Способ получения сорбента для выделения белков

 

Использование в медицине, фармацевтике, микробиологии, биотехнологии для выделения белков и ферментов. Сущность: отмытый от примесей носитель обрабатывают раствором, содержащим соль титана или циркония, мочевину и в качестве комплексообразующего агента C₂O²₄^- , H₂O₂ , H₂O₄ при молярном соотношении , равном 0,002 - 0,5 : 0,005 - 2,0 : 0,005 - 1,0. Суспензию непрерывно перемешивают в течение 2 - 5 ч при 80 - 100°С, затем отделяют от раствора, промывают водой и высушивают на воздухе, после чего подвергают термообработке при 100 - 600°С в течение 0,3 - 2 ч. Носитель - неорганический макро- или мезопористый материал с размером пор - . 3 з.п. ф-лы, 2 табл.

Изобретение относится к технологии получения сорбентов на основе твердых носителей, которые могут быть использованы в медицинской, фармацевтической, микробиологической промышленности, в биотехнологических производствах для получения новых биокатализаторов, очистки и разделения белка, ферментов и т.д.

Известен способ получения сорбента для очистки растворов от трипсина, заключающийся в попеременной обработке силикагеля парами четыреххлористого титана и воды при 140-180^оС. Такая обработка приводит к созданию на поверхности силикагеля титансодержащих групп при их содержании в сорбенте 19-20 мас. % в пересчете на оксид титана. Емкость сорбента по трипсину невелика и составляет 0,75 мг/г сорбента [1].

Известен также способ получения сорбента для извлечения белков из сточных вод производства белково-витаминного концентрата, состоящий в попеременной обработке титансодержащего силикагеля парами гексахлорида вольфрама и воды при 230^оС. Такая обработка приводит к созданию на поверхности титансодержащего силикагеля окиси вольфрама. Сорбент содержит, мас.%: 50-75 силикагеля. 6-20 оксида титана и 19-30 оксида вольфрама. Емкость сорбента по отношению к белку также невелика и составляет 4,84 мг/г сорбента [2].

Общий недостаток известных сорбентов - их неэффективность в случае выделения или разделения других белков, с большей молекулярной массой, например белков крови, из-за малой емкости по отношению к ним. Кроме того, недостатком указанных сорбентов является невысокая прочность пленки оксидов металлов при многократном использовании или термической стерилизации из-за ее отслаивания, что приводит к загрязнению раствора частицами сорбента. Способ экологически вреден, так как гидролиз хлорида титана и вольфрама протекает с выделением больших объемов хлористого водорода, требующего утилизации.

Наиболее близким к изобретению по технической сущности и назначению является способ получения сорбентов для иммобилизации ферментов путем модификации неорганических носителей (стекло, диоксид кремния и т.п.) оксидом титана (IV) или циркония [3].

По этому способу носитель обрабатывают 10-15%-ным раствором хлорида титана (IV) в соляной кислоте, который подвергают гидролизу при температуре 30^оС в течение часа (или при температуре кипения в течение 3-5 ч), или нейтрализуют аммиаком. Модифицированный носитель промывают многократно водой и высушивают. Полученный сорбент в дальнейшем используют для адсорбции ферментов.

Главным недостатком такого способа получения является то, что гидроксид металла для модификации носителя, полученный при гидролизе тетрахлорида металла, осаждается в большей степени по объему раствора, образуя в основном механическую смесь гидроксида и носителя. При этом не сохраняется пористая структура носителя из-за образования объемных частиц гидроксида, в том числе и в порах носителя. Полученный по прототипу сорбент в значительной степени неустойчив по отношению к промывке водой из-за смывания частиц гидроксида металла, что, возможно, является в дальнейшем причиной нестабильности адсорбированных на поверхности белковых молекул.

Цель изобретения - создание способа получения сорбентов, обладающих повышенной стабильностью и селективностью в отношении адсорбции и иммобилизации белковых молекул, в частности белков крови.

