Способ количественного учета метанобразующих бактерий

 

Область применения: биотехнология. Сущность: описывается способ количественной оценки бактерий метанового газа, в котором солидную пробу среды, содержащей бактерии метанового газа, подвергают максимально в течение одной секунды кратковременному облучению светом длиной волны 395 - 440 нм, а появляющуюся в результате этого флуоресценцию определяют цитометрически. С помощью этого способа определение бактерий метанового газа возможно по месту без предварительной экстракции. Данный способ пригоден в частности для применения при контроле и управлении реакторами с метаногенными бактериями. 3 з. п.ф-лы, 9 ил.

Изобретение касается способа количественной оценки бактерий метанового газа.

Органический материал без доступа воздуха и в присутствии соответствующей микрофлоры превращается в метановый газ. При этом такой материал сначала гидролизуется в процессе многоступенчатого разложения (фаза гидролиза), затем сбраживается до образования органических кислот (фаза повышения кислотности) с помощью ацетогенных бактерий превращается в молекулярный водород и двуокись углерода (ацетогенная фаза), а потом с помощью метаногенных бактерий (бактерии метанового газа) превращается в метановый газ (метаногенная фаза). Такой ход процесса может лишь в том случае протекать эффективно, если в смешанной популяции бактерий могут находиться и размножаться достаточное количество бактерий метанового газа. В противном случае вследствие отдельных промежуточных продуктов будет заторможен весь процесс разложения.

Такой путь разложения происходит в природе повсюду, там где органический материал разлагается при прекращении доступа воздуха, т.е. в болотах и прудах, в аутрофных водоемах, на дне океанов и в пищеварительных трактах человека и животного. В так называемых реакторах биологического газа (ферменторах) он используется для того, чтобы органические отходы из системы очистки сточных вод промышленного и сельскохозяйственного производства превращать в полезный метановый газ.

Известно, что бактерии метанового газа при кратковременном облучении имеют аутофлуоресценцию. Это флуоресценция вызывается фактором F₄₂₀ (флавин F₄₂₀), аналогом мононуклеотида флавина. Характерный спектр световой абсорбции и спектр флуоресценции этого вещества (сравни фиг.1,а,в) позволяет обнаружить эти бактерии под флуоресцентным микроскопом; микроскопическая количественная оценка или подсчет в счетной камере представляется однако невозможным, поскольку краситель разрушается в результате световой абсорбции в течение нескольких секунд, и бактерии теряют свою флуоресценцию.

Определение концентрации фактора F₄₂₀ в сапропеле для установления метаногенной активности является известным, однако данный способ предполагает, что F₄₂₀ экстрагируют из сапропели, предварительно очищают, а затем измеряют флуориметрическим способом. Описано осуществляемое на живом организме измерение F₄₂₀-флуоресценции в культурах термоаутотрофикум метанобактерий посредством лазерной спектроскопии без предварительного трудоемкого процесса экстракции. Однако эти измерения вследствие их восприимчивости к помехам ограничиваются чистыми культурами метаногенных бактерий и не позволяют количественную оценку этих бактерий на установках.

Задача данного изобретения заключается в том, чтобы создать быстрый, надежный и простой метод количественной оценки бактерий, производящих метан, при анаэробных процессах разложения, который был бы вполне пригодным в частности также для контроля и управления объемом образования метанового газа в биогаз - реакторах. Эта задача решается с помощью предложенного способа.

Предметом данного изобретения является способ количественной оценки бактерий метанового газа, в особенности для контроля объема образования метана в реакторах с метаногенными бактериями, который заключается в том, что достаточную пробу среды, содержащей бактерии метанового газа, подвергают в течение максимально одной секунды кратковременному облучению светом с длиной волны 395-440 нм, а появляющуюся в результате этого флуоресценцию определяют с помощью цитометра непрерывного действия.

Для достаточно пригодной количественной оценки и для установления процентного содержания бактеpий метанового газа на всех бактериях представляется целесообразным наряду с бактериями метанового газа определять также и все количество микроорганизмов. Это может происходить одновременно в результате измерения светового рассеяния, которое, правда, помимо микроорганизмов, учитывает также и другие мелкие частицы, или в результате окрашивания с помощью DWS микроорганизмов, при этом оба световых сигнала определяют затем одновременно. Определение рассеяния света и окрашивание посредством DWS можно осуществлять также параллельно, в результате чего можно еще более повысить точность.

В целесообразной форме осуществления предложенного способа поэтому и общее количество имеющихся микроорганизмов определяют также посредством измерения рассеянного света и (или окрашивания с помощью ДНК) дезоксирибонуклеиновой кислоты.

