Способ получения d - 2 (6 - -d- галактопиранозилбензтиазолил -2) - 4,5 -дигидротиазолил -4- карбоновой кислоты

 

Изобретение касается углеводов, в частности способа получения D - 2 - (6- b - D - галактопиранозилбентиазолил -2 ) 4,5 - дигидротиазолил -4- карбоновой кислоты, используемой в качестве субстрата для определения ферментативной активности b -галактозы, и может найти применение в иммуноферментном анализе, в ДНК - зондах и в генетической инженерии. Цель - создание нового способа получения указанного вещества. Синтез ведут реакцией 2,3,4,6-тетра-0-ацетил- b -D-галактопиранозилфторида с 2-циан-6-триметилсилилоксибензтиазолом в среде неполярного органического растворителя (бензол) в присутствии эфирата трехфтористого бора с выделением и очисткой хроматографией промежуточного 6-(2-цианобензтиазолил)-2,3,4,6-тетра-0-ацетил- b -D-галактопиранозида с последующим его дезацетилированием и конденсацией с D-цистеином. Продукт дезацетилирования можно подвергнуть очистке методом хроматографии и кристаллизации. Новый способ позволяет получить из доступных реагентов с хорошим выходом (61%) целевой продукт, обеспечивающий высокую чувствительность при обнаружении b -галактозидазы биолюминесцентным методом. 1 ил.

Изобретение относится к углеводам и гетероциклическим соединениям в частности к новому способу получения β -D-галактозида D-люциферина формулы I используемого в качестве субстрата для определения ферментативной активности β -галактозидазы, который может найти применение в генетической инженерии, иммуноферментном анализе и в ДНК-зондах.

Известен биолюминесцентный способ обнаружения β -галактозидазной активности [1] . Наилучшим субстратом в этом способе является о-нитрофенил- β-D-галактопиранозид, который расщепляется ферментом с образованием о-нитрофенола и галактозы. Галактоза определяется сложной многостадийной системой детекции, включающей три последовательные ферментативные реакции, требующие использования таких субстратов ферментов как КАД (никотинамидадениндинуклеотид), ФМН (флавинмононуклеотид), длинноцепочечный альдегид. Все это усложняет и удорожает проведение анализа.

Известны производные люциферина с этерифицированной фенольной группой общей формулы где R остаток фосфорной, серной или аминокислоты. В патенте [2] упоминаются соединения, где R - углеводный остаток, в частности, - β -D-галактопиранозил, предназначенные для биолюминесцентного обнаружения гидролаз (фосфатаз, сульфатаз, протеиназ и гликозидаз). Однако, способ получения соединения формулы I и метод его использования не описаны.

Способ получения аналога по структуре - люциферилфосфата основан на взаимодействии D-люциферина с хлорокисью фосфора и последующем гидролизе P-Cl-связей в соответствии со следующей схемой синтеза [3] Недостатком этого способа является то, что в качестве исходного вещества используется дорогостоящий люциферин. Кроме того, люциферин имеет две функциональные группы, по которым может протекать реакция взаимодействия - фенольный гидроксил, и карбокси-группу. Именно по этой причине выходы производных люциферина по фенольной гидроксильной группе низки и составляют, например, в случае фосфатов 29%. Существенным недостатком является также то, что в реакционных смесях присутствует не вошедший в реакцию люциферин, от которого чрезвычайно трудно освободиться и который мешает биолюминесцентному определению, создавая высокий фон.

Целью изобретения является разработка нового способа получения соединения формулы I, позволяющего с высоким выходом и из доступных реагентов получить целевой продукт, обладающий высокой чувствительностью при обнаружении ферментативной активности β-галактозидазы.

Предлагаемый способ получения соединения формулы I заключается в том, что 2,3,4,6-тетра-О-ацетил- β -D-галактопиранозилфторид подвергают взаимодействию с 2-циан-6-триметилсилилоксибензтиазолом в среде неполярного органического растворителя, такого как бензол, в присутствии эфирата трехфтористого бора в качестве конденсирующего агента выделяют и подвергают хроматографической очистке промежуточный 6-(2-цианобензтиазолил (2,3,4,6-тетра-О-ацетил- β-D-галактопиранозида) с его последующим дезацетилированием и конденсацией с D-цистеином.

