@ -аминофлуоресцеинтиокарбамил-n-(4-аминобутил)-2-амино-1- (l)-фенилпропанол в качестве реагента для поляризационного флуороиммуноанализа l-эфедрина
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
Комитет Российской Федерации по патентам и товарным знакам (21) 5019159/04 (22) 27.12.91 (46).15,1293 6юл Йв 45-46 (7S) Смирнов АВ; Еремин СА; егоpos AM„ Изотов
Б.Н. (73) Смирнов Алексей Витальевич (54) ВЕТА - АМИНОФЛУОРЕСЦЕИНТИОКАРБАМИЛ -М- (4-АМИНОБУТИЛ)-2-АМИНО -1(Ц-ФЕНИЛПРОПАНОЛ В КАЧЕСТВЕ РЕАГЕНТА
ДЛЯ ПОЛЯРИЗАЦИОННОГО ФЛУОРОИММУНОАНАЛИЗА L-ЭФЕДРИНА (57) Испотьзование: в аналитической химии, в частности в качестве реагента дпя поляризационного
Сущность изобретении продукт — бета — аминофпуоресцепиокарб амид- N- (4-амин обутил) (В) RRU U(1Ц 2004543 Cl (51) 5 С07Р 311 86 G01NZl 64
-2-амино-1- (L)-фенилпропанол Реа гент 1:
N-(4-аминобутил) -(Ц-2-амино-1 -фениппропанол Реагент 2: Фпуоресцеинизотиоционат. Условия процесса: в среде метанола в присутствии триэтаноламина при перемешивании в течение 15 ч и температуре 4 С последующим хроматографическим выделением в тонком слое на пластинках
Силуфоп" в системе хлороформ-метанол-уксусная кислота, взятых в соотношении 80: 20: 1. Собирают фракцию оранжевого цвета с R = 0,22 Целевой продукт элюируют метанолом с выходом 15%. Целевой продукт позволяет увеличить специфичность определения L-эфедрина в 26 раз при чувствительности анализа 92 10 м.
-в
2004543 сн-сн-нн-сн -сн -сн-сН -мн-с -нн
Q1 !1 он сн, ноо ви,ц
4 с н з оь но о
Данное производное,2-амина-1-фенилпропанола является специфичным реагентом для поляриэационного флуороиммуноанализа (ПФИА) L-эфедрина в биологических жидкостях. в частности, в моче.
Свойства указанного соединения в лит :>атуре не описаны.
Известные рвагенты (меченные антиге: ь ) для иммунохимического анализа пред: тэвляют собой ковалентно связанные аптеновые органические соединения с молекулой вещества, выполняющего роль детектора иммунохимической реакции, причем в качестве метки (детектора) используют радиоактивные изотопы, флуоресцентные молекулы. ферменты, Недостаток этих реагентов состоит в том, что они не являются высокоспецифичными реагентами для иммунохимического анализа эфедрина.
Наиболее близкий по структуре меченный антиген получают путем взаимодействия N-(4-аминобутил)-2-амино-1-()-фенилпропана с флуоресцеиниэотиоционатом в среде триэтиламина при комнатной температуре, Реагент специфичен для анализа метамфетамина, максимальная чувствительность 3,35х10 M. а процент перекрестной реакции с (L)-эфедрином составляет лишь
12 /0 при чувствительности 2,4х10 M.
Целью изобретения является синтез ковалентно связанного производного 2-амино-1-(L)-фенилпропанола с флуоресцентной меткой, которое может быть использовано для иммуноанализа (=эфедрина с более высокой чувствительностью и специфичностью. указанная цель достигается в результате взаимодействия флуоресцеинизотиоционата с М-(4-аминобутил}(Ц-2-амино-1-фенилпропанолом.
Получение флуоресцеин-меченного производного 2-эмино-1-(Ц-фенилпропанола осуществляется следующим образом. К раствору N-(4-аминобутил)-(L)-2-амино-1фенилпропанола в метаноле добавляют триэтилэмин и флуоресцеиниэотиоционат при еремешивании. Реакцию ведут 15 ч при
44 С. Р-аминофлуоресцеинтиакарбамил-N(4-аминобутил)-(L)-2-амино-1-фенилп ропаИзобретение отногится к новым химическим соединениям. конкретно к производным
2-амино-1-фенилпропэнола формулы нол выделяют хроматограо,ией в 1онхом слое на пл ктинкэх Силуфол".
Пример 1. Получение P-аминофлуоресцеинтиокарбамил-N-(4-аминобутил)-(L)2-амино-1-фенилпропанола.