С целью подготовки к проведению цитометрии непрерывного действия из проб следует удалить мешающие сопутствующие вещества и при необходимости осуществить соответствующим образом предварительную обработку. Это можно производить известным для этого способом; как правило, достаточно бывает фильтрации; так, например, пробы сапропеля из сапропелевых башен обычной биогазовой установки для очистки коммунальных сточных вод отфильтровывают через бумажный фильтр, а фильтрат без дальнейшей обработки измеряют в цитометре.

Цитометрия для определения количества.

Это обычно известный и часто применяемый метод анализа (ячеек) клеток любого рода, при этом можно измерять несколько параметров, как содержание ДНК, РНК и протеина, иммунофлуоресценции, размера клеток и форму клеток одновременно. Выбор технологических и аппаратурных форм осуществления, применяемый для предложенного способа, зависит поэтому, в частности, от специфической исследуемой пробы, от подготовки пробы и от технологических мер. Для одновременного измерения рассеяния света и/или окрашивания с помощью ДНК вполне пригодным является, например, цитомер для определения количества фирмы "Skatron" (Скетрон).

Для осуществления предложенного способа бактерии облучают в суспензии посредством голубого возбуждающего света, исходящего из ртутной лампы и отфильтрованного в диапазоне 395-440 нм. Одновременно с помощью двух фотоэлектронных умножителей измеряют рассеянный свет и свет флуоресценции, исходящий от бактерий, который отфильтрован в диапазоне 470 нм, и эти сигналы анализируют посредством компьютера. Эти бактерии подвергают лишь на доли секунды возбуждающему свету, так чтобы был исключен фотолиз F₄₂₀. Это измерительное устройство позволяет осуществлять измерение всех бактерий с помощью рассеянного света, а бактерии метанового газа учитывать количественно посредством дополнительного света флуоресценции.

С помощью предложенного способа, таким образом, возможно производить быстрый и простой количественный анализ бактерий метанового газа посредством их собственной флуоресценции, например, в сапропели, т.е. без недостатков, которые связаны с известными до сих пор способами, так, например, экстракция. В частности, с помощью предложенного способа возможно быстрым и простым образом оценивать потенциал разложения гнилостных смесей вообще и производительность реакторов с метаногенными бактериями в частности. Далее представляется возможным осуществлять непрерывно контроль и управление установкой биохимического газа с помощью полностью автоматической и совместно включенной станции измерения. Поэтому предметом данного изобретения является также применение предложенного способа для контроля и управления реакторами с метаногенными бактериями, осуществляемое посредством концентрации бактерий метанового газа. Такой контроль и управление можно производить также полностью автоматически. Поэтому данное изобретение касается в частности также применения предложенного способа для автоматического управления установками с бактериями метанового газа, в котором на станции учета измеренных величин с использованием цитометрии определяют концентрацию бактерий метанового газа, и как регулируемую величину используют для управления установкой, например, посредством регулирования насосов или нагревательных элементов. Под понятием "Реакторы с метаногенными бактериями" в рамках настоящего изобретения следует понимать все установки, работающим с метаногенными бактериями. Сюда относятся, например, все реакторы биохимического газа, ферментаторы, метантенки или сапропелевые башни, служащие для получения твердого или жидкого отхода или рассчитанные для получения метанового газа.

Наряду с этим предложенный способ однако пригоден, например, также для качественного или количественного определения (количественной оценки) бактерий метанового газа и их процентного содержания в пищеварительном тракте животного и человека, благодаря чему он представляет собой ценный ветеринарный и медицинский метод исследования для диагностических, а также терапевтических целей, и для контроля и анализа естественно проявляющихся процессов гниения экосистем, как, например, степени зутрофирования водоема.

Поэтому предметом данного изобретения является также применение предложенного способа для определения бактерий метанового газа в пищеварительном тракте животного и человека и для контроля и оценки появляющихся в природе процессов гниения экосистем.

П р и м е р 1. Измерение чистой культуры бактерий метанового газа.

Метаногенные бактерии Spezies Methanococcus Vinelandii были выращены в чистой культуре до плотности 2,7˙10⁸ на 1 мл, а затем их измеряли в цитометре.

Способ поясняется фиг.1, 9.

На фиг.2а,б,в показано измерение чистой культуры Methanococcus Vinelandii с помощью цитометра непрерывного действия: 2а) каждая точка соответствует одной измеренной бактерии; для каждой бактерии после возбуждения голубым светом в диапазоне 395-440 нм был измерен общий рассеянный свет и свет флуоресценции 470 нм; 2б) нанесение линейной доли рассеянного света против частоты измерений; 2в) нанесение линейного сигнала флуоресценции против частоты измерений; LINSCT означает линейную интенсивность рассеянного света; LINFLI означает линейную интенсивность света флуоресценции.

