Способ получения лигнинолитических ферментов

 

Использование: биотехнология, получение биохимических реактивов. Лигнинолитические ферменты могут быть использованы в целлюлозно-бумажной, деревообрабатывающей и химической промышленности, в сельском хозяйстве. Сущность изобретения: штамм гриба белой гнили Panus tigrinus 8/18 выращивают в погруженных условиях на синтетической среде, содержащей мальтозу, источники азота, фосфора, минеральные соли, тиамин, микроэлементы, в присутствии индуктора, твина-80 и повышенных концентрация марганца, осуществляя в процессе культивирования повышение температуры в интервале температур оптимального роста культуры. Для проведения процесса может быть использован мицелий, иммобилизованный на поликапроамидном волокне. Способ дает возможность осуществлять эффективный процесс получения лигнинолитических ферментов с широким спектром действия, в частности, Mn -зависимой пероксидазы с функциями "ключевого" фермента и оксидазы, каталитирующей окисление нефенольных подструктур лигнина. 1 з.п. ф-лы, 1 табл.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в микробиологической промышленности.

Лигнинолитические ферменты могут найти применение в технологии производства бумаги для осветления бумажной пульпы; для получения ценного сырья (например, ванилина, метанола) из промышленных отходов (например, лигносульфонатов); для предобработки отходов сельского хозяйства (солома, различные жомы и т.п.) при производстве кормов; для очистки сточных вод целлюлозно-бумажной и деревообрабатывающей промышленности; для детоксикации устойчивых ксенобиотиков; при приготовлении компостов для выращивания съедобных грибов; в научной работе - как сильные окислители, как маркеры в конъюгатах с антителами.

К лигнинолитическим ферментам относятся: лигнин-пероксидаза (диарилпропаноксигеназа, лигниназа) (LiP), Mn-зависимая пероксидаза обычного типа (Mn-зависимая пероксидаза с функциями ключевого фермента комплекса (MnP-б), лакказа (полифенолоксидаза) (L), другие оксидазы типа лакказы (Ох). В зависимости от свойств и функций в составе ферментных комплексов среди лигнинолитических ферментов выделяют "ключевые" ферменты, инициирующие деполимеризацию лигнина за счет способности расщеплять широкий спектр лигниновых связей как фенольной, так и нефенольной природы (LiP, MnPб); а также вспомогательные ферменты, способные лишь к частичной деполимеризации лигнина и расщеплению только фенольных подструктур лигнина, составляющих не более 20-40% от общего количества лигниновых связей (MnP-а, L, Ох).

Лигнинолитические ферменты продуцируются в виде ферментных комплексов, состав и свойства которых зависят от вида продуцента. Известны четыре типа таких комплексов: 1 - продуцент Phanerochaete chrysosporium, состав: LiP, MnP-а; 2 - продуцент Сoriolus versicolor, состав: LiP, MnP-а, L; 3 - продуцент Phlebia radiata, состав LiP, MnP-а, Ох; 4 - продуцент Panus tigrinus, состав: MnP-б, Ох.

Сравнительно недавно обнаруженные MnP-б и Ох обладают более широкими лигнинолитическими возможностями, чем их "классические " аналоги (соответственно, LiP и L): так, MnP-б, кроме реакций, характерных для LiP, катализирует еще и расщепление С-бета-C-4 cвязи лигнина, а Ох, в отличие от типичных лакказ, окисляет не только фенольные, но и нефенольные подструктуры лигнина,что делает эти ферменты более перспективными для практического использования по сравнению с другими указанными выше ферментами как в виде отдельных ферментов, так и в виде препаратов, содержащих оба фермента.