Поставленная цель достигается способом получения сорбентов, включающим обработку носителя растворами солей титана или циркония и мочевиной в присутствии комплексообразующего агента (перекиси водорода, серной или щавелевой кислоты), образующего комплексное соединение с металлом с константой устойчивости от 10³ до 10¹⁰, промывку, сушку, дополнительную термообработку модифицированного гидроксидом титана (IV) или циркония носителя при температуре 100-600^оС. При этом соотношение соли металлов: мочевины : комплексообразующего агента составляет 0,002-0,5 : 0,005-2,0 : 0,05-1,0; а в качестве носителя используют макро- или мезопористый материал с размером пор от 100 до 2000 2000 .

Отличительными признаками способа являются: проведение обработки носителя растворами солей металлов и мочевины в присутствии комплексообразующего агента, образующего комплексное соединение с металлом с константой устойчивости от 10³ до 10¹⁰; дополнительная термообработка модифицированного гидроокисью титана или циркония носителя при температуре 100-600^оС; использование в качестве комплексообразующего агента растворов перекиси водорода, серной или щавелевой кислот и проведение смешивания солей металлов с мочевиной и комплексообразующим агентом при их мольном соотношении, равном 0,002-0,5 : 0,005-2,0 : 0,05-1,0; использование макро- или мезопористого носителя.

Способ осуществляют следующим образом.

Носитель, например макропористое стекло, макропористый силикагель или мезопористый углеродный материал, предварительно обрабатывают поочередно 1,5% -ными растворами соляной кислоты, щелочи и водой. Подготовленный таким образом носитель помещают в раствор, содержащий определенные количества реакционных компонентов - солей металлов, мочевины и комплексообразующего агента. Полученную суспензию нагревают при непрерывном перемешивании при 80-100^оС в течение 2-5 ч, после чего сорбент отделяют от раствора, отмывают водой и сушат на воздухе. Далее сорбент подвергают термообработке при 100-600^оС в течение 0,3-2 ч.

В качестве реакционного раствора для получения сорбента используют основной хлорид циркония или тетрахлорид титана, мочевину, а в качестве комплексообразующего агента - C₂O₄^2-, H₂O₂, H₂SO₄.

Необходимым условием образования тонкой пленки гидроксида металла на носителе является использование мочевины в качестве мягкого осадителя и комплексообразующего агента, введение которого смещает величину рН начала образования гидроокиси (рН_н.о.г.) металла в область больших значений. Кроме того, используемый комплексообразователь, образующий комплексное соединение с металлом с константой устойчивости от 10³ до 10¹⁰, определяет количественное соотношение металла и осадителя (мочевины). При меньшей величине константы устойчивости потребуется слишком большой избыток комплексообразующего агента для смещения рН_н.о.г., а при большей величине константы устойчивости осаждение гидроокиси мочевиной может оказаться невозможным.

Образование пленок на носителях происходит при изменении концентрации металла от 0,002 до 0,5 М/л, мочевины от 0,005 до 2,0 М/л, комплексообразующего агента от 0,05 до 1,0 М/л. Использование концентраций реагентов в указанных интервалах позволяет получить сорбент, который будучи подвергнут термообработке, содержит от 1 до 5% оксида металла на единицу массы носителя.

Нанесение тонкой пленки оксида металла на макро- или мезопористый носитель позволяет сохранить размер поверхности и макропористую структуру практически неизменной и сделать сорбент пригодным для поглощения белков большой молекулярной массы. Обязательным условием является использование в качестве твердого носителя макропористого или мезопористого материала с размером пор 100-2000 100-2000 .

Поры носителя размером менее 100 100 при модифицировании оксидом титана или циркония закрываются пленкой и сорбент приобретает микропористую структуру. Вследствие больших размеров белковых молекул поверхность образующихся микропор становится недоступной для адсорбции белков и падает емкость сорбента.

Дополнительная термообработка сорбента при 100-600^оС обеспечивает формирование макропористой структуры пленки при высокотемпературном старении гидроокиси.

Совокупность указанных выше признаков обеспечивает достижение нового технического результата. Установлено, что предлагаемый способ позволяет получить сорбент, обладающий селективностью в отношении глобулярных белков крови - бычьего сывороточного альбумина (ВСА, мол.масса 67000) и γ -глобулина (мол.масса 150000). Так, при использовании сорбента на основе макропористого стекла, покрытого пленкой оксида титана, полученного заявляемым способом, степень очистки раствора БСА от γ -глобулина увеличивается в 10 раз по сравнению с аналогичным сорбентом, не подвергшимся дополнительной термической обработке.

