciens 65 (рВА1418).

Для трансформации В. amylollquefaciens

65 плазмидой рВА1418 используют метод, описанный в (7). Трансформацию протопластов клеток В.amyloliquefaclens 65 проводят следующим образом. 1 мл с суспензии ночной культуры В,amyloliquefaciens 65 вносят а 9 мл питательного бульона PC и выращивают до титра 10 кл/мл, Клетки собирают центрифугированием (5000 об/мин, 10 мин„200С)., дважды промывают специальной средой

SMMP (7), а затем ресуспендируют в среде

SMMP, содержащей 100 мгlмл лизоцима, и инкубируют 30 мин при 42 С. Образовавшиеся протопласты промывают средой SMMP добавлением 0,1%-ного бычьего cl вороточного альбумина и испольэу;от для трансформации. Плазмидную ДНК рВА1418 (2-10 мкг) инкубируют 2 мин при ОоС с протопластами клеток В.amyloliquefaciekns 65 и 22o -ным полиэтиленгликолем 6000, приготовленным на буфере SMMP. После десятикратного разведения средой SM M P с 0,1 -ным альбумином трансформированные протопласты выса>кивают центрифугированием {2000 об/мин, 10 мин, 20"С), суспендируют в 1 мл той же среды, инкубируют 2 ч при 30 С и высевают на агаризованную среду ОМЗ с эритромицином (5 мкг/мл). Отбор трансформантов производят 48 ч роста при 37 С.

Отбирают клоны, устойчивые к эритромицину (10 мкг/мл), Пример 3, Получение фагоустойчивого мутанта штамма В.amyloliquefaciens 65

ОR28 (pВА1418), Для получения фагоустойчивого мутанта штамма В.amyloliouefaciens 65 (рБА1418) клетки этого штамма в вегетативной фазе роста смешивают с фагами, выделенными из промышленных фаголизатов {множественность инфекции 10), способ выделения фагов описан в (13). Смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 3 ч, высевают на поверхность твердой питательной среды, содержащей 10 мкгlмл эритромицина, и инкубируют 18 ч при 30 С. Выросшие клоны, устойчивые к фагам, после очистки переводят в споры, суспензию спор прогревают при 85 С 20 мин и высевают на поверхность твердой питательной среды для получения отдельных колоний, Отобранные клоны испытывают на чувствительность к фагам Е10, Е25 и Е26, выделенным из промышленных фаголизатов. Чувствительность к фагам оценивают качественно, используя капельный метод, заключающийся в том, что на поверхность твердой питательной среды высевают верхний слой полужидкого

0,70 агара, содержащего клетки испытуе

2003689

5

20 мого штамма в титре 10, и наносят фаголиа эат (14), По наличию зоны лизиса судят о фагочувствительности. Используют также количественный метод двухслойного титрования. Для этого на поверхность твердой питательной среды наносят 0,7 -ный агар, содержащий клетки испытуемого штамма в титре 10 и соответствующие разведения а фагов (14) . Клоны, устойчивые к фагам. оценивают по уровню продукции секретируемой альфа-амилазы, B результате экспериментов был отобран штамм OR28, который продуцировал альфа-амилаэу на уровне исходного штамма и был устойчив к фагам, выделенным из фаголизатов, Результаты этих экспериментов представлены в табл, 1.

Пример 4. Получение альфа-амилазы с помощью рекомбинантного штамма

Bacillus amyloliquefaciens 65 OR28 (рВА1418) ВКПМ В-5144).

Накопление альфа-амилазы

В.amyloliquefaciens в культуральной жидкости штаммов В.amyloliquefaciens 65 OR28 (рВА1418) (ВКПМ В-5144) — заявляемый штамм и в культуральной жидкости

В.amyloliquefaciens 65 ВКПМ В-2387(прототип) изучают при культивировании их в промышленных ферментационных средах следующего состава, г/л: картофельный крахмал, осахаренный альфа-амилазой, 100, кукурузный экстракт 24, белково-витаминный концентрат или пивные дрожжи 3, лактоза 2,8; (NH

7Н О 0,14, CuSO< 0,0038, NaCI 0,3, рН 7,2, Штамм В.amyloliquefaciens OR28, содержащий стабильно наследуемую плазмиду рВА1418, выращивают на среде без антибиотика, как и штамм-прототип, не содержащий плазмиду.

