Способ получения секрета слюнных желез кровососущих пиявок, обладающего способностью игибировать адгезию, агрегацию тромбоцитов, снижать реологические свойства крови и оказывать иммуностимулирующее действие

 

Изобретение относится к медицине, точнее к фармакалогии, и может быть использовано для биологических активных веществ из животного сырья, а именно из секрета слюнных желез пиявок. Способ заключается в том, что на головной конец зафиксированной пиявки кладут несколько кристалликов хлористого натрия и по истечении некоторого времени вводят в ротовую полость силиконированную пипетку с оттянутым концом содержащую физиологический раствор, и отсасывают секрет этой же пипеткой, повторяя процедуру несколько раз. 5 табл.

Изобретение относится к медицине, точнее к фармакологии, и может быть использовано для получения биологически активных веществ из животного сырья.

Секрет слюнных желез содержит ингибиторы протеолитических ферментов: бделлины, эглины, гирудин, ингибитор калликреина плазмы крови, фактора Хагемана, ингибиторы компонентов системы комплемента. В его составе соединения, активирующие аденилатциклазу мембран тромбоцитов и повышающие уровень ц-АМФ, фермент дестабилаза, коллагеназа, гиалуронидаза, дипаза и холестерин-эстераза.

Известен способ получения секрета слюнных желез кровососущих пиявок, который состоит в том, что половозрелую голодавшую пиявку кормят раствором хлористого натрия, содержащего 0,001 М арганина, до полного насыщения, затем через рот пиявки выдавливают секрет вместе с содержимым кишечных каналов. Секрет лиофилизируют, очищают гельфильтрацией и собирают фракции с молекулярной массой 2000 дальтон, (M. Rigbi-Comp. Biochem. Physiol, 1987, v 87B, w3 p567 прототип). Однако секрет, полученный по известному способу, содержит нерастворимые примеси, нуждается в центрифугировании, загрязнен аргинином и сильно разбавлен концентрация белка составляет не более 0,2% В основу изобретения была поставлена задача получения секрета слюнных желез пиявок большей чистоты, концентрации и количества, а также изучение его биологических свойств.

Это достигается путем осуществления способа получения секрета слюнных желез пиявок, при котором берут половозрелую кровососущую пиявку, голодавшую не менее 3 мес, фиксируют с помощью мягкого зажима, оставляя свободной головную часть тела, и последовательно обмывают водой и физиологическим раствором. На область головы пиявки пинцетом помещают от 2 до 12 кристалликов хлористого натрия. Спустя 1-5 мин вводят в ротовое отверстие пиявки силиконированную стеклянную пипетку с оттянутым тупым концом, содержащую 5-10 мкл физиологического раствора и отсасывают секрет той же пипеткой. Повторяют эту процедуру многократно. Получают примерно 50 мкл секрета в виде гомогенного, опалесцирующего раствора, который не нуждается в центрифугировании, свободен от экзогенных примесей аминокислот. Концентрация белка в растворе составляет 3-7 мг/мл.

П р и м е р 1. Голодавшую не менее 3 мес. половозрелую пиявку массой 1,8 г фиксируют с помощью мягкого зажима, оставляя свободной головную часть тела. Промывают последовательно водой и физиологическим раствором. На головной участок помещают 2-4 кристаллика хлористого натрия и через 1 мин вводят в ротовую полость пиявки силиконированную стеклянную пипетку с оттянутым концом, содержащую 5 мкл физиологического раствора. Этой же пипеткой отсасывают секрет слюнных желез. Повторяют эту процедуру. Собирают 15 мкл чистого бесцветного секрета с концентрацией белка 3 мг/мл и хранят при температуре 2-4^оС.

П р и м е р 2. Берут половозрелую голодавшую не менее 3 мес кровососущую пиявку массой тела 5 г. Фиксируют с помощью мягкого зажима и обмывают водой и физиологическим раствором. На головной участок пиявки помещают 7-9 кристалликов хлористого натрия и спустя 2 мин вводят в ротовую полость пиявки стеклянную силиконированную пипетку, содержащую 10 мкл физиологического раствора. Этой же пипеткой отсасывают секрет и повторяют процедуру. Собирают 25 мкл секрета с концентрацией белка 4 мг/мл.

П р и м е р 3. Половозрелую пиявку массой 9,8 г, голодавшую не менее 5 мес, фиксируют с помощью мягкого зажима, промывают водой и физиологическим раствором. На головную область тела помещают 10-12 кристалликов хлористого натрия и спустя 5 мин вводят в ротовую полость стеклянную силиконированную пипетку с оттянутым концом, содержащую 10 мкл физиологического раствора. Этой же пипеткой отбирают секрет слюнных желез. Повторяют процедуру дважды и собирают 30 мкл секрета слюнных желез пиявки с концентрацией белка 7 мг/мл. Хранят при температуре 2-4^оС.

В табл.1 представлены результаты изучения влияния секрета слюнных желез пиявок на адгезию тромбоцитов на поверхностях, покрытых фибриллярным коллагеном (метод сканирующей электронной микроскопии), и ингибирование агрегации тромбоцитов (фотометрический метод).

Гипотензивное действие секрета слюнных желез кровососущих пиявок исследовали на крысах гипертониках при внутривенном и внутрибрюшинном введении (по 300 мкл), контрольные животные получали равные дозы физиологического раствора. Регистрировали давление в хвостовой вене.

В табл. 2 представлены результаты этого исследования.

Результаты по изучению реологических свойств крови человека, стабилизированной секретом слюнных желез кровососущих пиявок при соотношении 1:9 (контроль гепарин), представлены в табл. 3.

В табл. 4 представлены результаты, демонстрирующие иммуностимулирующее действие полученного секрета в разведении 1:50 по реакции гиперчувствительности замедленного типа 23Т кожная проба, за 48 ч до иммунизации мышей СВА, ЭБ.

Влияние на показатель клеточного иммунитета изучали по ингибированию активности компонентов системы комплимента (по снижению гемолитической активности разбавленной сыворотки крови человека после внесения физиологического раствора (контроль) и секрета пиявки при объеме 1 и 5 мкл без предварительной инкубации (см. табл. 5).

Предложенный способ позволяет получить препарат широкого спектра действия с высоким выходом и чистотой.

Формула изобретения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СЕКРЕТА СЛЮННЫХ ЖЕЛЕЗ КРОВОСОСУЩИХ ПИЯВОК, ОБЛАДАЮЩЕГО СПОСОБНОСТЬЮ ИГИБИРОВАТЬ АДГЕЗИЮ, АГРЕГАЦИЮ ТРОМБОЦИТОВ, СНИЖАТЬ РЕОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА КРОВИ И ОКАЗЫВАТЬ ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ, путем химического воздействия на пиявку, отличающийся тем, что пиявку фиксируют, обмывают водой и физиологическим раствором, на головную часть тела кладут кристаллы хлористого натрия, спустя 1 5 мин вводят в ротовую полость пиявки пипетку, содержащую 5 10 мкл физиологического раствора и отсасывают секрет той же пипеткой.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2