Схема синтеза предлагаемого способа следующая: + ___→ Cпособ осуществляют следующим образом.

Взаимодействием 2,3,4,6-тетра-О-ацетил-β -D-галактопиранозилфторида с триметилсилиловым эфиром 2-циан-6-гидроксибензотиазола получают галактопиранозид (IV) с выходом 77%. Дезацетилированный галактозид (V) получают с выходом 86% путем снятия защитных ацетильных групп с производного (IV) действием каталитических количеств метилата натрия в метаноле. Соединение (V) превращают в целевой галактозид D-люциферина посредством конденсации с D-цис- теином в водно-метанольной среде с использованием карбоната натрия в качестве конденсирующего средства. Соединение (I) выделяют из реакционной смеси с выходом 61% путем кристаллизации. Применение в качестве исходного соединения 2-циан-6-триметилсилилоксибензотиазола, а не люциферина, как в способе-аналоге имеет ряд преимуществ.

В частности, в предлагаемом способе производные IV и V легко могут быть очищены хроматографией и кристаллизацией от возможных примесей 2-циан-6-гидрокси-бензотиазола, из которого на заключительной стадии синтеза может образоваться свободный люциферин, мешающий биолюминесцентному обнаружению β-галактозидазы. Во-вторых, -2-(6^l -β -галактопиранозилбензтиазолил-2)-4,5-дигидротиазолил-4-карбоновая кислота (I) используется не дорогостоящий D-люциферин, а его предшественник - 2-циано-6-гидроксибензотиазол, который более дешев и стабилен.

Синтез соединения (III) проводят путем силилирования 2-циан-6-гидроксибензотиазола смесью гексаметилдисилазан-триметилхлорсилан при нагревании. Взаимодействие фторида (II) с производным (III) осуществляют в среде бензола с использованием в качестве конденсирующего агента эфирата трехфтористого бора при комнатной температуре. Полученные соединения охарактеризованы значениями температур плавления и удельного вращения. Их строение доказано с помощью ¹³С ЯМР-спектроскопии. Так, в спектре соединения (IV) имеются необходимые сигналы галактопиранозильного остатка, связанного β -гликозидной связью, сигналы ацетильных групп, CN-группы и ароматических углеродных атомов бензотиазола. В спектре соединения (V), напротив, отсутствуют сигналы ацетильных групп, имеются требуемые сигналы CN-группы, бензотиазольного остатка и дезацетилированного β -D-галактопиранозида. В спектре галактозида D-люциферина (I) нет сигнала CN-группы, имеются 6 сигналов - β-D-галактопиранозида и 11 сигналов, отвечающих D-люцифериновому остатку.

П р и м е р 1. Синтез β-D-галактозида D-люциферина (I).

Синтез 2-циан-6-триметилсилилоксибензотиазола (III). Смесь 0,15 г 2-циан-6-гидроксибензотиазола, 2,0 мл гексаметилдисилазана и 1 мл триметилхлорсилана нагревают с обратным холодильником. Примерно через 0,5 ч смесь становится гомогенной, в холодильнике осаждается осадок хлорида аммония. Этот осадок аккуратно удаляют, избыток силилирующей смеси отгоняют при пониженном давлении, остаток кристаллизуют из гексана. Выделяют 0,17 г (81%) соединения (III), т.пл. 68-69^оС.

Синтез 6-(2-цианобензотиазолил)-2,3,4,6-тетра-О-ацетил- β-D-галактопиранозида (IV). К раствору 0,25 г (1,01 ммоль) эфира (III) и 0,40 г (1,15 ммоль) соединения (II) в 2,0 мл абс. бензола прибавляют раствор 0,13 мл (1,0 ммоль) эфирата трехфтористого бора в 1 мл бензола. Прибавление осуществляют по каплям и при перемешивании. После окончания прибавления (5-10 мин) смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 4 ч. Разбавляют хлороформом, промывают водой, хроматографируют на сорбенте Silpearl (ЧССР) в системе растворителей эфир-бензол 1:3. Выделяют 0,39 г (77%) соединения (IV). После кристаллизации из этанола т.пл. 160-161^оС, [ α ]_D +2^o (с 0,5, хлороформ).

