Пептид апов-рецептора, ответственный за связывание липопротеинов низкой плотности

 

Использование: медицина и медицинская техника, для синтеза пептидов с целью применения их либо для создания сорбента для избирательного связывания ЛПНП, либо для создания моделей искусственного рецептора путем гидрофобизации аффинного пептида и введения его в клеточные мембраны. Сущность изобретения: методом Pin technology на полипропиленовых иглах были синтезированы 70 коротких перекрывающихся пептидов и проверены методом ELISA на связывание с ЛПНП. Пептид N15(гексапептид 201 206, гептапептид (201 207) и октапептид (201 208) обладают высокой аро-В-связывающей активностью. Наибольшую активность имеет октапептид 201 208 CKDKSDEE. 2 з. п. ф-лы, 3 ил.

Изобретение относится к медицине и медицинской технике и может быть использовано для синтеза пептидов с целью применения их либо для создания сорбента для избирательного связывания ЛПНП, либо для создания моделей искусственного рецептора путем гидрофобизации аффинного пептида и введения его в клеточные мембраны. Выбор относительно коротких фрагментов рецептора, ответственных за связывание ЛПНП, позволит смоделировать функцию рецептора, выяснить какие аминокислотные остатки ответственны за максимальное связывание. Экспериментальная модель рецептора, полученная путем введения гидрофобизированного фрагмента рецептора в клеточные мембраны, позволит как увеличить ЛПНП связывающую способность клеточных поверхностей, так и провести поиск соединений, блокирующих связывание.

Изучение путей возникновения и лечения атеросклероза и связанных с ним заболеваний продолжает оставаться актуальной проблемой современной медицины. Ведущая роль в возникновении атеросклероза отводится нарушениям липидного обмена. К числу наиболее тяжелых форм заболевания относится наследственная (или семейная) гиперхолестеринемия (ГХС).

Липопротеины низкой плотности (ЛПНП) являются главными носителями холестерина в плазме. Повышенное содержание ЛПНП является одним из основных факторов риска развития атеросклероза. Уровень ЛПНП в крови в значительной степени зависит от функционирования специализированных белков-рецепторов, располагающихся на поверхности клеток. Активность ЛПНП-рецепторов регулируется потребностями клеток в холестерине. Частица ЛПНП содержит в своем составе крупную белковую молекулу, называемую апопротеином В (апоВ). Именно апоВ узнается рецептором и обеспечивает связывание частицы ЛПНП с клеткой.

Из литературных данных известно, что рецептор ЛПНП представляет собой трансмембранный гликопротеид с множественными цистеин-обогащенными повторами, снабжает клетки млекопитающих холестерином путем связывания и поглощения холестерин-обогащенных липопротеинов плазмы. 10 цистеин-обогащенных повторов во внеклеточном домене рецептора ЛНП разделяются на два класса. Кластер из семи цистеин-обогащенных повторов, расположенный около NН₂-конца (остатки 1-292), образует связывающий центр для липопротеинов. Каждый из этих повторов содержит шесть цистеинов и характеризуется наличием консервативной последовательности отрицательно заряженных аминокислот около СООН-конца. Эти повторы, пронумерованные 1-7, являются на 40-50% идентичными по последовательности. Роль цистеин-обогащенных повторов в рецепторе ЛПНП и других белках начинает проясняться благодаря сочетанию биохимических, генетических и молекулярных подходов. На сегодняшний день считается, что одной общей функциональной характеристикой этих повторов является их способность опосредовать белок-белковые взаимодействия. Для рецептора ЛПНП было показано, что семь повторов на NН₂-конце связывают два различных белка, апопротеин В-100 (апоВ-100) и апоЕ. АпоВ-100, гликопротеин из 4536 аминокислот, является единственным апопротеином ЛПНП. Связывание ЛПНП с рецептором, очевидно, включает ионное взаимодействие между кислыми аминокислотными остатками в повторах и кластерами основных аминокислот в аро В. Удаление первых пяти повторов уничтожало связывание апоВ. Различные точечные мутации в повторе 5 заметно сокращали связывание апоВ. Очевидно, что повторы NН₂-конца играют разную функциональную роль в связывании лигандов. Были произведены систематические серии мутаций, предназначенных для уничтожения функционирования каждого повтора: 1) каждый из семи повторов в лиганде-связывающем домене рецептора ЛПНП удалялся индивидуально; 2) консервативный остаток изолейцина в каждом из повторов замещался аспарагиновой кислотой; 3) консервативная аспарагиновая кислота в каждом повторе замещалась тирозином. Результаты исследования указывают на важную роль повторов 3-7 в связывании ЛПНП.