K раствору 7,0 мг (33 мкмоль) N-(4-аминобутил)-(L)-2-амина-1-фенилпропанолу в
100 мкл метанола добавляют 1 мл метанола и 100 мкл триэтиламина. Затем добавляют
6,0 мг (16 мкмоль) флуоресцеинизотиоционата. Реакционную смесь перемешивают в течение 15 ч при +4 С, Ре"-кционную смесь упэривают на роторе с металлом для удаления триэтиламина. Полученный продукт вы"5 деляют хроматографией в тонком слое на пластинках "Силуфол" в системе хлороформ-метанол-уксусная кислота 80:20:1. Собирают оранжевую полосу с Ri 0,22, из которой полученное вещество элюируют 2
20 мл метанола, Выход Р-аминофлуоресцеинтиокарбамил-N-(4-аминобутил)-(1 )-2-амино1-фенилпропанола составляет 15%.
Для подтверждения индивидуальности соединения приводим полные данные ИК- и
УФ-спектров.
Регистрацию ИК-спектра проводили на
ИК-фурье спектрофотометре "IFS-45", соединенном с YiK-микроскопом. Спектральный диапазон регистрации 4000-620 см разрешение — 8 см . Метанольный раствор исследуемого вещества наносили по каплям на окно из l 1612 (N-Н и СН полосы "Амид-2), 1454, 1400, 1254, 1180, 1111, 1042 (аром, С-Н), Регистрацию УФ-спектра снимали на спектрофотометре "Specord-M-40". Метанольный раствор исследуемого вещества, 40 наливали в кювету размером 10х45 мм, Данные УФ-спектра представлены в виде максимумов длин волн (нм): 293, 475, 491 (Е=8,78). Пример 2. Определение 1 -эфедрина 45 с помощью реагентов на основе,8-аминофлуоресцеинтиокарбамил-N-(4-аминобутил) -2-амино- 1-(()-фенилпропанола, В пластмассовые контейнеры, помещенные в измерительную карусель с кюве50 тами, вносят по 50 мкл шесть калибраторов . L-эфедрина, пригоговленных на моче с добавлением 0,1 йайз, содержащие различные концентрации (мкгlмл): 0, 0,25, 1,0, 4,0, 10,0, 50,0. Разбавленную в 20 раз овечью антисыворо ку против эфедрина, раствор трассера -аминофлуоресцеигпиокарбамилN-(4-аминобутил)-2-амино-1-{1 )-фенилпропанол в концентрации 100 нмоль/л и фосфатный буфер для анализа, содержащий 1 г/л 2004543 бычьего гамма-глобулина и 1 г/л Иайз (рН 7,4), наливают в три отдельных флакона, установленных в одной специальной коробке. Коробку с реагентами и карусель устанавливают в поляризационный флуориметр (ТДханализатор фирмы "ABBOTT" ), который автоматически выполняет анализ по заданной программе. По завершению анализа калибраторов L-эфедрина прибор принимает и сохраняет в памяти калибровочный график концентрация L-эфедрина (мкг/мл)— поляризация флуоресценции(МР). Затем в пластмассовые контейнеры, помещенные в измерительную карусель с кюветами, вносят по 50 мкл анализируемых образцов мочи и прибор автоматически выполняет анализ, по завершению которого выдается количественная оценка содержания L-эфедрина в каждом образце (в мкг/мл). Пример 3. Определение чувствительности анализа L-эфедрина в моче с помощью ,В-аминофлуоресцеинтиокарбамил-N-(4аминобутил)-2-амина-1-(Ц-фенилпропанола. Определение чувствительности анализа 1 -эфедрина в моче производят по методу Родбарда. Для этого, используя обычную процедуру анализа, проводят 20 измерений поляризации флуоресценции (П.Ф.) нулевого стандарта. Среднее значение П.О, у=181,44, S.O.