Способ получения андроста-1,4-диен-3,17-диона

 

Использование: биотехнология, медицинская промышленность. Сущность изобретения: андроста-1,4-диен-3,17-дион (АДД) получают путем трансформации стеринов растительного или животного происхождения с помощью бактерий рода Mycobacterium в присутствии водорастворимых химических производных бета-цикло-декстринов. Способ позволяет повысить эффективность процесса получения АДД, сократить продолжительность процесса, повысить выход АДД при высоких нагрузках субстратов и повышении степени их превращения. Кроме того, способ облегчает выделение и анализ целевого продукта, обеспечивает возможность масштабирования процесса.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в фармацевтической, микробиологической и химической промышленности при получении полупродуктов для синтеза стероидных лекарственных препаратов.

Стероидные препараты широко применяются в медицинской практике в качестве гормональных, противовоспалительных, антиаллергических, анаболических, контрацептивных, противораковых и других лекарственных средств. Осуществление микробиологическим путем получения андроста-1,4-диен-3,17-диона (АДД) из стеринов растительного или животного происхождения обеспечивает сырьевую базу для синтеза большого количества эстрогенов и анаболических стероидов [1] Деградацию боковой цепи стеринов способны вести многие нокардиоподобные бактерии (Rhodococcus, Nocardia, Corynebacterium, Arthrobacter), однако наиболее эффективная конверсия стеринов до С-17-кетостероидов (С-19-стероидов) описана для бактерий рода Mycobacterium.

Особенностью стеринов является их низкая растворимость в воде (1-3 мг/л), что осложняет их трансформацию. При осуществлении микробиологических превращений как субстрат, так и продукт, большей частью находятся в твердой фазе, при этом скорость растворения субстрата является фактором, лимитирующим большинство процессов конверсии стероидов.

Известны способы получения АДД и андрост-4-ен-3,17-дион (АД) путем микробиологической конверсии стеринов с использованием бактерий рода Mycobacterium, предусматривающие внесение субстрата в виде тонко измельченного порошка, гомогенного по размерам частиц (псевдокристаллоферментация), или в виде суспензии в воде (так называемое мокрое измельчение с поверхностно-активными веществами [2] Однако применение детергентов для повышения эффективности конверсии стеринов до андростанов в большинстве случаев связано с интенсивным пенообразованием, относительно низкими субстратными нагрузками и невысокой степенью превращения субстрата, обусловленными ингибированием процессов продуктами реакции.

В литературе описан способ получения смеси АДД и АД путем трансформации холестерина (1 г/л) бактериями Mycobacterium sp. АТСС 3683 В при использовании двухфазных систем несмешивающихся водорастворимых полимеров (например, полиэтиленгликоля с молекулярным весом выше 6000 и декстрана 500) с применением в качестве детергента Brij 35. Максимальный выход продуктов (сумма АДД и АД при их соотношении 1 1) составляет 80% от теоретического через 120 ч трансформации [3] При использовании в качестве субстрата ситостерина (2 г/л, тонкоизмельченный) максимальный выход при ведении процесса в двухфазной системе с оливковым и соевым маслом не превышает 52% от теоретически возможного [4] При этом интенсификация процесса достигается не только за счет увеличения растворимости стероидов, но и за счет уменьшения ингибирования процессов продуктами реакции.

Указанные способы имеют целый ряд недостатков (дорогостоящее специальное оборудование, повышенная трудоемкость, низкие нагрузки субстратов), затрудняющих их практическую реализацию, поэтому в настоящее время представляют лишь теоретический интерес.

Известен способ получения АДД путем микробиологической трансформации стеринов с 3-бета-окси-дельта-5 конфигурацией (ситостерина, ситостанола или их смесей) с помощью бактерий M. vaccae ZIMET 11094 или Mycobacterium spec. NRRL B-3683 в присутствии органических адсорбентов, например, смолы Wofatit EP 62 [5] При осуществлении этого способа субстрат вносят в виде гомогенной суспензии, приготовленной мокрым измельчением с детергентами. При этом достигнут относительно высокий выход АДД: 62,7 и 58,3% от теоретического соответственно при начальной концентрации субстрата 10 г/л и времени трансформации 72 ч.

Повышение эффективности процесса обусловлено устранением эффекта ингибирования продуктом, что достигается путем селективной сорбции продукта на органических смолах и выведения его тем самым из зоны реакции.