Анализ первичной структуры рецепторов ЛПНП из различных источников позволил определить консервативные участки последовательности и выявить отдельные аминокислотные остатки и фрагменты структуры, играющие существенную роль в связывании апо В. Наиболее важными из них являются помимо последовательностей, окружающих остатки цистеина, IIе-189 и Аsр-206. Интересным примером одного из этих уникальных остатков является глутаминовая кислота, следующая после последовательности Ser-Asр-Glu (SDE). Это создает ряд из трех отрицательно заряженных аминокислот (DЕЕ), следующих после консервативного серина, в то время как все другие повторы имеют только два (DЕ). Возможно, дополнительный отрицательно заряженный остаток в данном стратегическом положении вносит вклад в важное значение повтора 5. На основании анализа литературных данных нами был выбран фрагмент последовательности повтора 5, включающий аминокислотные остатки 187-212 для проведения работы по поиску минимального фрагмента ЛПНП-рецетора, обладающего лиганд-связывающей активностью.

Сущность изобретения заключается в том, что методом Рin technology на полипропиленовых иглах были синтезированы 70 коротких перекрывающихся пептидных последовательностей с помощью передвижения "рамки" из 4,5,6,7 и 8 аминокислотных остатков вдоль последовательности фрагмента рецептора из 26 аминокислот. Связывание полученных пептидов с ЛПНП было проверено методом ЕLISA, который показал, что пептид N15 (гексапептид (201-206), гептапептид (201-207) и октапептид (201-208)) обладает высокой апо-В-связывающей активностью к ЛПНП. Наибольшую активность имеет октапептид 201-208. Более короткие тетра- и пентапептиды были не эффективны в связывании.

Таким образом, техническим результатом изобретения является синтез методом Рin technology пептидов, ответственных за связывание лигандов в апоВ-рецепторе.

Другим техническим результатом является определение минимальных функционально важных лиганд-связывающих участков апоВ рецептора, что позволит осуществить синтез пептидов, моделирующих его функцию.

Синтез пептидов. Аминокислотная последовательность исследуемого пептидного фрагмента (187-212) в лиганд-связывающем домене апоВ-рецептора человека показана на рис.1. Октапептиды, последовательность которых получена движением рамки из восьми аминокислотных остатков вдоль последовательности исследуемого фрагмента, были синтезированы известным методом Рin technology. Перекрывающиеся пептиды обозначены номерами от 1 до 19 (фиг.1). Пептидные фрагменты, связанные с иглами, были синтезированы из пентафторфениловых эфиров F_moc-аминокислот. Полипропиленовые головки закрепляли на ножках в планшет для иммуноферментного анализа, состоящий из 96-ти лунок. Активированные эфиры F_moc-аминокислот, программа для проведения синтеза и обработки данных анализа фирмы Cambridge Research Biochemicals. Каждый пептид присоединен к полипропиленовой иголке с С-конца, количество каждого синтезированного пептида ≈20 нмолей.

На фиг.1 приведена аминокислотная последовательность пептидного фрагмента ЛПНП-рецептора, ответственного за связывание апоВ.

Анализ связывания пептидов с ЛПНП.

Липопротеины низкой плотности (d=1,019-1,063) выделяли из плазмы крови доноров, содержащей 1 мМ ЭДТА и 0,01% азид натрия, методом ультрацентрифугирования в градиенте плотности (40000 rрm, 20 ч, 14^оС, в Вeckman 40.3 роторе).

