Способ получения вещества из кожи свиньи, влияющего на пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов человека

 

Изобретение относится к медицине, в частности к фармацевтической промышленности, и может найти применение при получении препаратов для лечения заболеваний кожи. Сущность изобретения: кожу свиньи измельчают, готогенизируют в растворе хлористого натрия, центрифугируют, подвергают термоденатурации при 75 - 85°С в течение 10 - 20 мин, центрифугируют при 5000 - 15000 g в течение 10 - 30 мин, обрабатывают охлажденным до - 20°С (или ниже) ацетоном в соотношении (1 : 6) - (1 : 8), высушивают при комнатной температуре, растворяют в 0,005 - 0,015 М растворе трис - HCl + 0,15 M Na Cl, pH 6,0 - 8,0, хроматографируют на колонке с сефадексом G - 50, собирают фракцию с мол.м. от 1400 до 15000 Д, обессоливают и лиофилизируют. По сравнению с известными предлагаемый способ позволяет существенно упростить технологию и ускорить способ получения вещества в 2, 4 раза. Вещество, выделенное предлагаемым способом, ингибирует пролиферацию кератиноцитов человека и способствует завершению их дифференцировки. 2 табл.

Изобретение относится к медицине, в частности к фармацевтической промышленности, и может найти применение при получении препаратов для лечения заболеваний кожи.

Известен способ получения вещества из кожи свиньи путем ее лиофилизации, экстракции лиофилизата водой, преципитации препарата этанолом, экстракции неактивного материала н-бутанолом, ацетоном, этилацетатом, хлороформом и смесью хлороформ метанол (1:1), экстракции активного материала смесью хлороформ метанол вода (5:5:1), хроматографии на колонке с сефакрилом 300 в растворе PBS с 0,2%-ным тритоном Х-100 и диализом против воды. Однако процесс получения вещества довольно сложен и занимает много времени, приходится работать с токсическими растворителями.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ получения пентапептида из кожи мышей, ингибирующего пролиферацию и стимулирующего дифференцировку кератиноцитов мыши и человека, путем измельчения кожи в растворе хлористого натрия, получения водно-солевого экстракта, центрифугирования, лиофилизации, обработки уксусной кислотой, хроматографии на колонке с сефадексом G-25, хроматографии на колонке с обращенной фазой, катионно-обменной и анионо-обменной хроматографии, высокоэффективной жидкостной хроматографии и лиофилизации. Однако этот способ достаточно сложен, громоздок и занимает много времени.

Цель изобретения упрощение технологии и сокращения времени получения вещества, влияющего на пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов. Для этого кожу свиньи измельчают, гомогенизируют в растворе хлористого натрия, центрифугируют, подвергают термоденатурации при 75-85^оС в течение 10-20 мин, центрифугируют при 5000-15000 g в течение 10-30 мин, обрабатывают охлажденным до -20^о (или ниже) ацетоном в соотношении 1:6 1:8, высушивают при комнатной температуре, растворяют в 0,005-0,015 М растворе трис-НСl + 0,15 М NaCl, рН 6,0-8,0; хроматографируют на колонке с сефадексом G-50, собирают фракцию с молекулярной массой от 1400 до 15000 Д, обессоливают и лиофилизируют.

Температура термоденатурации (75-85^оС) и время термоденатурации подобраны таким образом, что нужное вещество остается в растворе, в то время как часть неактивного материала денатурируется. Центрифугирование при 5000-15000 g в течение 10-30 мин подобрано так, что в течение этого времени денатурированные белки удаляются. При центрифугировании ниже 5000 g и менее 30 мин часть денатурированного неактивного материала остается в супернатанте, что загрязняет препарат. Увеличивать скорость центрифугирования более 15000 g и время более 10 мин не имеет смысла, так как при этих условиях денатурированный материал полностью осаждается. Применение ацетона с температурой выше -20^оС приводит к денатурации активного материала. Снижение соотношения супернатант ацетон ниже 1:6 приводит к потере активного вещества. Увеличение соотношения выше 1:8 приводит к агрегации и выпадению в осадок неактивного материала. Выбор концентрации буфера (0,005-0,015 М) и его рН (6,0-8,0) обусловлен тем, что в нем не происходит потери активности получаемого вещества, в то же время препарат хорошо разделяется по молекулярным массам на сефадексе G-50. Хлористый натрий до концентрации 0,15М добавляется к буферу для того, чтобы можно было определять активность вещества в пробах сразу после разделения на сефадексе.