¹³С ЯМР (CDCl₃, δ , м.д.): 99,6 (C1); 68,5 (C2); 70,7 (C3); 68,8 (C4); 71,7 (C₅); 61,4 (C₆) - сигналы остатка галактопиранозы, 20,6-20,7 (СН₃) ; 169,3-170,2 (СH₃CO); 112,9 (CN-группа); 107,9; 119,4; 126,2; 137,5; 149,0; 157,7 - сигналы углеродных атомов бензотиазола.

Синтез 6-(2-цианобензтиазолил)-β-D-галактопиранозида (V). К смеси 0,21 г соединения (IV) и 6 мл абс. метанола прибавляют 5 капель 1 н. раствора метилата натрия в абсолютном метаноле. Через 1 ч нейтрализуют катионитом КРС-2п, упаривают. Кристаллизацией из 4 мл этанола выделяют 0,12 г (86%) соединения (V), т. пл. 188-190^оС, [ α ]_D -56^o (с 0,5, пиридин), ¹³С ЯМР (пиридин-d-5): 102,9 (C1); 72,0 (C2); 75,2 (C3); 70,1 (C4); 77,9 (C5); 62,4 (C6) - сигналы галактопиранозильного остатка; 114,0 - (CN-группы); 108,1; 119,9; 125,8; 137,9; 147,8; 158,9; 170,2- сигналы бензтиазольного ядра.

Синтез D-2-(6-β-D-галактопиранозилбензтиазолил-2)-4,5- дигидротиазолил-4-ка-рбоновой кислоты (I) - - β-D-галактопиранозида D-люциферина. Смесь 0,04 г соединения (V), 0,02 г D-цистеина гидрохлорида (гидрохлорида 2-амино-3-меркаптопропионовой кислоты) в смеси 1 мл метанола и 1 мл воды перемешивают в токе аргона. Прибавляют 0,025 г карбоната натрия и продолжают перемешивание в течение 1,5 ч. Нейтрализуют 0,2 н. HCl до кислой реакции и оставляют при температуре 5-6^оС на 10-15 ч, Выделяют 0,032 г (61%) кристаллического β-D-галактопиранозида D-люциферина светляков (I), который представляет собой белое вещество, растворимое в воде, т.пл. 250-260^оС (разл. ). При тонкослойной хроматографии на силуфоле (ЧССР) в системе этилацетат-метанол (3:1) R_f=0,25 (относительно люциферина).

¹³С ЯМР (диметилсульфоксид -d₆): 101,4 (C1); 73,3 (C2); 75,8 (C3); 70,3 (C4); 78,2 (C5); 60,4 (C6) - сигналы остатка β -D-галактопиранозы; 34,8; 68,1; 108,3; 118,1; 124,7; 136,8; 147,8; 157,0; 158,6;164,4; 171,2 - сигналы D-люциферинового остатка.

УФ-спектр: три максимума поглощения: при 330, 260 и 220 нм (0,1 М фосфатный буфер, рН 7,3).

Спектры флуоресценции: максимум флуоресценции при 435 нм (возбуждение при 355 нм, 0,1 М трис-ацетатный буфер, рН 7,8). Содержание люциферина в полученном веществе 0,13%.

П р и м е р 2. Синтез β -D-галактозида D-люциферина осуществляют согласно примеру 1, однако 6-(2-цианобензтиазолил)- β -D-галактопиранозид (соединение V) непосредственно пеpед конденсацией с D-цистеином подвергают дополнительной очистке методом колоночной хроматографии на силикагеле Silpearl (ЧССР) в системе органических растворителей этилацетат-этанол с последующей кристаллизацией из этанола. Полученный β -D-галактопиранозид D-люциферина содержит 0,02% D-люциферина.

П р и м е р 3. Использование β -D-галактозида D-люциферина в качестве субстрата для биолюминесцентного определения активности β-галактозидазы.