Описан способ получения лигнинолитических ферментов, MnP-б и Ох грибов P.tigrinus 8/18, c использованием твердофазной ферментации лигноцеллюлозных материалов. Способ заключается в том, что в ферментационный сосуд (колбу) емкостью 0,75 л вносят пшеничную солому или древесные опилки, которые смачивают водопроводной водой, стерилизуют и засевают гомогенизированным мицелием гриба-продуцента Panus tigrinus 8/18. На 4-6-е сутки культивирования - по достижении максимальной активности внеклеточных лигнинолитических ферментов - солому или опилки, ферментированные грибом, смачивают водой или ацетатным буфером, отжимают и получают грубый ферментный препарат, содержащий MnP-б и Ох. Содержание ферментов в полученном грубом ферментном препарате составляет: MnP-б - 1,5 Ед/мл, общий съем составляет 183 Ед; Ох - 0,25 Ед/мл, общий съем 30 Ед. При добавлении к соломе перед началом культивирования гриба специфического индуктора - 3-метилбензилового спирта (2 мМ) получают препарат с активностью MnP-б 2. 6 Ед/мл, общий съем составляет 312 Ед, сведения о содержании Ох не приводятся.

Основным недостатком способа является высокое содержание трудноудалимого водорастворимого лигнина в грубых ферментных препаратах, что сильно осложняет выделение лигнинолитических ферментов.

Наиболее близким к предлагаемому способу по совокупности существенных признаков является способ получения лигнинолитических ферментов, в частности MnP-б, предусматривающий погруженное периодическое культивирование гриба белой гнили Р. tigrinus 8/18 c использованием специфических индукторов. Согласно этому способу культуру-продуцент - гриб белой гнили P.tigrinus 8/18 выращивают в течение 4-5 сут при 29^oC на минеральной среде, лимитированной по азоту, содержащей 1% глюкозу в качестве источника углерода. Среда забуферена диметилсукцинатом Na, рН 4,5.

При внесении посевного материала в среду добавляют метилбензиловый спирт до 2 мМ концентрации в качестве специфического индуктора MnP-б P.tigrinus 8/18. Культивирование проводят в 250 мл конических колбах, содержащих 20 мл среды, в стационарных условиях. Начиная с 3 сут культивирование проводили с регулярной продувкой кислородом в герметически укупоренных колбах. В этих условиях, начиная с 2-3 cут культивирования проявляется и к 4-5 сут достигает максимума активность MnP-б. Максимальное содержание MnP-б в культуральной жидкости составляет 2,2 Ед/мл, общий съем 44,0 Ед. Активность оксидазы в указанных условиях отсутствует.

Основными недостатками данного способа являются невысокое содержание MnP-б в культуральной жидкости и низкий съем продукта в силу того, что объем культуральной среды вследствие особенностей метода не может превышать 8% от объема культивационного сосуда. Кроме того, в культуральной жидкости отсутствует Ох.

Способ имеет также другие недостатки: дороговизна буфера; необходимость кислородной атмосферы, что, в свою очередь, требует специальных приспособлений для стерильной продувки ферментационных сосудов кислородом и герметичной укупорки их.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является разработка эффективности способа получения лигниносодержащих ферментов MnP-б и Ох, обладающих широким лигнинолитическим действием.

Технический результат, который может быть получен при осуществлении изобретения, заключается в повышении выхода лигнинолитических ферментов за счет увеличения содержания MnP-б в культуральной жидкости, обеспечения условий для одновременного дополнительного биосинтеза оксидазы, увеличения коэффициента заполнения ферментационного сосуда, а также в упрощении процесса по сравнению с прототипом.

Сущность способа заключается в том, что гриб белой гнили P.tigrinus 8/18 выращивают в погруженных условиях на синтетической среде, содержащей источники углерода, азота, фосфора, минеральные соли, тиамин и микроэлементы, в присутствии индуктора, при этом в качестве источника углерода используют мельтозу, в среду дополнительно вносят твин-80 и марганец сернокислый в количестве 60-90 мг/л в пересчете на Mn, а в процессе культивирования осуществляют температурный сдвиг. Процесс получения продукта может осуществляться с использованием мицелия, иммобилизованного на поликапроамидном волокне.