Процесс ферментации проводят в качалочных колбах объемом 750 мл, содержащих по 100, мл ферментационной среды, Колбы инкубируют при 37 С на качалке с интенсивной аэрацией (240 об/мин), Активность фермента в ходе ферментации определяют по методу, описанному в примере 1, Данные по накоплению альфа-амилазы

В.arnyloliaquefaciens в культуральной >кидкостью А.amyloliquefaciens 65 OR28

50 (р ВА1418) (В КП M В-.5144) и

В.amyloiiquefaciens 65 во время ферментации суммированы в табл. 2, Из анализа данных, представленных в табл. 2, ясно, что предлагаемый в данной заявке рекомбинантный фагоустойчивый штамм — продуцент альфа-амилазы—

B,amyloliquefaclens 65 OR28 (рВА1418) (ВКПМ В-5144) позволяет получать в 2 раз больше секретируемой альфа-амилазы, чем штамм-прототип (до 80 ед/мл) без селективного давления. Удельная активность альфаамилазы В.amyloliquefaciens составляет 50 ед. ГОСТ/мг, Таким образом, штамм

B,amyloliquefaciens В-51454 продуцирует до 18 г/л альфа-амилазы, В.amyloliquefaciens В-5144 продуцирует до

18 г/z, альфа-амилазы.

Штамм продуцент хорошо растет на стандартных промышленных средах. (56) 1. Патент США ¹ 3808102, кл, 195—

65.

2. Авторское свидетельство СССР

N538024,,кл. С 12 N 13/10.

3, Патент ФРГШ N 2218733, кл. С 12 М

13/10.

4. Сорокин А.В. и др. Молек. ген., микрбиол. вирусолог., 6. 27-29, 1986, (56) 5. Авторское свидетельство СССР

N 1089118, кл, С 12 N 9/28, 1986.

6. Методы определения амилолитической активности ГОСТ 20264. 4-74, 7. Vehmaanpera J. FEMS Microbiol.Lett., 49, 101, 1988.

8. Авторское свидетельство СССР

N 1615180.

9, Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж.

Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. M,: Мир, 1984.

10. Keggins R.V„et ai, Proc, Nat.Acad, Sco., 75, 1423-1427, 1978, 11. Rabinovich P,М. et al, in; Plasmids in

Bacteria. Eds: Helinsky D,R. et. а!. р. 635—

656, New York, 1985.

12. Смирнова Н,A. и др. Молекулярная биология, 22, N 5, 1257-1265, 1988, 13. Авторское свидетельство СССР

N 1412290.

14, Дж. Миллер, Эксперименты в молекулярной генетике, M.: Мир, 1976.

2003689

Таблица 1

Определение фагочувствительности штаммов В. arnyiotlquefaciens 65 (рВА1418) и 65 OR28. (p ВА1418) Таблица 2

Накопление альфа-амилазы В; amyloliquefaciens, продуцируемой штаммами.

В. amyloliquefaclens В-5144 и В, amylollquefaciens В-2387 во время ферментации.

Формула изобретения

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК рВА 1418, кодирующая альфа-амилазу

Bacillus amyloiiquefaciens размером 6,6 т.п,н. и содержащая

Bam Hl - фрагмент ДНК плаэмиды рВА

4 размером 4,4 т.n,í.;

Bam Hl - Gal - фрагмент ДНК хромосомы В,arnyloliquefaclens А - 50 размером 2,2 т.п.н.;

Ctal - Bam Hl - фрагмент ДНК плазмиды

pBR 322 размером 0,35 т.п.н., участки расщепления следующих рестриктаз:

- Bam Hl с координатами 0 т.п.н, и 2,55 т.п.н, - Оа) с координатой 0,35 т.п.н.; а также гены и генетические маркеры:

- Amy - ген, кодирующий альфа-амилаэу

В, amyloliquefaclens А 50;

- erm С - ген, кодирующий устойчивость клеток к эритромицину.