Для количественного определения аполипопротеина В использовали иммунотурбидиметрический тест (Bоehringer Маnnheim).

Связывание с липопротеинами низкой плотности пептидов, присоединенных к полипропиленовым подложкам, на которых проходил синтез, исследовались иммуноферментным известным методом. Головки полипропиленовых иголок, на которых присоединены синтетические пептиды, инкубировали при 25^оС в течение 1 ч с фосфатным буфером, содержащим 1% бычий сывороточный альбумин, для того, чтобы блокировать неспецифическое связывание. Затем головки инкубировались с ЛПНП или плазмой человека, разбавленными тем же буфером, в течение 1 часа при 37^оС, после чего отмывались 4х10 мин фосфатным буфером, содержащим 0,05% Твин 20 при 25^оС. Отмытые таким образом иглы инкубировали при 37^оС в течение 1 с антителами барана к апо В-100 человека, конъюгированными с пероксидазой из хрена (предоставлены лабораторией иммунохимии КНЦ). Иглы вновь отмывались как описано выше. Связавшиеся антитела обнаруживали реакцией с 200 мкл свежеприготовленного раствора субстрата (АВТS) в течение 15-20 мин. Последующее развитие сине-зеленой окраски измерялось при 405 нм с помощью прибора Мultiscan Рlus. Полученные значения двух параллельных определений для каждого пептида усреднялись. Для того, чтобы свести к минимуму неспецифическое связывание, анализ проводился при ненасыщающих концентрациях ЛПНП (2х10^-10 М) с использованием промывания 1% раствором гепарина после связывания лиганда иголками.

Для удаления связанных антител с полипропиленовых головок перед повторным анализом иглы обрабатывали ультразвуком в течение 30 мин водным раствором, содержащим 1% додецилсульфат натрия, 0,1% 2-меркаптоэтанол и 0,1 М фосфат натрия, рН 7,2, предварительно нагретым до 60^оС. Затем иголки последовательно промывали кипящей водой, кипящим метанолом и высушивали на воздухе.

На фиг. 2 представлены результаты анализа иммуноферментным методом связывания ЛПНП из плазмы крови человека синтезированными октапептидами, где А₄₀₅ оптическая плотность при 405 нм; концентрация ЛПНП в плазме крови человека 2х10¹⁰ М. Как видно из представленных данных пептид N 15 СКDКSDEE обладает наибольшей связывающей активностью. Аналогичные результаты получены для очищенных ЛПНП.

На фиг.3 представлен выбор минимального фрагмента, производного от пептида N 15 (201-208), обладающего ЛПНП-связывающей активностью, где А₄₀₅ оптическая плотность при 405 нм; концентрация ЛПНП в плазме крови человека 2х10^-10 М.

Для определения минимальной ЛПНП-связывающей последовательности были синтезированы 4-, 5-, 6- и 7-членные пептиды, производные от пептида N 15, и проведен иммуноферментный анализ связывания ЛПНП, результаты которого представлены на фиг.3. Четырех- и пятичленные пептиды проявляют очень незначительную связывающую способность, в то время как шести-, семи- и восьмичленные пептиды обладают высокой связывающей активностью по отношению к ЛПНП. Октапептид СКDКSDEE обнаруживает наиболее высокое сродство к лиганду по сравнению с гекса- и гептапептидами (фиг.3).

Таким образом, наши исследования позволили определить пептид структуры Сys-Lys-Аsр-Lys-Ser-Asр-Glu-Glu, обладающий высокой связывающей активностью по отношению к ЛПНП.

Формула изобретения

1. Пептид апоВ-рецептора, ответственный за связывание липопротеинов низкой плотности, имеющий следующую аминокислотную последовательность CKDKSDEE.

2. Пептид апоВ-рецептора, ответственный за связывание липопротеинов низкой плотности, имеющий следующую аминокислотную последовательность CKDKSDE.

3. Пептид апоВ-рецептора, ответственный за связывание липопротеинов низкой плотности, имеющий следующую аминокислотную последовательность CKDKSD.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3