=-0,91. По уравнению Родбарда определяют у min: у mh1=y-тз(1/n 1/и}, где t — коэф Стьюдента при 95% доверительной вероятности; s — стандартное отклонение; п — число повторов стандартов и образцов в анализе. у min=181,44-1,725x0,91(1/2+1/2)=181,441,725х0 91х1= 181,44-1,569=179,87 (MP), Из графика, построенного по точкам: 0 мкгlмл — 18 1,44 MP 0,25 мкг/мл — 157,18 MP находим, что 179,87 MP соответствует 0,016 мкгlмл L-эфедрина. Чувствительность определения -эфедрина в моче составляет 16 нг!мл или 9,2х10 M (молекулярная масса эфедрина — 174.2). Пример 4. Специфичность/ -аминофлуоресцеинтиокарбамил-L-(4- аминобутил)2-амина-1-(Ц-фенилпропанола при анализе L-эфедрина в моче. 5 Химические соединения, близкие к структурной формуле L-эфедрина (группа фенилалкиламинов), а также лекарственные вещества иэ различных химических фармакологически активных групп с концен10 трациями 50 и 100 мкг/мл в буфере "искусственная моча" анализируют с помощью трассера Р -аминофлуоресцеинтиокарбамил-N-(4-аминобутил)-2-амина-1-(L)фенилпропанол в концентрации 100 нмоль/л 15 и разбавленной в 20 раз антисыворотки против эфедрина аналогично анализу L-эфедрина. Данные представлены в таблице. Таким образом, предлагаемый реагент Р -аминофлуоресцеинтиокарбамил-N-(420 аминобутил)-2-амино-1-(L)-фенилпропанол для поляриэационного флуороиммуноанализа L-эфедрина в моче по Сравнению с из-. вестным реагентом позволяет увеличить специфичность определения в 26 раз, чувст25 вительность определения L-эфедрина возрастает с 2,4x10 M до 9,2х10 М, при этом -е процент перекрестных реакций других структурно-подобных соединений не превышает 5,7. 30 (56) Findiay I.N.À. Warren I.Т. Hill I.À. Wetch R.M.//J. Pharm. Sci, 1981, т, 70. с. 624-631. Патент США N 3996345, кл. 424-12. опублик. 1976. 35 Патент США N 4868132. кл. 436-546, опублик. 1989. Мягкова М.A„лушникова M.Â., Полевая О.Ю.//Судебно-медицинская экспертиза— 1990, N. 3, с. 30-32. 40 Eremln S.À., Gatlacher G., Lotey Н., Sml:h D.S., Landon I,//Clln. Chem, 1987. т. 33, N 10, с. 1903-1906. Eremin S.À., Zattchev ЯМ., Едогоч А.М., Ermaka А.N. Smlrnov А.В., Izotov 45 В.N.//Anal. Chem. Acta, 1982, т.227. с. 287290. Rodbard et al.//Anal. BIochem, 1978, т. 90, т. 1-12. 2004543 Продолжение таблицы пе ек естной ак ии и и кон ент э ии, мкг/мл Анализируемое вещество П р и м е 4 а н и е. р Aìèíîôëóîðåñöåèíòèîêýðáàìèë-Й(4-аминобутил)2-амино-1-(Ц-фенилпропанол в качестве реагента для поляризационного флуороиммуноанвлиза L-эфедрина. i Н-Ю -си -сн сз -юФ.С-@й Формула изобретения -. oac3l 3 p - Аминофлуоресцеинтиокарбвмил- й-, (4-аминобутил)-2-амино-1-(Ц- фенилйропа-, нол формулы Ю а в качестве реэгентв для поляризационного 5 флуороиммуноанализа -эфедрина. Составитель И.Дьяченко Редактор А,Самерханова ТехредМ.Моргентал Корректор С,Висина Тираж Подписное НПО "Поиск" Роспатента 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб„4/5 Заказ 3377 Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул. Гагарина, 101 l.. б-, 1-Амфетамин 1-Фенолпропанолэмин d-, 1-Фенолпропанолэмин d-Фенолпропаноламин Фенфлюрамин Лэбеталол Фентермин 1-Псевдозфедрин d-Псевдозфедрин . 1-Нор псе вдозфедрин d-, 1-Эфедрин Тиранин Мезатон . Дизтилпропион Адреналин Нафтизин Галазов ин Изадрин Астмопент Морфин Промедол Хлордиэзепоксид Фенобарбитал барбамил Аминазин Амитриптилин Димедрол Пэпаве ин 0,6 5,7 3,9 0.1 3,6 2,0 1,4 1,0 1,0 0,4 0,2 <0,1 <0,1 1,0 <0,1 0,2 0,3 <0,1 0,1 <0,1 0,1 <0.1 <0,1 0,3 1,5 0,3 0,4 0.1 0,7 5,1 3,4 <0,1 3,5 1,9 0,8, 1,1 1,2 0,3 0,2 <0,1 <0,1 1,0 <0,1 0,2 0,2 <0,1 <0,1 <0,1 <0,1 <0,1 <0,1 0,2 1,0 0,3 0,2