Способ изготовления инактивированной вакцины против вирусной геморрагической болезни кроликов

 

Использование: биотехнология, ветеринария. Сущность изобретения: используют 20 25%-ную суспензию печени кроликов, павших после заражения вирулентным вирусом геморрагической болезни на забуференном физрастворе (рН 7,2 7,4). Инактивацию вирусного сырья проводят 1,8,3,6-диэндометилен-1,3,6,8-тетраазотрициклодеканом (А-24) из расчета 1 г препарата на 1000 мл сырья. Для очищения сырья от клеточного детрита применяют хлороформ из расчета 1 ч. на 5 ч. вируссодержащей суспенизии. Стабилизацию сырья осуществляют 5%-ной смесью лактозы и пептона в буферном растворе (рН 7,2 7,4), взятых в равном соотношении и смешанных с инактивированной суспензией печени (в частях) 1 2. Лиофилизацию проводят после замораживания при минус 45 минус 50°С в течение 10 12 ч, выдерживают материал от минус 45 до 0°С в течение 22 24 ч при вакууме 11,0 15,0 Па, доводят температуру до 18 20°С в течение 3 4 ч и досушивают в течение 2 3 ч. 3 табл.

Изобретение относится к способу изготовления инактивированной вакцины против вирусной геморрагической болезни кроликов (ВГБК), и может быть использовано в научных и производственных лабораториях, занимающихся конструированием биопрепаратов, а также на предприятиях биологической промышленности.

Известны способы изготовления вакцины против геморрагической болезни кроликов (Гу Чжэньдэ, Ван Сисюнь, Ли Цицзу, Кун Фаньфан, Чжунью Шоуи цзачжи. 1986, т.12, N 12; авт.св. ЧССР, N 8808644, 1988).

Вакцина готовится из вируса, выделенного в Китае в 1984 году от кроликов. В качестве вирусного сырья используют смесь органов печень, легкие, селезенка, почки, из которых готовят 10%-ную суспензию на соляном растворе, инактивируют 0,8% раствора формалина при 37^оС в течение 24 ч. После этого к суспензии добавляют масло в соотношении (3:1), затем консервант глицерин (1: 9) и наполнитель стеариновокислый алюминий и вакцину применяют для профилактики заболевания. Вакцину вводят подкожно и внутримышечно в дозе 0,5-1 мл. Иммунитет формируется на 7 сут, продолжительностью 6 месяцев. Вакцина сохраняет иммунобиологические свойства при хранении при температуре 2-8^оС в течение 8 мес. при температуре 10-20^оС 6 мес. После прививки у животных возникают осложнения.

Известен также способ изготовления тканевой гидроокисьалюминиевой формолвакцины против ВГБК.

В качестве вирусного сырья используют 2,5-12%-ную суспензию печени кроликов, павших от вируса ГБК. Суспензию готовят на забуференном физиологическом растворе (рН 7,2-7,4) с антибиотиками (пенициллин и стрептомицин по 200 ед/мл) и мертиолятом (1:100000). Вирус экстрагируют при 22-24^оС в течение 1-3 ч. Осаждают клеточный детрит путем центрифугирования при 1500 об/мин в течение 10 мин или сепарированием, общее количество белка не более 20 мг/мл. Вирусную суспензию инактивируют 0,1-0,14% -ным формальдегидом при 27-28^оС в течение 3-4 сут. Остаточный формальдегид нейтрализуют метабисульфитом натрия и добавляют 10-15% геля гидроокиси алюминия (Временная инструкция по изготовлению и контролю тканевой формолвакцины гидроокисьюалюминиевой против вирусной геморрагической болезни кроликов, утвержденная ГУВ СССР 05 июля 1990 г). Такая вакцина сохраняет свои антигенные свойства в течение 12 мес. Иммунитет формируется на 3 сут. после однократного внутримышечного введения вакцины в дозе 0,5 мл продолжительностью 7 мес. Однако после иммунизации у животных отмечаются поствакцинальные осложнения.

Предлагаемый способ изготовления устраняет перечисленные недостатки.

Задача изготовление ареактогенной инактивированной вакцины против ВГБК, обладающей стабильными свойствами в процессе длительного хранения.

Сущность предлагаемого способа заключается в том, что используется 20-25%-ная суспензия печени на забуференном растворе (рН 7,2-7,4).

Инактивацию вирусного сырья проводят 1,8,3,6-диэндометилен-1,3,6,8-тетраазотрициклодеканом (А-24) из расчета 1 г препарата на 1000 мл сырья.

Применяют хлороформ из расчета 1 ч. на 5 ч. сырья для очищения сырья от клеточного детрита.

Стабилизацию сырья осуществляют 5%-ной смесью лактозы и пептона на буферном растворе (рН 7,2-7,4), взятых в соотношении 1:1 и смешанных с сырьем 1:2.

Лиофилизацию проводят после замораживания при минус 45 50^оС в течение 10-12 ч, выдерживают материал от минус 45^о до 0^оС в течение 22-24 ч при вакууме 11,0-15,0 Па (80-100 мкм), доводят температуру до 18-20^оС в течение 3-4 ч и досушивают 2-3 ч.