Использование в качестве источника углерода мальтозы вместо глюкозы, сернокислого марганца в повышенных концентрациях, внесение твина-80 и осуществление температурного сдвига в процессе культивирования позволяют существенно повысить содержание в культуральной жидкости MnP-б и обеспечить одновременный биосинтез другого, необходимого для эффективного лигнинолитического действия препарата, фермента-оксидазы.

В литературе отсутствуют сведения об использовании мальтозы в способах получения лигининолитических ферментов, в том числе MnP-б и Ох.

Установлено, что существенное повыше ние активности MnP-б происходит при исходных концентрациях Mn в среде 60-90 мг/л в пересчете на Mn (табл.1). Концентрация Mn не влияет на содержание в культуральной жидкости оксидазы.

Представленные концентрации MnSO₄ соответствуют концентрациям Mn, определенным с помощью атомно-адсорбционного анализатора Perkin-Еlmer 5100 (CША) (т.е. 60, 71, 90 и 120 мг/л Mn(II) соответствуют 0,302, 0,358, 0,453 и 0,603 г/л cухой соли MnSO₄х7Н₂O; Введение в питательную среду твина-80 позволяет также осуществлять эффективную аэрацию и перемешивание, что дает возможность значительно увеличить объем используемой среды (повысить коэффициент заполнения ферментационного сосуда с 8 до 30%) и соответственно повысить общий съем продуктов.

Для повышения буферной емкости среды могут быть использованы различные органические кислоты; некоторые из них, например, барбитуровая, мета-фталевая и полиакриловая обеспечивают выход внеклеточных лигнинолитических ферментов P.tigrinus на таком же уровне как диметилсукцинат, использованный в способе-прототипе; такие, как пиромелитовая, орто-фталевая, янтарная, винная - повышают выход ферментов, примерно в 1,5 раза, по сравнению с диметилсукцинатом. Из них тартрат (винная кислота) наиболее доступен, дешев и обеспечивает наиболее стабильные результаты.

Проведение процесса культивирования продуцента в присутствии поликапроамидного волокна позволяет дополнительно увеличить съем продукта.

При необходимости ферменты (MnP-б или Ох, или их смеси, не содержащие посторонних белков) могут быть выделены из фильтрата культуральной жидкости, путем его концентрирования (ультрафильтрацией или осаждением белка органическими растворителями или высаливанием), анионообменной хроматографии и гель-фильтрации. Для получения особо чистых ферментов используют дополнительно анионообменную хроматографию с применением хроматографической системы FPLC.

Указанные ферменты могут использоваться в виде неочищенных ("грубых") ферментных препаратов: непосредственно культуральной жидкости, отфильтрованной от мицелия; в виде концентрата культуральной жидкости, полученного ультрафильтрацией или осаждением белка органическими растворителями или высаливанием.

П р и м е р 1. Выращивают инокулят из фрагмента мицелия Р.tigrinus 8/18 до 7-суточного возраста на соево-глицериновой среде известного состава и гомогенизируют его перемешиванием с фарфоровыми брусами на качалке при 180 об/мин в течение 10 мин; в 750-мл качалочные колбы вносят и стерилизуют 200 мл культуральной среды.

Среда забуферена 20 мМ Na-тартратным буфером рН 4,2; индуктор - 3-метилбензиловый спирт - вносят в 100 мкл диметилформамида на колбу.

Вносят в колбы по 2 мл инокулята. Культивируют при 24^oC и 180 об/мин первые двое суток. С 3 сут увеличивают температуру до 29^oC. Начиная с 3 сут контролируют уровень внеклеточной активности MnPб и Ох.

