Способ получения пиобактериофага

 

Использование: биотехнология, производство медицинских биологических препаратов. Сущность способа: проводят культивирование бактерий и бактериофагов стафилококка, стрептококка, синегнойной палочки, кишечной палочки, протея и клебсиелл в жидкой питательной среде. Каждый вид бактерий и бактериофагов культивируют раздельно, но условия культивирования являются общими для всех видов. Культивирование проводится в условиях интенсивной аэрации и перемешивания при 30 - 70%-ном насыщении растворенным кислородом культуральной среды с использованием экспоненциально размножающейся бактериальной популяции. Полученные фаголизаты всех бактериофагов сводят в единый объем, перемешивают и подвергают микро- и ультрафильтрации в режиме тангенциального потока через мембраны с размером пор 0,2 мкм и мембраны с порогом задержания веществ 150 - 200 КД, после чего проводят заключительную стерилизующую микрофильтрацию. Степень очистки бактериофагов от метаболитов бактерий и белков среды составляет 98 1,1% . Способ позволяет расшырить спектр антибактериальной активности препарата и обеспечивает высокий выход биомассы бактериофагов. 2 табл.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к производству медицинских биологических препаратов.

Гнойно-воспалительные заболевания, вызванные бактериями стафилококка, стрептококка, синегнойной и кишечной палочкой, протеем, широко распространены и трудно поддаются антибиотикотерапии, часто заканчиваются смертельным исходом, особенно у детей раннего возраста. В последние годы наряду с перечисленными возбудителями в 10-30% случаев от больных выделяются бактерии клебсиелл пневмонии.

Известен препарат пиобактериофага комбинированного, включающий бактериофаги стафилококка, стрептококка, синегнойной палочки, кишечной палочки и протея. Способ получения пиобактериофага предусматривает раздельное статическое культивирование бактериофагов в жидкой питательной среде в бутылях с использованием одномоментного добавления в питательную среду бактериальных клеток до концентрации 3107 в 1 мл, находящихся в стадии отмирания (18-часовая культура) и маточного фага в количестве 0,2% от объема среды, без учета множественности заражения и урожайности бактериофагов с последующей стерилизующей микрофильтрацией в тупиковом режиме через керамические фильтры (свечи Шамберлана).

Недостатками известного способа являются: низкий выход биомассы бактериофагов при их культивировании, обусловленный фазой развития (фаза отмирания) бактериальной популяции, использующейся для размножения фагов, а также неоптимизированными условиями культивирования; нетехнологичность, связанная с использованием для стерилизующей микрофильтрации тупикового режима, керамических фильтров, обладающих низкой производительностью в связи с фильтрацией в тупиковом режиме; нетехнологичность способа, обусловленная получением фагов в бутылях и невозможность получения препарата в больших объемах; реактогенность препарата, связанная с присутствием в составе препарата белков питательной среды и метаболитов бактериальных клеток, образующихся в процессе роста бактериальной популяции, а также при фаголизисе; недостаточно широкий спектр действия препарата, связанный с отсутствием в составе препарата бактериофагов клебсиелл пневмонии; длительность технологического цикла более 30 ч.

Целью изобретения является разработка нового способа получения пиобактериофага и расширение спектра действия препарата.

Для этого в состав препарата, содержащего бактериофаги стафиликокка, стрептококка, синегнойной палочки, кишечной палочки и протея, дополнительно вводят бактериофаги клебсиелл, получение бактериофагов проводят с использованием экспоненциально размножающейся бактериальной популяции в жидкой питательной среде с последующей очисткой препарата путем микро- и ультрафильтрации в режиме тангенциального потока. Микрофильтрацию проводят на мембранах с размером пор 0,2 мкм, а ультрафильтрацию на мембранах с порогом задержания веществ 150-200 КД. После очистки проводят стерилизующую микрофильтрацию.

Сравнение существенных признаков предлагаемого технического решения и прототипа показывает, что общим для них является процесс культивирования в жидкой питательной среде для получения биомассы фагов стафилококка, стрептококка, синегнойной, кишечной палочки и протея, а также процесс заключительной стерилизующей микрофильтрации фаголизатов для удаления бактериальных клеток.