Однако осуществление этого метода требует специального технологического оборудования для предотвращения разрушения адсорбционной смолы в процессе ферментации, что значительно осложняет практическую реализацию и масштабирование процесса.

Известны способы получения стероидов, где для интенсификации микробиологической конверсии стеринов процесс осуществляют в присутствии циклодекстринов [6] которые, как предполагают, образуют комплексы включения с субстратами и продуктами реакции. Как известно, образование комплексов включения органических соединений с циклодекстринами может сопровождаться изменением агрегатного состояния, химической стабильности, увеличением смачиваемости, снижением токсичности, изменением спектральных характеристик и других характеристик исходного соединения [7] Наиболее близким к предлагаемому по совокупности существенных признаков и достигаемому эффекту является способ получения АДД в смеси с АД, предусматривающий микробиологическую трансформацию ситостерина, холестерина и холестенона в присутствии альфа, бета и гама -циклодекстринов бактериями Mycobacterium sp. NRRL 3683B. Максимальный эффект достигается в присутствии гамма-циклодестрина при его мольном соотношении к субстратам 2 1. При этом суммарный выход АДД и АД составляет 80 от теоретически возможного при сокращении времени трансформации от 180 ч (в контроле) до 120 ч и нагрузке субстратов (холестерина, холестенона и ситостерина 1 г/л [8] Однако эффективность микробиологической конверсии стеринов при использовании указанного метода ограничена низкими концентрациями субстрата, что, возможно, обусловлено относительно низкой растворимостью комплексов использованных циклодекстринов с субстратом и продуктами реакции. Кроме того, использование гамма-циклодекстрина для крупномасштабных производств неэкономично из-за его высокой стоимости. Использование бета-циклодекстрина является более экономичным, однако в этом случае наблюдается снижение выхода (суммарный выход АД и АДД составляет 63% от теоретического).

Другим недостатком метода является его низкая специфичность в отношении АДД (к сожалению, приведено только суммарное количество АДД и АД, и не указано их соотношение). Образование смеси продуктов затрудняет выделение АДД в чистом виде.

Задача, на решение которой направлено изобретение, заключается в интенсификации процесса микробиологической трансформации стеринов до АДД.

Технический результат, который может быть получен при осуществлении изобретения заключается в увеличении нагрузки субстрата, повышении степени его превращения, повышении выхода целевого продукта, сокращении длительности процесса.

Сущность способа заключается в том, что согласно способу получения АДД путем микробиологической трансформации стеринов растительного или животного происхождения с помощью бактерий рода Mycobacterium в присутствии циклодекстринов в качестве циклодекстринов используют водорастворимые производные бета-циклодекстрина.

В качестве производных могут быть использованы, например, алкиленгликолевые (этиленгликоль-, пропиленгликоль) или карбоксиалкильные производные бета-циклодекстрина (карбоксиметил- бета-циклодекстрин).

Этиленгликолевое и пропиленгликолевое производное бета-циклодекстрина получают при взаимодействии бета-циклодекстрина с оксидами этилена или пропилена в присутствии КОН [9] Карбоксиметил-бета-циклодекстрин получают по известному методу [7] Введение алкиленгликолевых или карбоксиалкильных заместителей в структуру бета-циклодекстрина приводит к изменению гидрофильных свойств комплекса, к повышению растворимости как самого циклодекстрина, так и, вероятно, его комплексов с субстратами и продуктами реакции. Возможно, что введение циклодекстринов в трансформационную среду определяет повышение скорости обменных процессов при осуществлении микробиологической трансформации стеринов до АДД и, соответственно, повышение выхода целевого продукта реакции (до 90-40% от теоретического) при высоких (5-20 г/л) нагрузках субстратов и сокращении времени микробиологической трансформации, облегчает анализ и выделение целевых продуктов за счет более легкого разрушения их комплексов с циклодекстринами. Кроме того, использованные замещенные циклодекстрины могут быть регенерированы и использованы при дальнейших трансформациях, что делает процесс еще более экономически выгодным.

Предлагаемый способ также может быть использован для получения других 1,2-дегидрированных С-19-стероидов.

Сведения об использовании химически модифицированных водорастворимых производных бета-циклодекстрина в процессах микробиологической трансформации стеринов до стероидов андростанового ряда в доступной литературе отсутствуют.