Активность MnP-б определяют по скорости окисления НАД-Н (модифицированный метод: в реакционную смесь, содержащую 0,05 М лактат-цитратный буфер рН 4,0, 0,1 мМ MnSO4 и 0,1 мМ НАД-Н, вносят ферментный препарат и определяют спектрофотометрически скорость уменьшения поглощения при 340 нм. За одну единицу активности принимают изменение поглощения при 340 нм, вызываемое 1 мл ферментного препарата за 1 мин (все значения активности MnP-б даны в единицах, определенных при использовании высокоочищенного НAД-Н фирмы "Serva" ФРГ; при использовании НАД-Н фирмы "Reanal" ВНР, менее стабильного в водных растворах, абсолютные значения активности MnP-б завышаются: так, в стандартных условиях Кирка максимальная активность MnPб P. tigrinus составляет 0,5 Ед с НАД-Н фирмы "Serva" или 1,44 Ед с НАД-Н фирмы "Reanal" ВНР.

Активность Ох определяют по скорости окисления сирингальдазина (модифицированный метод): в реакционную смесь, содержащую 0,02 М Na-ацетатный буфер рН 5,0 и 0,05 мМ сирингальдазин в этаноле (конечная концентрация этанола 20%), вносят ферментный препарат и определяют спектрофотометрически скорость увеличения поглощения при 525 нм. За одну единицу активности принимают изменение поглощения при 525 нм, вызываемое 1 мл ферментного препарата за 1 мин.

Максимальная активность лигнинолитических ферментов достигается к 10-12 сут культивирования и составляет: MnP-б - 11,5 Ед/мл, общий съем продукта составляет 2300 Ед; Ох - 7 Ед/мл, общий съем продукта - 1400 Ед.

П р и м е р 2. Способ осуществляют по примеру 1, но культивирование проводят в присутствии поликапроамидного волокна: перед стерилизацией среды в каждую колбу вносят по 4 г поликапроамидного волокна "Вия".

Максимальное содержание лигнинолитических ферментов достигается к 10-12 сут культивирования и составляет для MnP-б 18,4 Ед/мл, общим съем MnP-б составляет 3680 Ед.; Ох - 11 Ед/мл, общий съем Ох - 2200 Ед.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет эффективно осуществлять процесс получения лигнинолитических ферментов с широким спектром действия с помощью гриба белой гнили Panus tigrinus 8/18.

Использование мальтозы в качестве источника углерода, повышенных концентраций марганца в среде, внесение твина-80 и осуществление температурного сдвига в процессе культивирования позволяют существенно повысить содержание в культуральной жидкости MnP-б и обеспечить одновременный биосинтез оксидазы. Содержание Mn-пероксидазы с функциями ключевого фермента (MnP-б) в культуральной жидкости составляет не менее 18 Ед/мл, что ≈ в 5-7,5 раза больше, чем в способе-прототипе, при увеличении общего съема продукта в 57-84 раза. Кроме того, культуральная жидкость содержит значительные количества оксидазы (Ох), которая в отличие от типичных лакказ окисляет не только фенольные, но и нефенольные подструктуры лигнина ( ≈ 8,0-12,4 Ед/мл или общий съем - 1600-2480 Ед.).

Внесение в среду культивирования твина-80 также дает возможность значительно увеличить коэффициент заполнения ферментационного сосуда (8% - в способе-прототипе и не менее 30% - в предлагаемом способе).

Кроме того, способ позволяет упростить процесс, так как не требует специальных приспособлений для продувки ферментационных сосудов кислородом, и использовать для повышения буферной емкости среды различные, в том числе, дешевые и доступные вещества.

Формула изобретения

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИГНИНОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ, предусматривающий культивирование гриба белой гнили Panus tigrinus 8/18 в погружных условиях при аэрации на жидкой синтетической среде, содержащей источники углерода, азота, фосфора, минеральные соли, тиамин и микроэлементы, в присутствии индуктора до достижения максимальной активности ферментов, отличающийся тем, что в качестве источника углерода используют мальтозу, в среду дополнительно вводят твин-80, концентрацию марганца сернокислого доводят до 60 - 90 мг/л в пересчете на Mn (II), а в процессе культивирования осуществляют повышение температуры в интервале температур оптимального роста культуры.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что культивирование продуцента осуществляют в присутствии поликапроамидного волокна.

РИСУНКИ

Рисунок 1