Отличительными существенными признаками предлагаемого способа являются: введение в состав препарата бактериофагов клебсиелл пневмонии, позволяющее на 752% расширить спектр литической активности препарата в отношении бактерий клебсиелл пневмонии и расширить показания к его применению (в прототипе компонент бактериофагов клебсиелл пневмонии отсутствует); использование вместо статического культивирования на бактериальных клетках в стадии отмирания без учета урожайности фагов и множественности заражения (прототип) периодического динамического управляемого культивирования на экспоненциально размножающейся бактериальной популяции, позволяющего повысить на 50-90% выход биомассы фагов; очистка препарата микрофильтрацией через мембраны с размером пор 0,2 мкм и ультрафильтрацией в режиме тангенциального потока на плоских мембранах УПМП с порогом задержания веществ 150-200 КД для очистки препарата фагов от метаболитов бактерий и белков питательной среды и снижения реактогенности и токсичности препарата при полостном введении. Степень очистки в сравнении с прототипом 981,1%
В литературе описан способ получения бактериофагов энтеробактерий (авт. св. N 1058283), предусматривающий периодическое динамическое культивирование на экспоненциально размножающейся бактериальной популяции.

Однако использование экспоненциально размножающейся бактериальной популяции для получения стафилококкового, стрептококкового, синегнойного бактериофагов в литературе не описано.

Описанный в литературе способ очистки бактериофагов (авт. св. NN 1412302) включает в себя четыре этапа: микрофильтрацию, которая проводится в тупиковом режиме в три этапа (на фильтр-картоне, на целлюлозных мембранах с размером пор 0,5-0,7 мкм, затем на целлюлозных мембранах с размером пор 0,2 мкм) и четвертый этап очистка фаголизатов методом ультрафильтрации в режиме тангенциального потока через полые волокна с порогом задержания веществ 100 КД. Предлагаемый способ включает двухэтапную очистку: микрофильтрацию в режиме тангенциального потока на капроновых мембранах с размером пор 0,2 мкм и очистку ультрафильтрацией в режиме тангенциального потока на плоских мембранах с размером пор 150-200 КД. Предлагаемый способ микрофильтрации на капроновых мембранах более технологичен, производителен и выдерживает 50-70 циклов в отличие от одноразовых целлюлозных мембран и фильтр-картона. Плоские мембраны для ультрафильтрации имеют размер пор 150-200 КД, они более производительны, чем модули с полыми волокнами, вследствие большей скорости потока на плоскорамных установках, определяемой диаметром просвета волокна (полые волокна) и высотой камеры (плоскорамная установка). Использование полых волокон не позволяет в отличие от плоских мембран удалять из фаголизатов вещества, в том числе и фракции эндотоксина, образующиеся при фаголизисе, с молекулярной массой более 100 КД. Очистка на полых волокнах фаголизатов, полученных на таких средах, как мясопептонный бульон и бульон Мартена, содержащих высокомолекулярные фракции белков и пептидов, практически невозможна вследствие образования слоя белка на внутренней поверхности волокон и замедления фильтрации из-за белок-белковых взаимодействий. На плоскорамных установках фаголизаты, полученные на мясопептонном бульоне и бульоне Мартена, фильтруются также хорошо, как и фаголизаты, не содержащие высокомолекулярных белков и пептидов питательных сред.

Проведенный анализ свидетельствует, что предлагаемая совокупность существенных признаков является новой, а влияние отличительных от прототипа существенных признаков на достижение технического результата не следует из известного уровня техники, т.е. предлагаемый способ соответствует критериям "новизна" и"изобретательский уровень".

П р и м е р 1. Способ получения пиобактериофага.