Интервал температурной обработки сорбентов на твердых носителях, модифицированных оксидом титана и циркония, обоснован экспериментально и лежит в пределах от 100 до 600^oС.

Нижнее значение температуры 100^оС определяется тем, что сорбент, термически обработанный при этой температуре, обеспечивает по крайней мере двукратную очистку раствора белка от примеси другого белка, а при температуре ниже 100^оС эффект очистки меньше. Выше 600^оС термообработка нецелесообразна вследствие незначительных степеней очистки, непроизводительных расходов электроэнергии и термической нестойкости дисперсной силикатной матрицы.

Экспериментально показано, что для достижения необходимого результата достаточное время термообработки составляет 0,3-2 ч.

Значение рН раствора, из которого проводят разделение белков, определяется природой белков и изменяется в соответствии со значением изоэлектрических точек р1, вблизи которых наблюдается максимальная адсорбция белка из раствора.

Для осуществления предлагаемого способа получения сорбентов на основе твердых носителей требуются известные выпускаемые промышленностью реагенты и технические средства для обработки носителя растворами, фильтрации, термообработки (реакционные сосуды, термостат, сушильные шкафы, муфели и т.д.).

Возможность реализации разработанного способа получения неорганических сорбентов подтверждается также примерами, описывающими последовательность и условия выполнения операций способа. Полученные образцы сорбентов на основе оксида титана и оксида циркония были испытаны на эффективность при разделении белков. Общие условия испытаний для всех примеров следующие: масса навески сорбента - 0,1 г; для разделения берут 10 мл фосфатного буферного раствора с рН = 8,5, содержащего 1 мг/мл БСА и 1 мг/мл γ -глобулина, меченного I¹²⁵. Суммарное содержание белков в растворе определяли спектрофотометрически при длине волны 280 нм, содержание γ -глобулина - радиометрически, содержание БСА - по разнице определений. Степень очистки раствора БСА от γ -глобулина оценивали по отношению концентрации γ-глобулина в растворе после обработки раствора сорбентом, приготовленным по заявляемому способу, но термически не обработанном, к концентрации γ-глобулина в растворе после обработки сорбентом, приготовленным по заявляемому способу (с дополнительной термообработкой).

Результаты испытания сорбентов в зависимости от условий термообработки приведены в табл.1.

П р и м е р ы.

Получение сорбента на основе оксида титана Навеску макропористого стекла МПС-1000 массой 5 г, отмытого поочередной обработкой 1,5% -ными растворами кислоты, щелочи, затем водой, помещают в 0,5 л раствора с концентрацией тетрахлорида титана 0,05 М/л, мочевины 0,5 М/л, перекиси водорода 0,5 М/л. Суспензию выдерживают в термостате при 90±5^оС при непрерывном перемешивании в течение 5 ч. Полученный сорбент отмывают водой, высушивают на воздухе. Далее сорбент прокаливают на воздухе при 100^оС в течение 0,3 ч.

При испытании сорбента навеску сорбента массой 0,1 г помещают в 10 мл фосфатного буферного раствора с рН = 8,5, содержащего 1 мг/мл БСА и 1 мг/мл γ -глобулина, меченного I¹²⁵. Сорбент выдерживают в растворе при непрерывном встряхивании в течение 5 ч. Затем сорбент отделяют от раствора и определяют суммарное содержание белков в растворе и содержание γ -глобулина. Содержание БСА находят по разнице определений.

Содержание БСА в растворе составляет 0,975 мг/мл, содержание γ -глобулина - 0,025 мг/мл, чистота раствора БСА - 97,5%. Степень очистки раствора БСА от γ -глобулина рассчитывают в сравнении к концентрации γ-глобулина в растворе после извлечения сорбентом, приготовленным без дополнительной термообработки.

Пример соответствует примеру 1 в табл.1.

Получение сорбента на основе оксида циркония.

