Питательная среда для культивирования человек/человеческой гибридомы (ее варианты)

 

Использование: биотехнология, иммунология, медицина. Сущность изобретения: разработана бессывороточная питательная среда для культивирования человек/человеческий гибридомы, позволяющая увеличить продукцию моноклональных антител. Новая бессывороточная среда содержит основную питательную среду RDF, инсулин, трансферрин, этаноламин, β -меркаптоэтанол, селенит натрия, человеческий альбумин или L-аргинин и дополнительно ретиноевую кислоту в концентрации 10^-12 - 10^-6 М. 2 с.п. ф-лы, 2 табл., 3 ил.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для культивирования человек/человеческой гибридомы.

Для культивирования животных клеток обычно используют питательные среды, содержащие 5-10% сыворотки. Однако сыворотка содержит гетерогенные факторы, например высокоплотные и низкоплотные липолипиды, присутствие которых в питательных средах может вызвать нежелательные осложнения при изучении биохимических процессов культивируемых клеток. В таких случаях целесообразно использование бессыворотных питательных сред, в состав которых включаются факторы роста и другие добавки.

Примером такой бессывороточной среды, используемой при культивировании человеческой гибридомы, может служить питательная среда, не содержащая сыворотку, но включающая значительные концентрации аминокислот и особенно L-аргинина.

Недостатком данных сред является низкая продуцирующая способность культивируемых клеток.

Цель изобретения - получение бессывороточной среды для культивирования человек/человеческой гибридомы, продуцирующей человеческое моноклеточное антитело.

Указанная цель достигается включением в бессывороточную среду ретиноевой кислоты, известной как витамин А-кислота. Включение ретиноевой кислоты в концентрации 10^-12-10^-16 М заметно усиливает способность к продуцированию данного антитела человек/человеческой гибридомой (фиг. 1). Наибольшее увеличение продукции антитела происходит при концентрации 10^-10-10^-9 М и достигает максимума при 10^-8 М, при дальнейшем увеличении концентрации ретиноевой кислоты продукция антитела идет на спад.

Предлагаемые бессывороточные среды, содержащие ретиноевую кислоту готовят на основе питательной среды RDF (смесь RPМ1 1640, ДМЕ и F12 в соотношении 2: 1:1) с включением соответствующих количеств инсулина, трансферрина, селена, этаноламина, β -меркаптоэтанола, человеческого альбумина, L-аргинина и воды).

Бессывороточная культуральная среда, содержащая определенное количество ретиноевой кислоты, преимущественно использована для культивирования человек/человеческой гибридомы, продуцирующей человеческое моноклональное антитело. Культивирование проводят при температуре около 37 ± 3^оС в присутствии ≈ 5% СО₂.

Следующие примеры иллюстрируют приготовление бессывороточной среды, описанной в настоящем изобретении, и культивирование продуцирующей человеческое антитело человек/человеческой гибридомы в данной среде.

На фиг. 1 показано отношение между количеством ретиноевой кислоты и количеством антитела, соответствующее примерам 1-5; на фиг. 2 - результаты субкультивирования в примере 6; на фиг. 3 - результаты, полученные в примерах 7-9.

П р и м е р ы 1-5. Ретиноевую кислоту используют в виде 0,4 N водного раствора гидроксида натрия.

Бессывороточная среда N 1: RDF - основная среда 13,433 кг на мл среды Трансферрин 10 мкг на мл среды Инсулин 10 мкг на мл среды Селенит натрия 1 нМ Этаноламин 1 мкМ β-меркапто- этанол 1 мкМ Альбумин человека 100 мкг на мл среды Вода До 1 мл Бессывороточную среду готовят путем добавки ретиноевой кислоты в указанную бессывороточную наполненную среду в каждой концентрации, из приведенных в табл. 1.

Человек/человеческую гибридому SLNF10 дважды промывают бессывороточной наполненной средой путем центрифугирования при небольшой скорости и затем инокулируют в каждую из бессывороточных наполненных (контрольных) сред (примеры 1-5) со скоростью 10⁵ кл./мл и культивируют в инкубаторе при 37^оС в присутствии 5% СО₂. Шесть дней спустя после начала культивирования число клеток измеряют гемоцитометром, а количество антител измеряют следующим способом.

Антитело к человеческому иммуноглобулину (100 μл) добавляют по капле в микролитровую чашку и адсорбируют в чашке при 37^оС в течение 30 миг. Содержимое 3 раза промывают 10 мМ РВS, содержащим 0,3% буферного раствора, а затем по капле добавляют 1%-й раствор (200 μл) бычьей сыворотки альбумина и адсорбируют в чашке при 37^оС в течение 1 ч. Каждый раз промывают буферным раствором для удаления неадсорбированного вещества. Затем добавляют по капле пробный образец (культура-супернатант) (50 мл) и вызывают реакцию при 37^оС в течение 1 ч. Чашку с содержимым промывают 3 раза буферным раствором. Пероксидазосопряженное козлиное антитело к человеку Ig (50 μл) добавляют по капле, а затем вызывают реакцию при 37^оС в течение 30 мин для того, чтобы связать его с человеческим Ig в пробном образце (иммуносорбент с иммобилизированными ферментами).