Способ культивирования бактериофагов, входящих в состав препарата пиобактериофага, является общим для всех. Культивирование бактериофагов проводят на бульоне Мартена, Хоттингера, мясопептонном бульоне или бульоне на основе ферментативного гемогидролизата. Культивирование проводят в ферментерах в условиях интенсивной аэрации и перемешивания при 30-70%-ном насыщении растворенным кислородом с использованием экспоненциально размножающейся бактериальной популяции. Каждый вид бактериофагов культивируют раздельно. Для этого в питательную среду вносят бактериальную культуру до конечной концентрации 5107 бакт. кл/мл и выращивают при 37оС в условиях 30-70%-ного насыщения кислородом в течение 1,0-1,5 ч до концентрации 2-5108 бакт. кл/мл, после чего заражают бактериофагом с множественностью заражения 1/30 и культивируют в том же режиме в течение 1-2 ч до полного лизиса бактериальной популяции, после чего все бактериофаги сводят в единый объем, перемешивают и фильтруют в режиме тангенциального потока через фильтры с размером пор 0,2 мкм. Время фильтрации 100 л препарата составляет 10 мин. Отфильтрованный фаголизат очищают путем фильтрации через плоскорамный аппарат УФР-4М в режиме тангенциального потока через мембраны с порогом задержания веществ 150-200 КД. Степень очистки бактериофагов от метаболитов бактериальных клеток составляет 981,1 Затем очищенный препарат пиобактериофага фильтруют через стерильные фильтры типа "Владипор" с размером пор 0,2 мкм, после чего стерильно разливают в ампулы и флаконы и используют для лечения.

Как видно из табл. 1, использование предлагаемого способа позволяет:
повысить на 50-90% выход биомассы фагов при клуьтивировании и сократить время культивирования в среднем на 21 ч (Р<0,05, Р<0,001);
1,1%
повысить производительность и сократить время стерилизующей микрофильтрации в среднем на 6 ч;
сократить время технологического цикла в среднем на 25 ч (Р<0,001)

Препарат очищенного бактериофага, полученный предлагаемым способом, обладает активностью в отношении бактерий клебсиелл пневмонии 752% (табл. 2). Как видно из табл. 2, пиобактериофаг, полученный предлагаемым способом, в сравнении с прототипом был очищен от метаболитов бактериальных клеток и белков питательной среды. Степень очистки по белку составляет 981,1%
Препарат очищенного пиобактериофага в отличие от прототипа не обладал токсическими свойствами при внутрибрюшинном введении препарата белым мышам в дозе, в 3500 раз превышающей максимальную разовую для человека в пересчете на ед. массы тела. Гибели животных, падения массы тела и патологических изменений внутренних органов не обнаружено.

Кроме того, препарат очищенного пиобактериофага в отличие от прототипа не обладал токсическими свойствами при внутрибрюшинном введении в течение 21 дн в терапевтических дозах в расчете на ед. массы тела (хроническая токсичность). Препарат обладал антибактериальной активностью в отношении бактерий стафилококка в титре 105-106 по Аппельману, в титре 106-107 в отношении бактерий стрептококка. Активность компонентов бактериофагов кишечной и синегнойной палочек, протея также находилась в пределах 105-106 по Аппельману (табл. 2). В отличие от прототипа препарат очищенного пиобактериофага обладал антибактериальной активностью в отношении бактерий клебсиелл пневмонии в титре 105-107.

Таким образом, использование предлагаемого способа получения препарата пиобактериофага позволяет расширить на 752% спектр антибактериальной активности в отношении бактерий клебсиелл пневмонии, а также позволяет повысить качество за счет снижения токсических свойств препарата при полостном внутрибрюшинном введении за счет удаления в процессе очистки 981,1% из состава препарата метаболитов бактериальных клеток и белков культуральной среды.

Кроме того, использование предлагаемого способа позволяет повысить выход на 50-90% биомассы бактериофагов при их культивировании, сократить время культивирования в среднем на 21 ч, повысить производительность и сократить время технологического цикла фильтрации в среднем на 25 ч и вести крупномасштабное производство.

Внедрение препарата очищенного пиобактериофага позволит дать практическому здравоохранению эффективный антибактериальный препарат, превосходящий по своей активности как антибиотики широкого спектра действия, так и антибиотики резерва, отличительным признаком которого в отличие от антибиотиков является отсутствие токсичности.


Формула изобретения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПИОБАКТЕРИОФАГА, включающий культивирование бактерий и бактериофагов стафилококка, стрептококка, синегнойной палочки, кишечной палочки и протея в жидкой питательной среде с последующим сведением в один объем и стерилизующей микрофильтрацией, отличающийся тем, что дополнительно проводят культивирование бактерий и бактериофагов клебсиелл, для получения фаголизатов используют бактерии-продуценты в экспоненциальной фазе роста, микрофильтрацию проводят через мембраны с размером пор 0,2 мкм, после чего проводят ультрафильтрацию через мембраны с порогом задержания веществ 150 - 200 КД в режиме тангенциального потока.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу пот лучения ферментов с помощью микромицетов - грибов рода Aspergillus