Способ осуществляют следующим образом.

Для изготовления вакцины против ВГБК берут кроликов массой 3,0 кг, заражают внутримышечно вирусом ГБК (регистрационный N 1652 в коллекции ВГНКИ) с инфекционной активностью 10^3,0 ЛД 50/мл. Спустя 24-48 ч от павших кроликов отбирают печень, замораживают, пропускают через мясорубку, фарш размалывают на коллоидной мельнице при зазоре ножей 0,00-0,1 мм. Полученное вирусное сырье доводят физраствором (рН 7,2) до 20% суспензии, выдерживают при 20^оС в течение 3 ч, освобождение от клеточного детрита проводят центрифугированием (общее количество белка не более 5 мг/мл) в течение 20 мин. Надосадок сливают в реактор и инактивируют 1, 8, 3, 6-диэндометилен-1, 3, 6, 8-тетраазатрициклодеканом из расчета 1 г вещества на 1000 мл вирусного сырья. Инактивацию проводят при температуре 27^оС в течение 48 ч при периодическом перемешивании. Затем сырье осветляют и освобождают от клеточного детрита. Для этого добавляют 1 ч хлороформа на 5 ч. сырья, выдерживают 10 ч при температуре 20^оС. Для сохранения нативных свойств в качестве стабилизирующей защитной среды используют стабилизатор, который включает лактозу ТУ 6-09-2293-75 50,0 г. пептон сухой ферментативный ГОСТ 13805-76 50,0 г, калий фосфорнокислый однозамещенный ГОСТ 4198-75 1,0 г, калий фосфорнокислый двузамещенный ГОСТ 2493-65-5,2 г, на 1 л дистиллированной воды рН 7,2 ГОСТ 6709-72.

Затем 1 ч. стабилизатора смешивают с 2 ч. инактивированного материала, тщательно смешивают и фасуют при помощи дозатора (АГ-5) в стерильные флаконы или ампулы по 2,0 мл и проводят лиофилизацию при вакууме 80 мкм. Для этого замораживают материал при минус 45^оС в течение 10 ч, выдерживают при температуре от минус 45 до 0^оС в течение 22 ч. Затем доводят температуру до 20^оС в течение 3 ч и досушивают 3 ч. Весь цикл лиофилизации составляет 28 ч. Укупорка флаконов или запайка ампул проводится под вакуумом.

Инактивированная тканевая вакцина против ВГБК, лиофилизированная со стабилизатором, не вызывает поствакцинальных осложнений. Иммунитет формируется через 2 сут при введении 0,5 мл материала продолжительностью 12 месяцев. Вакцина стабильно сохраняет физические и иммунобиологические свойства в процессе хранения в течение 24 месяцев при температуре 4^оС.

В табл. 1 приведены физические и иммунобиологические свойства вакцины против ВГБК, лиофилизированной со стабилизатором после хранения в течение 24 мес. при 4^оС.

Из табл.1 видно, что вакцина, лиофилизированная с защитной стабилизирующей средой, стабильно сохраняет иммунобилогические свойства в процессе длительного хранения (защита 100%).

Применение инактиватора 1,8,3,6-диэкдометилен-1,3,6,8-тетраазатрициклодекана обеспечивает безопасность работ с вирусным сырьем в процессе изготовления.

Сравнительная оценка эффективности режимов лиофилизации вакцин представлена в табл.2, сравнительная характеристика вакцин против ВГБК в табл.3.

Из табл. 2 видно, что вакцина, лиофилизированная по предложенному режиму в течение 28 ч, не изменяет иммунобиоло- гические свойства в процессе лиофилизации.

Таким образом, предлагаемая концентрация сырья, освобождение от клеточного детрита центрифугированием при 3000 об/мин, использование инактиватора А-24 позволяют полностью инактивировать вирус. Осветление и стабилизация хлороформом, лиофилизация препарата по предложенному режиму со стабилизирующей защитной средой все это обеспечивает стабильность и стандартность вакцины при длительном хранении.

Предложенный способ прост в исполнении, доступен и является промышленно применимым.

Формула изобретения

СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ИНАКТИВИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ВИРУСНОЙ ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ КРОЛИКОВ, включающий приготовление суспензии печени кроликов, павших после заражения вирулентным вирусом геморрагической болезни, и ее инактивацию, отличающийся тем, что суспензию готовят 20 25%-ной концентрации, инактивацию проводят 1,8,3,6-диэндометилен-1,3,6,8-тетраазатрициклодеканом в концентрации 1г на 1000 мл суспензии печени при 27^oС в течение 48 ч, после чего стабилизируют и осветляют хлороформом в соотношении 1 часть хлороформа к 5 частям суспензии в течение 10 ч, добавляют защитную среду, состоящую из 5% ной смеси лактозы и пептона в равных частях в буферном растворе с pH 7,2 7,4 в соотношении 1 часть защитной среды к 2 частям инактивированной суспензии, замораживают при 45 50^oС в течение 10 ч лиофилизируют при вакууме 11,0 15,0 Па, выдерживают при температуре 45 0^oС в течение 22-24 ч, доводят температуру до 18 20^oС в течение 3 4 ч и досушивают в течение 2 3 ч.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3