Чашку промывают 3 раза буферным раствором и туда добавляют раствор вещества, содержащего перекись водорода и о-фенилендиамин, затем вызывают реакцию в темной комнате в течение 10 мин. Реакцию останавливают добавлением 5N H₂SO₄ (50 μл). Количество получающегося в результате желтого вещества, имеющего абсорбцию 492 нм, пропорциональное количеству человеческого Ig в пробном образце, измеряют при помощи абсорбционного фотометра. Концентрация человеческого Ig в пробном образце может быть определена путем сравнения оптической плотности этой концентрации с уже известной концентрацией человеческого Ig.

Число клеток и количество антител представлены в табл. 1.

П р и м е р 6. Субкультивирование.

Бессывороточную среду 2 приготовляют в следующем составе: RDF основная среда 12,433 мг/мл среды Трансферрин 10 мкг/мл среды Инсулин 10 мкг/мл среды Селенит натрия 1 нМ β-меркапто- этанол 1 мкМ L-аргинин 1 мкг/мл среды Ретиноевая кислота 10^-7 М Человек/человеческую гибридому SLF10 инокулируют в бессывороточной среде со скоростью 10⁵ кл./мл и ее культивирование начинают при 37^оС в присутствии 5% СО₂. Через 6 дней первое поколение клеток отделяют от культуральной жидкости и инокулируют в свежей бессывороточной среде в том же составе со скоростью 10⁵ кл./мл и культивируют при тех же условиях. Через 6 дней после начала второй культивации второе поколение клеток отделяют от жидкой среды, инокулируют в свежую бессывороточную среду в том же составе со скоростью 10⁵ кл./мл и культивируют при тех же условиях культивации.

Таким образом, субкультивирование и результаты, представленные на фиг. 2, показывают, что человек/человеческая гибридома, продуцирующая человеческое моноклональное антитело IgG, может культивироваться до нескольких поколений в течение долгого периода времени без заметного уменьшения ее способности к пролиферации клеток и продуцированию антитела.

П р и м е р ы 7-9. Способом по примеру 4 готовят среду, не содержащую ретиноевую кислоту (контрольная), и среду, содержащую 10^-7 М ретиноевой кислоты (бессывороточная среда, описанная в настоящем изобретении.

Гибридому SLNF10, используемую в примере 4, и гибридому TOS/H и CoLN E10 культивируют в среде, описанной в примере 4. Через 6 дней после начала культивирования измеряют количество антител. Результаты представлены в табл. 2 и на фиг. 3. Из этих результатов видно, что бессывороточная среда, содержащая ретиноевую кислоту, может быть использована для культивирования различных человек/человеческих гибридом, способных продуцировать человеческие моноклональные антитела, при этом можно достичь заметного увеличения количества продуцируемых антител по сравнению с тем количеством, которое получается при использовании среды, не содержащей ретиноевую кислоту.

Формула изобретения

1. Питательная среда для культивирования человек/человеческой гибридомы, содержащая основную питательную среду RDF, трансферрин, инсулин, натрий-селенит, бетамеркаптоэтанол, этаноламин, человеческий альбумин, воду, отличающаяся тем, что дополнительно содержит ретиноевую кислоту при следующем соотношении компонентов: Ретиноевая кислота 10^-6 - 10^-12 моль;
Основная питательная среда RDF 13,433 мг;
Трансферрин 10 мг;
Инсулин 10 мкг;
Натрий-селенит 1 нмоль;
Бетамеркаптоэтанол 1 мкмоль;
Этаноламин 1 мкмоль;
Человеческий альбумин 100 мкг;
Вода До 1 мл
2. Питательная среда для культивирования человек/человеческой гибридомы, содержащая основную питательную среду RDF, трансферрин, инсулин, натрий-селенит, бетамаркаптоэтанол, L-аргинин, воду, отличающаяся тем, что дополнительно содержит ретиноевую кислоту при следующем соотношении компонентов:
Ретиноевая кислота 10^-6 - 10^-2 моль;
Основная питательная среда RDF 13,433 мг;
Трансферрин 10 мкг;
Инсулин 10 мкг;
Натрий-селенит 1 нмоль;
Бетамеркаптоэтанол 1 мкмоль;
L-аргинин 1 мг;
Вода До 1 мл.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5