Изобретение относится к микробиологии , а именно к способам окрашивания спор бактерий

Изобретение относится к микробиологической промьшшенности и может быть использовано для количественного определения жизнеспособных спор микроорганизмов в различных препаратах , в частности энтомопатогенных

Изобретение относится к технологии производства медицинских иммунобиологических препаратов, в частности, к способам концентрирования споровых культур в производстве сибиреязвенных вакцинных препаратов, обеспечивающее стабильность их биологических свойств с сохранением иммуногенности, и может быть использовано в практике производства сибиреязвенных вакцинных препаратов

Изобретение относится к области микробиологии

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению биотрансплантатов, и может быть использовано в медицине
Изобретение относится к области микробиологии, в частности к биотехнологии вакцинных препаратов, и может быть использовано при изготовлении вакцины против сибирской язвы

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности защите растений

Изобретение относится к медицине и биотехнологии, в частности к способу приготовления живых препаратов микроскопических грибов для световой микроскопии рода Coccidioides, и может быть использовано для идентификации, установления специфики строения и развития клеток в различных физиологических состояниях. Способ предусматривает выращивание культуры микроскопических грибов на плотной питательной среде. Из выращенной культуры микроскопических грибов готовят стандартную взвесь, содержащую 104 КОЕ/мл. Взвесь в количестве 0,5 мл засевают в 4,5 мл расплавленной и охлажденной до 45°C агаровой питательной среды. Перемешивают, выливают в чашку Петри с образованием засеянной пластинки агаровой питательной среды. Засеянную агаровую пластинку разрезают на блоки с заданным размером, которые помещают на предметное стекло и накрывают покровным стеклом с формированием агаровой камеры - получением препарата. Полученный препарат инкубируют во влажной камере при температуре 28°C в течение 3-х недель. Изобретение позволяет упростить методику приготовления препаратов и расширить область использования получаемых препаратов. 6 ил., 2 пр.

Изобретение относится к биотехнологии, молекулярной биологии и генетике и представляет собой способ генотипирования полиморфизма rs2551715 гена глутатионредуктазы (GSR) человека. Способ заключается в генотипировании полиморфизма методом полимеразной цепной реакции и методом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов с использованием специально подобранной пары праймеров F: 5′-GGAAGAAGCAATGAAATTTGATC-3′ и R: 5′-CCGAAACATTTGTGAATCTCC-3′ и эндонуклеазы BssT1I для дифференцировки аллелей С и Т. После амплификации с указанной парой праймеров продукт ПЦР размером 138 п.н. подвергают гидролизу. Продукты гидролиза фракционируют в 3% агарозном геле, окрашенном этидиум бромидом и визуализируют на трансиллюминаторе в проходящем УФ-свете. ДНК фрагменты размером 114 и 24 п.н. верифицируют как гомозиготный генотип дикого типа СС, фрагмент размером 138 п.н. - как гомозиготный мутантный генотип ТТ, а фрагменты 138, 114 и 24 п.н. - как гетерозиготный генотип СТ. Настоящее изобретение позволяет упростить способ генотипирования полиморфизма rs2551715 гена GSR. 1 ил.
Изобретение относится к технологии производства хлебного кваса. Способ включает подготовку рецептурных компонентов, экстрагирование яблочной выжимки жидкой двуокисью углерода с отделением соответствующей мисцеллы, резку тописолнечника, его сушку в поле СВЧ до остаточной влажности около 20% при мощности поля СВЧ, обеспечивающей разогрев тописолнечника до температуры внутри кусочков 80-90°C, в течение не менее 1 часа, обжаривание, пропитку отделенной мисцеллой с одновременным повышением давления, сброс давления до атмосферного с одновременным замораживанием тописолнечника, дробление и затирание совместно с квасными хлебцами и горячей водой и трехкратное настаивание с отделением жидкой фазы от гущи с получением квасного сусла, добавление к нему 25% рецептурного количества сахара в виде белого сиропа, сбраживание комбинированной закваской квасных дрожжей рас М и С-2 и молочнокислых бактерий рас 11 и 13, купажирование с оставшейся частью сахара в виде белого сиропа и розлив. Изобретение позволяет сократить длительность технологического процесса и повысить стойкость пены целевого продукта.
Наверх