В табл. 1 представлено сравнение двух способов выделения: известного и предлагаемого. Как видно из этих данных, известный способ включает 18 стадий, в то время как предлагаемый лишь 10 стадий. Если сравнить время выделения, то по известному способу требуется 8,5 суток, в то время как по предлагаемому лишь 3,5.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет существенно упростить технологию и сократить время получения вещества в 2,4 раза. П р и м е р 1 (известный способ). 10 г кожи (используют кожу мыши) измельчают ножницами, гомогенизируют в 50 мл физиологического раствора, соотношение вес ткани: объем физ. раствора 1:5. Гомогенат центрифугируют при 1500 g в течение 30 мин при +5^оС. Супернатант лиофильно высушивают и обрабатывают 1М раствором уксусной кислоты в течение 2 ч при +4^оС. Затем 15 мл раствора наносят на колонку с сефадексом G-25, уравновешенную 0,5М раствором уксусной кислоты. Низкомолекулярный материал собирают и наносят на колонку с обращенной фазой С-18 (Bondapak C18) Porasil B37-75 mu<N>), затем на колонку с катионообменником Dowex 50 в Н⁺ форме. Фракции, элюирующиеся 0,2 М муравьиной кислотой, собирают и подвергают анионообменной хроматографии на колонке с Dowex 1. Фракцию, не связавшуюся с колонкой, собирают, лиофилизируют и хроматографируют на колонке с Fractogel MG-2000. Собирают низкомолекулярную фракцию и разделяют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на Partisil М-9, активную фракцию подвергают рехроматографии на той же колонке. Получают пентапептид, ингибирующий пролифеpацию и способствующий завершению дифференцировки кератиноцитов мыши и человека.

П р и м е р 2 (предлагаемое изобретение). Свиную кожу измельчают ножницами, гомогенизируют в физиологическом растворе. На 50 г кожи берут 650 мл физиологического раствора (соотношение вес ткани объем физ. раствора 1:13). Гомогенат центрифугируют при 2500 g в течение 30 мин при +4^оС. Осадок отбрасывают, супернатант в объеме 630 мл подвергают термоденатурации при 75^оС в течение 20 мин на водяной бане при постоянном перемешивании, смесь охлаждают в ледяной бане до +4^оС. Денатурированный материал осаждают центрифугированием при 10000 g в течение 20 мин при +4^оС. Супернатант в объеме 620 мл прикапывают к 4 л ацетона, охлажденного до -20^оС. Выпавший осадок отмывают охлажденным ацетоном и высушивают под тягой при комнатной температуре. В результате получают 800 г ацетонового порошка (800 ± 50 мг). Порошок растворяют в 30 мл 0,01М трис-HCl буфера + 0,15М NaCl, рН 8,0 в течение 1 ч при комнатной температуре. Нерастворимую часть удаляют центрифугированием при 500 g в течение 10 мин при +4^оС. Супернатант хроматографируют на колонке с сефадексом G-50 (2,5х80 см), уравновешенной тем же буфером. Собирают фракцию с молекулярной массой от 1400 до 15000 Д и лиофилизируют. Затем растворяют в 20 мл дистиллированной воды и обессоливают на колонке с сефадексом G-15. Собирают фракцию, выходящую в свободном объеме, и лиофилизируют. Получают вещество, ингибирующее пролиферацию и способствующее завершению дифференцировки кератиноцитов человека. Фракции с молекулярными массами более 15000 Д и менее 1400 Д не обладали подобными свойствами.

Данные о влиянии полученного вещества на пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов человека представлены в табл.2. Выделение и культивирование кератиноцитов проводили по методу Рейнвальда и Грина. Уровень клеточной пролиферации оценивали, определяя количество выросших за 14 дней клеток. Дифференцировку кератиноцитов оценивали по их способности образовывать роговые оболочки. Выделенное вещество использовали в концентрации 100 мкг/мл.

Как видно из данных, представленных в табл.2, выделенное вещество в концентрации 100 мкг/мл ингибирует пролиферацию кератиноцитов человека и способствует завершению их дифференцировки. Использование вещества в концентрации 10 и 1 мкг/мл не выявило влияния на пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов человека.

Формула изобретения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВЕЩЕСТВА ИЗ КОЖИ СВИНЬИ, ВЛИЯЮЩЕГО НА ПРОЛИФЕРАЦИЮ И ДИФФЕРЕНЦИРОВКУ КЕРАТИНОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА, путем гомогенизации кожи в растворе хлористого натрия, центрифугирования, обессоливания и лиофилизации, отличающийся тем, что, с целью упрощения технологии и ускорения способа получения, супернатант гомогената после центрифугирования подвергают термоденатурации при 75 85^oС в течение 10 20 мин, центрифугируют при 5000 15000 g в течение 10 30 мин, обрабатывают охлажденным до 20^oС и ниже ацетоном в соотношении (1 6) (1 8), высушивают при комнатной температуре, растворяют в 0,005 0,015 М растворе трис ≃ HCl + 0,15 М NaCl,pH 6,0 8,0, хроматографируют на колонке с сефадексом Gt-50, собирают фракцию с мол. м. 1400 15000 Д.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2