На фиг. 2, г показана оценка фиг. 2в: стрелка означает интенсивность флуоресценции, начиная от которой частицы классифицируются как флуоресцентные. Отсюда процент бактерий флуоресценции получается как 94,22%.

Как видно из анализа гистограммы интенсивность флуоресценции против частоты сигналов из фиг.2,г, 94% частиц, отдающих 100000 рассеянного света, показывают, следовательно, отчетливый сигнал флуоресценции. Для контроля такую же суспензию из бактерий в течение одного часа подвергали сильному воздействию света ртутной лампы на расстоянии 5 см - 100 Вт, при этом фотолизируется флавин. Эту суспензию снова измеряли в цитометре.

На фиг.3а,б,в показано измерение чистой культуры бактерий типа Methanococcus vinelandii после фотолиза фактора F₄₂₀ посредством голубого света; на фиг.3,г показан анализ фиг.3с.

На фиг. 3 видно, что бактерии хотя еще и рассеивают свет возбудителя, однако больше не отдают света флуоресценции.

На фиг. 4 показана зависимость измеренных импульсов флуоресценции от числа бактерий, пропущенных мимо измерительного луча; на фиг.5 - зависимость измеренных импульсов флуоресценции от разбавления чистой культуры Methanococcus.

На фиг. 4 и 5 показано, что бактерии метанового газа можно посредством света флуоресценции в широком диапазоне разбавления и дозировки пробы учитывать в количественном плане с помощью этой измерительной системы. Только лишь, начиная с числа бактерий, пропущенных через измерительную струю 6,8˙10⁴ с эта измерительная система больше не учитывает все бактерии метанового газа.

П р и м е р 2. Количественная оценка бактерий метанового газа в сапропеле установки биохимического газа.

Пробы сапропели из сапропелевых башен обычно построенной установки биогаза для очистки коммунальных сточных вод были отфильтрованы через бумажный фильтр, а фильтрат измеряли без дальнейшей обработки в цитометре.

На фиг.6 показано измерение отфильтрованной пробы сапропели из сапропелевой башни (бродильной башни установки биохимического газа; LINSCT означает линейную интенсивность рассеянного света, а LINFI I - линейную интенсивность света флуоресценции. На фиг.6,е показана оценка фиг.6,д.

Как видно из фиг.6, бактерии метанового газа отличаются своей специфической флуоресценцией от других бактерий, производящих лишь рассеянный свет. При этом можно определять как их процентное содержание на всей популяции бактерий, так и их абсолютную плотность клеток в суспензии. Анализ осуществляется посредством гистограммы частоты клеток против интенсивности флуоресценции, при этом бактерии метанового газа осаждаются заметно от других бактерий как в линейном, так и в полулогарифмическом нанесении. Для контроля проба, как в примере 2, обесцвечивалась посредством света ртутной лампы, а затем снова измерялась; в этой пробе необходимо измерить лишь еще частицы с рассеянным светом, но без доли света флуоресценции.

Одинаковую пробу измеряли теперь последовательно десять раз и при каждом отдельном измерении определяли процентное содержание бактерий метанового газа на всех бактериях. Получалась средняя величина 3,71% со стандартным отклонением 0,186.

Контроль и управление реакторами с метаногенными бактериями посредством предложенного способа можно осуществлять, например, следующим образом: Согласно изобретению определяют концентрацию бактерий метанового газа и с помощью применения следующих мер можно оказывать влияние на их концентрацию (удерживать постоянной), и таким образом, достигать оптимизации сбраживания: 1) Оптимизация физико-химических параметров реактора (рН - величина посредством добавления извести, температура посредством нагревания реактора, перемешивания смеси сапропели в результате использования соответствующих циркуляционных насосов); 2) Соответствие отношения смеси затравочного шлама к привнесенному отходу оптимальной концентрации бактерий метанового газа; и/или 3) Добавление в определенной дозировке активаторов (например, получаемый в торговле полиэлектролит), например, BiO - Klar - Algin, метан - активный//или сухих бактерий на гидролитическую и кислотообразующую стадию гниения.

Управление и контроль установок с бактериями метанового газа возможно также полностью автоматически, при этом концентрацию метаногенных бактерий определяют на пункте учета измеренных величин, основывающегося на цитометрии, и как регулируемую величину используют для управления насосами (например, для дозировки бактерий, затравочного шлама, субстрата или активаторов) или нагревательными элементами (для оптимизации температуры реакторов).

Надписи на фиг.1-6.