2, Штамм бактерий ВасНЬз

amyfoliquefaclens ВКПМ В-5144 - продуцент альфа-амилазы . Bacillus

amyloliquefaclens.

2003689

Barn H I

Sav3A

$0ЯЭА

Sam H1

1)МХ:Ю )3 kl) ! l 111 h :> <) L1g ase

Barn H I

/ !)! 1!! ! () ! ) 1,!) !< (SamH)

С)а1 ! !

ВаmH1

Sam H1

+ C1a1

L1gaso.-.

C l a1 - .,Г, - Bam H I

Аmy

Bam й1: - . l)hh1, .

" I,li

Г

/ ! !

)!)

),4, 1,!) Вам Н1

Sam H1

LJgase

Вап) Н!

Редактор С,Кулакова

Тираж Подписное

НПО "Поиск" Роспатента

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Заказ 3309

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 паж Н! С !а1!!

) Е >,.",-.

I /

C1af

cia(.., .:: samíi

/ Amy (l)hh"

l< l)

Em

/ !

)!)Л! 11В

6,0 kl) Составитель Ю.Иомантас

Техред М.Моргентал Корректор Л.Пилипенко

Рекомбинантная плазмидная днк рва1418, кодирующая альфа- амилазу bacillus amyloliquefaciens и штамм-бактерий bacillus amyloliquefaciens - продуцент альфа-амилазы bacillus amyloliquefaciens Рекомбинантная плазмидная днк рва1418, кодирующая альфа- амилазу bacillus amyloliquefaciens и штамм-бактерий bacillus amyloliquefaciens - продуцент альфа-амилазы bacillus amyloliquefaciens Рекомбинантная плазмидная днк рва1418, кодирующая альфа- амилазу bacillus amyloliquefaciens и штамм-бактерий bacillus amyloliquefaciens - продуцент альфа-амилазы bacillus amyloliquefaciens Рекомбинантная плазмидная днк рва1418, кодирующая альфа- амилазу bacillus amyloliquefaciens и штамм-бактерий bacillus amyloliquefaciens - продуцент альфа-амилазы bacillus amyloliquefaciens Рекомбинантная плазмидная днк рва1418, кодирующая альфа- амилазу bacillus amyloliquefaciens и штамм-бактерий bacillus amyloliquefaciens - продуцент альфа-амилазы bacillus amyloliquefaciens Рекомбинантная плазмидная днк рва1418, кодирующая альфа- амилазу bacillus amyloliquefaciens и штамм-бактерий bacillus amyloliquefaciens - продуцент альфа-амилазы bacillus amyloliquefaciens Рекомбинантная плазмидная днк рва1418, кодирующая альфа- амилазу bacillus amyloliquefaciens и штамм-бактерий bacillus amyloliquefaciens - продуцент альфа-амилазы bacillus amyloliquefaciens 

 

Похожие патенты:

Изобретение относится к биотехнологии , а именно к получению штаммов-продуцентов ферментов

Изобретение относится к микробиологической и спиртовой промышленности, аименно к способам получения сухого бактериального ферментного препарата, содержащего а -амилазу

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению ферментов

Изобретение относится к биотехнологии и микробиологической промышленности и может быть использовано для создания промышленных продуцентов

Изобретение относится к области сельскохозяйственной биотехнологии, а именно к защите растений, и представляет собой энтомопатогенный штамм Bacillus thuringiensis subsp

Изобретение относится к способам и композициям для борьбы с вредителями растений и другими вредителями

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к фрагментам гибридных токсинов, полученных из кристаллических белков Bacillus thuringiensis, обладающих инсектицидной активностью
Наверх