К 1,0 мл 0,8 мМ раствора β-D-галактозида люциферина в 0,1 М фосфатном буфере, рН 7,3, содержащем 1 мМ MgSO₄, 0,1 М NaCl, добавляют 1-20 мл раствора β -галактозидазы в том же буфере. Инкубируют смесь при 37^оС в течение 100 мин, затем отбирают 20 мкл реакционной смеси и определяют концентрацию люциферина в этой смеси биолюминесцентным методом, как описано ниже. Для этого в люминометрическую кювету помещают 0,7 мл 0,1 М трис-ацетатного буфера, рН 7,8, содержащего 2 мМ ЭДТА, 10 мМ MgSO₄, 0,3 мМ раствора АТР в том же буфере, 10 мкл раствора люциферазы светляков с удельной активностью 10⁸-10⁹ усл.ед./мл (1 усл. ед. соответствует интенсивности биолюминесценции 10⁹ квант/сек). Кювету помещают в кюветное отделение люминометра, измеряют фоновое свечение (I_фон), вводят 20 мкл реакционной смеси с неизвестной концентрацией люциферина (см. выше) и измеряют интенсивность свечения I₁. Затем добавляют 10 мкл раствора люциферина с известной концентрацией ("внутренний стандарт") и измеряют интенсивность свечения I₂. Неизвестную концентрацию люциферина в реакционной смеси рассчитывают по формуле C_x = , где С_х - неизвестная концентрация люциферина; N_x - разбавление реакционной смеси с неизвестной концентрацией люциферина в люминометрической кювете; С - концентрация люциферина в растворе внутреннего стандарта в кювете; N_c - разбавление раствора внутреннего стандарта в кювете.

Активность β-галактозидазы пропорциональна концентрации люциферина, образовавшегося при действии этого фермента на β-D-галактозид D-люциферина в течение 100 мин. Калибровочный график для определения β-галактозидазы биолюминесцентным методом с использованием β -D-галактозида D-люциферина в качестве субстрата β-галактозидазы приведен на чертеже, где [люциферин]₁₀₀ - концентрация люциферина, мкМ через 100 мин инкубации субстрата с β-галактозидазой. Условия: 0,1 М фосфатный буфер, рН 7,3, содержащий 1 мМ MgSO₄, 0,1 M NaCl; 0,8 мМ β -D-галактозида D-люциферина, 37^о. Препарат β-D-галактозида D-люциферина содержит 0,02% D-люциферина. Предел обнаружения β-галактозидазы этим методом составляет 10^-16 М, т. е. не уступает по чувствительности биолюминесцентному методу обнаружения β-галактозидазы, описанному в работе [1]. При этом методика обнаружения упрощается за счет применения не трех ферментов, а одного.

Таким образом, предложенный новый способ получения β-D-галактозида D-люциферина формулы (I) позволяет получить продукт из доступных реагентов, с хорошим выходом. Причем особенностью предложенного способа является возможность очистки соединения формулы (I) по меньшей мере на двух предварительных этапах, что обеспечивает высокую чувствительность при обнаружении β-галактозидазы биолюминесцентным методом.

Формула изобретения

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ D-2(6- β -D-ГАЛАКТОПИРАНОЗИЛБЕНЗТИАЗОЛИЛ-2)-4,5-ДИГИДРОТИАЗОЛИЛ-4-КАРБОНОВОЙ КИСЛОТЫ формулы

отличающийся тем, что 2,3,4,6-тетра-О-ацетил- β -D-галактопиранозилфторид подвергают взаимодействию с 2-циан-6-триметилсилилоксибензтиазолом в среде неполярного органического растворителя, такого, как бензол, в присутствии эфирата трехфтористого бора в качестве конденсирующего реагента с выделением и очисткой хроматографией промежуточного 6-(2-цианобензотиазолил)-2,3,4,6-тетра-О-ацетил- β -D-галактопиранозида формулы

с последующим его дезацетилированием и конденсацией с D-цистеином.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что продукт дезацетилирования подвергают очистке методом хроматографии и кристаллизации.

РИСУНКИ

Рисунок 1