Навеску макропористого стекла МПС-1000, массой 5 г, предварительно подготовленного, как в примере 1 (табл.1), помещают в 0,5 л раствора с концентрацией оксихлорида циркония 0,01 М/л, мочевины 0,5 М/л и щавелевой кислоты 0,5 М/л. Суспензию выдерживают в термостате при перемешивании при 90 ±5^оС в течение 4 ч. Полученный сорбент отмывают водой, высушивают и подвергают термической обработке при 100^оС в течение 0,3 ч.

Испытание сорбента по разделению белков проводят, как в примере 1 (табл.1).

Пример соответствует примеру 2 в табл.2.

Получение сорбента по прототипу Навеску макропористого стекла МПС-1000 помещают в сосуд емкостью 25 мл с завинчивающейся крышкой, добавляют 10 мл 10%-ного (вес/объем) хлорида титана (IV) и прогревают смесь при 30^оС в течение часа (реакционная среда - кислая). Удаляют остаток раствора хлорида титана (IV). Тщательно промывают активированный носитель дистиллированной водой. Высушивают промытый носитель при 100^оС в течение ночи.

Испытание сорбента по разделению белков проводят, как в примере 1 (табл.1).

Пример соответствует примеру 12 П в табл.1.

Как следует из приведенных примеров, в сравнении с прототипом емкость (измеренная по величине абсорбции БСА при рН = 4,7) сорбентов, полученных по заявляемому способу, возрастает. Емкости приведены в примерах 12 П, 17 П, 22 П табл.1 и 12 П табл.2 - емкости сорбентов по прототипу и в примерах 3, 14, 19 табл.1 и 3 табл.2 - по заявляемому способу.

В приведенных примерах повышение чистоты раствора белка наблюдается при использовании сорбентов, подвергнутых термической обработке в широком температурном интервале. Однако для целей практического использования пригоден сорбент, дающий по крайней мере двукратную очистку раствора от примеси другого белка.

По этой причине широкий интервал температурной обработки целесообразно ограничить нижним значением температур - 100^оС (примеры 1,2,13,18 табл.1 и 1,2 табл.2). При прокаливании сорбента при температуре менее 100^оС не достигается двукратной очистки раствора от примеси (примеры 10 К табл.1 и 2).

Верхний предел температурной обработки ограничен значением температуры 600^оС (пример 4,5,15,20 табл.1 и 4,5 табл.2), так как повышение температуры обработки выше 600^оС приводит к снижению чистоты получаемого раствора белка (примеры 6 К, 7 К табл.1 и табл.2).

Сравнение достигнутой чистоты раствора белка проводим с чистотой раствора белка, полученной при использовании сорбента, не подвергнутого термической обработке (примеры 11 С, 16 С, 21 С табл.1 и 11 С табл.2).

Продолжительность температурной обработки лежит в интервале 0,3-2 ч. При менее продолжительной термообработке сорбента наблюдается снижение чистоты раствора белка в сравнении с более длительной обработкой сорбента (примеры 1,2,4,5 табл.1 и 2).

Продолжительность температурной обработки менее 0,3 ч не позволяет достичь двукратной степени очистки белка от примеси другого белка (примеры 9 К табл.1 и 2). Более продолжительная температурная обработка сорбента не приводит к увеличению степени очистки раствора белка от примеси (примеры 8 К табл.1 и 2) и, кроме того, связана с непроизводительным расходом энергии.

Формула изобретения

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СОРБЕНТА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ БЕЛКОВ, включающий обработку носителя растворами солей титана или циркония при повышенной температуре, промывку и сушку, отличающийся тем, что обработку ведут в присутствии мочевины и агента, образующего комплексное соединение с титаном или цирконием с константой устойчивости 10³ - 10¹⁰ и сорбент дополнительно подвергают термической обработке при 100 - 600^oC 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве комплексообразующего агента используют раствор перекиси водорода, серной или щавелевой кислоты.

3. Способ по пп.1 и 2, отличающийся тем, что обработку ведут при молярном соотношении соли металла, мочевины и комплексообразующего агента в растворе 0,002-0,5 : 0,005-2,0 : 0,05-1,0.

4. Способ по пп. 1-3, отличающийся тем, что в качестве носителя используют мезо- и макропористый материал с размером пор .

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3