Анализ стероидов. Анализ продуктов трансформации проводят методами тонкослойной хроматографии (ТСХ) и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Для этого пробы культуральной жидкости заливают 2-5-кратным объемом этилацетата и проводят экстракцию стероидов. При анализе методом ТСХ аликвоты экстракта (5-20 мкл) наносят на пластинки "Силуфол UV 254" (15 х 15 см) или "Мерк" на расстоянии 15 мм от края. После нанесения пластинки помещают в хроматографическую камеру, содержащую смесь бензол: ацетон (объемное соотношение 3 1). После прохождения фронта растворителя пластинку вынимают, подсушивают на воздухе. Оценку содержания стероидов проводят путем сравнения хроматографической подвижности (Rf), площади пятна и интенсивности поглощения в ультрахемископе (Desaga) с образцами стандартов.

Для оценки содержания стеринов пластинку с нанесенными образцами после прохождения фронта растворителя подсушивают на воздухе, опрыскивают 10%-ным спиртовым раствором фосфорно-молибденовой кислоты до желто-зеленоватого окрашивания и нагревают до 50-60^оС до появления синих пятен.

Оценку содержания стероидов методом ВЭЖХ проводят с использованием установки фирмы ЛКБ (Швеция) и колонки типа Si 100 в системе гексан изопропиловый спирт (85 15) (объемн.) при скорости протока 1 мл/мин; детекция по поглощению при 243 нм.

При использовании технического ситостерина с общим содержанием стеринов 87,5% (содержание чистого ситостерина составляет 66,7%) расчет концентрации субстрата ведут с учетом общего содержания трансформируемых стеринов в техническом.

Выход продукта выражают в процентах от теоретически возможного, исходя из разницы молекулярных весов субстрата и продукта (100%-ный выход продукта из 1 М субстрата равен 1 М, т.е. в весовом выражении, 100% выход АДД из 415 г химически чистого ситостерина составляет 284 г).

Способ иллюстрируется примерами.

П р и м е р 1. Бактерии Mycobacterium sp. шт. 6 ИБФМ РАН культивируют на среде следующего состава, г/л: глицерин 10; дрожжевой экстракт 10; калий фосфорнокислый однозамещенный 0,5; аммоний фосфорнокислый двузамещенный 1,5; магний сернокислый, 7-водный 0,2; железо сернокислое, 7-водное 0,002; цинк сернокислый, 7-водный 0,002; дистиллированная вода, в колбах Эрленмейера объемом 750 мл, содержащих 100 мл среды, на качалке (220 об/мин) при 28-30^оС в течение 24-48 ч.

Трансформацию ситостерина проводят на среде следующего состава, г/л: глицерин 5; мочевина 0,25; аммоний сернокислый 3,0; калий фосфорнокислый двузамещенный 1,0; калий фосфорнокислый однозамещенный 4,0; магний сернокислый 0,2; дистиллированная вода, рН 6,5-7,2. Субстрат, полученный мокрым измельчением в дезинтеграторе типа ФУГ (время обработки 15 мин) (5 г/л) и этиленгликоль-бета-циклодекстрин вносят перед автоклавированием (0,5 атм; 30 мин). Мольное соотношение циклодекстрин субстрат составляет 2 1.

Трансформацию проводят в колбах Эрленмейера объемом 750 мл, содержащих 25-100 мл среды в аэрируемых условиях (220 об/мин) при 28-30^оС. При засеве используют 10 об. инокулята.

Выход АДД составляет через 66 ч трансформации 80% через 92 ч трансформации 84% степень превращения субстрата 95% П р и м е р 2. Способ осуществляют по примеру 1, но в трансформационную среду вместо этиленгликольциклодекстрина вносят пропиленгликольциклодекстрин.

Выход АДД через 74 ч трансформации составляет 75% через 96 ч 85% степень превращения субстрата 95% П р и м е р 3. Способ осуществляют по примеру 2, но используют культуру Mycobacterium vaccae ZIMET 11094.

Выход АДД через 120 ч трансформации составляет 83% степень превращения субстрата 94% П р и м е р 4. Способ осуществляют по примеру 2, но используют штамм Mycobacterium sp. NRRL B-3683.

Выход АДД через 72 ч трансформации составляет 47% степень превращения субстрата 79% П р и м е р 5. Способ осуществляют по примеру 2, но исходная концентрация ситостерина составляет 10 г/л, используют субстрат без предварительного измельчения.