Фиг 1, а: 1 - абсорбент, 2 - длина волны (нм); фиг.1,б: 1 - флуоресценция (выбранные единицы). 2 - эмиссия (длина волны, нм); фиг.2,г: 1 - линейная интенсивность света флуоресценции, 2 - относительная частота; фиг. 4: измеренные частицы флуоресценции в секунду; 2 - метанококкен, поданный через измерительную кювету в секунду; фиг.5: 1 - число измеренных импульсов флуоресценции, 2 фактор разбавления; фиг.6,б: лог.частота; фиг.6,г: линейная частота; фиг.6,е: 1 - гистограмма, 2 - бродильная башня, 3 - относительная частота.

П р и м е р 3. Подготовленные пробы могут непосредственно измеряться в проточном цитометре.

При этом концентрация бактерий в пробе не должна превышать 2˙10⁹. Пробы с более высокими концентрациями должны быть разбавлены. Измеряемую пробу с помощью микрошприца емкостью 100 мкл непосредственно впрыскивают в защитный поток дистиллированной воды. Давление потока составляет 0,9 кпонд/см². Скорость инжекции пробы зависит от концентрации бактерий в суспензии. При концентрациях 5˙10⁷-2˙10⁹ клеток/мл целесообразно, чтобы она составляла 1 мкл/мин. При более низких концентрациях инжекцию проводят со скоростью 10 мкл/мин. При этом частицы попадают на предметное стекло и облучаются светом с длиной волны 395-440 нм. Свет с такими параметрами с помощью полосового фильтра выделяется из пучка света ртутной лампы высокого давления. Продолжительность облучения бактерий зависит от времени их нахождения на предметном стекле, а также размера бленды на пути лучей ртутной лампы. В случае приведенных примеров она составляет миллисекунды. Световые сигналы от частиц проходят через два объектива, регистрируются фотоумножителем и анализируются с помощью компьютера по одной из серийных программ. При осуществлении способа в соответствии с настоящей заявкой использовались только фотоумножители типа "зеленый" или детекторы с малым углом. При этом с помощью полосового фильтра, помещаемого перед РМТ, выделяется флуоресцентное излучение с длиной волны 470-490 нм, а детектор с малым углом регистрирует в тельном поле в узком углу рассеянный свет частиц, интенсивность которого пропорциональна размеру частиц.

Приложенное к фотоумножителям напряжение в случае детектора рассеянного света составляло 570, а в случае флуоресцентного детектора - 800 В. Коэффициент усиления для детектора рассеянного света равнялся 1. Для флуоресцентного детектора можно использовать пропорциональную или логарифмическую настройку. Константа времени для регистрации и распределения сигналов по 256 каналам равнялась 2 мкс. Все частицы, проходящие через луч света, при возбуждении их светом с длиной волны 395-440 нм регистрируются цитометром по рассеянному свету в узком углу и по флуоресцентному излучению с длиной волны 470-490 нм. Результаты измерений представляются в виде гистограмм, приведенных в примерах. В каждой пробе, как правило, измеряли 1000 метанобразующих бактерий, на что в случае проб сапропеля затрачивалось около 20 с.

На фиг.7 показано затухание флуоресценции проб ила сточных вод: (а) метаногенные бактерии с небольшим количеством субстрата, (в) метаногенные бактерии насыщенные субстратом (длина волны облучения 405 нм) по оси абсцисс: время (с), по оси ординат: 1 (количество фотонов); на фиг. 8 - зависимость общего количества бактерий и метаногенных бактерий от времени фильтрации. По оси абсцисс: время фильтрации (с), по левой оси ординат: общая концентрация бактерий (клетки/мл), по правой оси ординат: концентрация метаногенных бактерий (клетки/мл). Затемненные квадраты: общая концентрация бактерий, незатемненные квадраты: концентрация метаногенных бактерий; на фиг.9 - зависи- мость суточного выхода метана в расчете на одну бактерию от концентрации бактерий. По оси абсцисс: концентрация метаногенных бактерий (клетки/мл), по оси ординат: количество газа в расчете на одну бактерию в день.

Формула изобретения

1. СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО УЧЕТА МЕТАНОБРАЗУЮЩИХ БАКТЕРИЙ, предусматривающий отбор проб и измерение их флуоресценции, отличающийся тем, что, с целью повышения точности определения, измерение производят с помощью цитометра непрерывного действия после облучения светом с длиной волны 395 - 440 нм в течение времени менее 1 с.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что пробу отбирают из реактора с метанообразующими бактериями.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что пробу отбирают из экскрементов пищеварительного тракта животных или человека.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что пробу отбирают из гниющих смесей естественного происхождения или из экосистем.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9