Выход АДД через 10 ч трансформации составляет 75% степень превращения субстрата 95-100%
Для выделения целевого продукта клетки осаждают центрифугированием и супернатант (115 мл) пропускают через колонку с 20 г адсорбента XAD-2. Колонку промывают 80 мл воды, остатки воды отсасывают вакуумом. Через колонку пропускают 80 мл этилацетата, при этом с колонки вытесняется еще некоторое количество воды. Органическую фракцию отделяют на делительной воронке, сушат безводным сульфатом натрия и фильтруют. Дополнительное количество стероидов извлекают из водной фазы экстракцией равным объемом этилацетата, который используют для ополаскивания колбы и промывки основного экстракта. Объединенные этилацетатные растворы упаривают. Получают 0,57 г технического продукта, содержащего 62% химически чистого АДД. Таким образом, выход АДД после выделения составляет 45% от теоретически возможного.

Водную фазу используют для регенерации пропиленгликольциклодекстрина. Выход АДД при осуществлении способа с использованием регенерированного циклодекстрина не снижается.

П р и м е р 6. Способ осуществляют по примеру 5, но выделение целевого продукта осуществляют следующим образом: клетки осаждают центрифугированием (по данным ТСХ осадок не содержит стероидов). К супернатанту (130 мл) добавляют 50 мл этилацетата и перемешивают при комнатной температуре в течение 12 ч. Органическую фазу отделяют, водную фазу промывают 10 мл этилацетата. Объединенные этилацетатные вытяжки сушат безводным сульфатом натрия и упаривают. Полученный остаток (0,85 г) обрабатывают 5 мл ацетона и выдерживают в течение 1 ч при 0-6^оС. Раствор фильтруют и упаривают досуха. Получают 0,83 г технического продукта, содержащего 69% чистого АДД. Таким образом, общий выход АДД после выделения составляет 64% от теоретического.

П р и м е р 7. Способ осуществляют по примеру 1, но используют ситостерин без предварительного измельчения, а вместо этиленгликольциклодекстрина в трансформационную среду вводят карбоксиметилкислодекстрин.

Выход АДД через 144 ч трансформации составляет 84% степень превращения субстрата составляет 95%
П р и м е р 8. Способ осуществляют по примеру 7, но исходная концентрация ситостерина составляет 10 г/л.

Выход АДД через 178 ч трансформации составляет 58% степень превращения субстрата 90%
П р и м е р 9. Способ осуществляют по примеру 8, но используют ситостерин, предварительно дезинтегрированный как описано в примере 1.

Выход АДД через 164 ч трансформации составляет 68% степень превращения субстрата 94%
П р и м е р 10. Способ осуществляют как описано в примере 1, но в качестве субстрата используют холестерин (5 г/л) (фирмы "Серва", ФРГ, чистота 98% ) без предварительного измельчения.

Выход АДД через 74 ч трансформации составляет 65% через 164 ч 70% степень превращения субстрата 85%
П р и м е р 11. Способ осуществляют как описано в примере 1, но в качестве субстрата используют стигмастерин (5 г/л) (фирмы "Флюка", Швейцария, чистота 98%) без предварительного измельчения.

Выход АДД через 100 ч трансформации составляет 45% через 164 ч 55% степень превращения субстрата 65%
П р и м е р 12. Способ осуществляют по примеру 2, но используют субстрат без предварительного измельчения дезинтегрированием и пропиленгликольциклодекстрин вносят в мольном соотношении к субстрату 1 1.

Выход АДД через 96 ч трансформации составляет 82% степень превращения субстрата 95%
П р и м е р 13. Способ осуществляют по примеру 2, но используют 20 г/л субстрата.

Выход АДД через 140 ч трансформации составляет 60% степень превращения субстрата 82%
Таким образом, предлагаемое изобретение позволяет повысить эффективность процессов получения АДД, а именно интенсифицировать микробиологическую трансформацию стеринов растительного и животного происхождения и тем самым повысить выход АДД при высоких (5-20 г/л) нагрузках субстратов и повышении степени их превращения, а также при сокращении времени трансформации.

Кроме того, способ облегчает выделение и анализ целевых продуктов за счет снижения прочности комплексов циклодекстрина со стероидами по сравнению с прототипом, обеспечивает возможность масштабирования процессов без разработки специального ферментационного оборудования.

Формула изобретения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНДРОСТА-1,4-ДИЕН-3,17-ДИОНА путем микробиологической трансформации стеринов растительного или животного происхождения бактериями рода Mycobacterium в присутствии циклодекстринов, отличающийся тем, что в качестве циклодекстринов используют водорастворимые химические производные бетациклодекстринов.