Способ выделения рекомбинантного интерлейкина - 1 из биомассы микроорганизмов

 

Использование: биотехнология, фармацевтическая промышленность, медицина. Сущность изобретения: биомассу клеток рекомбинантного штамма E. coli, продуцирующего интерлейкин - 1β человека, обрабатывают гидроокисью натрия при pH 12 - 13, отделяют клеточный остаток, а из полученного супернатанта, не содержащего растворимых нуклеаз, целевой продукт получают путем хроматографической очистки, проводимой в три стадии, две из которых осуществляют с применением катионита Солоза КГ 20 · 30, а одну - с использованием анионита Q - целлюлоза. 8 з. п. ф-лы, 4 табл.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам получения белков генноинженерным методом, а точнее к технологии получения высокоочищенного интерлейкина I-β (ИЛ-I β).

В настоящее время известны методы получения ИЛ-1 β из культуральной среды клеток человека путем многостадийной очистки.

Недостатками известных способов являются низкий выход целевого продукта, а также относительно невысокая активность.

Для решения проблемы получения значительных количеств ИЛ-1 β разработаны технологии его получения путем экспрессии гена в генах микроорганизма с последующим разрушением клеток и выделением конечного продукта.

Недостатками данных методов являются сложная технология, низкий выход цитокинов.

Известен способ получения ИЛ-1 β путем культивирования Е.coli, разрушения клеток осмотическим шоком и хроматографической очистки.

Недостатком способа является потеря N-концевого аланина у 50% молекул и относительно невысокая удельная активность 1 ˙ 10⁸ единиц на мг белка.

Прототипом заявленного изобретения является способ получения рекомбинантного человеческого ИЛ-1 β, разработанного авторами, который включает в себя экспрессию гена в клетки E.coli, культивирование, отделение биомассы от культуральной жидкости центрифугированием, разрушение клеток ультразвуком, отделение клеточных стенок центрифугированием, осаждение нуклеиновых кислот полиэтиленимином, удаление нуклеиновых кислот центрифугированием, осаждение общего белка сульфатом аммония, отделение белкового осаждение общего белка сульфатом аммония, отделение белкового осадка центрифугированием, растворение белкового осадка, диализ белкового раствора и последующую многостадийную очистку хроматографическими методами.

Очистка включает в себя ионообменную хроматографию белкового раствора на катионите Солоза КГ 20 ˙ 30 с последующим диализом элюата. Затем используют высокоэффективную жидкостную хроматографию с применением анионита DEAE-TSK-5РW.

Недостатками прототипа являются многостадийность, потери ИЛ- β, относительно низкая удельная активность, необходимость перевода целевого продукта в физиологический буфер, вследствие чего метод не может быть использован в препаративных целях.

Задачей являлась разработка более технологического процесса, позволяющего получать целевой продукт с большим выходом и более высокой активностью.

Найдено, что технологию получения ИЛ-1β можно существенно упростить, использовав выделение ИЛ-1 β из клеток обработкой щелочным агентом при pH 12-13, изменив хроматографическую очистку и введя стадию обессоливания. В качестве щелочного агента, как правило, используют гидроокись натрия, однако возможно использование других веществ основного характера.

Хроматографическая очистка включает двухстадийную хроматографию на Солозе КГ 20 ˙ 30 и одну стадию очистки на Q целлюлозе. Обессоливание проводится на Солозе КГ 20 ˙ 30.

Технологически эффективны две последовательности стадий очистки, а именно на Солозе КГ 20*30 Q-целлюлозе Солозе КГ 20 ˙ 30 и Солозе КГ 20 ˙ 30 Солозе КГ 20 ˙ 30 Q-целлюлозе.

При первом варианте очистки хроматографический процесс проводится в следующих условиях: на первом этапе катионит уравновешивают 0,050 + 0,002 М трисацетатным буфером pH 4,10 + 0,05. Элюцию ИЛ-1 β осуществляют 0,050 + 0,002 М раствором трис(гидроксиметил)аминометана [трис] Затем продукт пропускают через анионит Q-целлюлоза, уравновешенный 0,010 + 0,002 М трисацетатным буфером pH 8,10 + 0,05 и элюируют ИЛ-1 β повышением ионной силы раствора до 0,050 + 0,002 М. На третьей стадии хроматографической очистки ИЛ-1β сорбируют на катионит Солоза КГ 20 ˙ 30 в присутствии 2,2 + 0,1 М сульфата аммония при pH 4,10 + 0,05. Элюируют ИЛ-1 β повышением pH элюирующего раствора до 7,90 + 0,05.

При втором варианте на первой стадии катионит Солоза КГ 20 ˙ 30 уравновешивают 0,050 + 0,002 М трисацетатным буфером pH 4,10 + 0,05. В раствор ИЛ-1 β добавляют сульфат аммония до концентрации 2,2+ 0,1 М и наносят на катионит. Элюируют ИЛ-1β 0,050 + 0,002 М трисацетатным буфером pH 7,90 + 0,05. Элюат подкисляют до pH 4,10-0,05 и наносят на катионит Солоза КГ 20 ˙ 30, уравновешенный 0,050 + 0,002 М трисацетатным буфером pH 4,10 + 0,05. Элюируют ИЛ-1β 0,050 + 0,002 М раствором триса. На третьей стадии хроматографической очистки ИЛ-1 β сорбировали на анионит Q целлюлоза, уравновешенный 0,050 + 0,002 М трисацетатным буфером pH 9,50 + 0,05. После промывки сорбента тем же буфером ИЛ-1 β элюируют 0,050 + 0,002 М трисацетатным буфером pH 8,00 + 0,05.

На стадии обессоливания ИЛ-1 β наносили на сорбент Солоза КГ 20 ˙ 30 при pH 4,10 + 0,05 и после промывки катионита 0,050 + 0,002 М раствором однозамещенного фосфата натрия pH 4,10 + 0,05 целевой продукт элюировали 0,050 + 0,002 М раствором двузамещенного фосфата натрия, содержащего 0,15 + 0,01 М хлористого натрия, получив таким образом готовый продукт в физиологическом буфере.

Технический уровень заявленного изобретения определяется условиями оригинального процесса обработки клеток Е.coli щелочью, который ранее для подобных целей не применялся. В результате указанного процесса получается раствор, обогащенный ИЛ-1 β и не содержащий растворимых нуклеаз.

Благодаря этому полученная смесь после отделения нерастворимых продуктов стандартным методом (например, центрифугированием) может подвергаться более простой хроматографической очистке. В частности, удается исключить стадии обработки биомассы ультразвуком, осаждения нуклеиновых кислот полиэтиленимином, сульфатаммонийного осаждения белкового осадка, диализа белкового раствора, многократных центрифугирований для отделения твердой фазы, использовать только два сорбента и получить готовый препарат в физиологическом буфере. Дополнительными элементами, доказывающими новизну и технический уровень данной технологии, является новая совокупность используемых сорбентов и условий очистки.

В результате использования заявляемого изобретения удается сократить число стадий с 13 до 7, повысить выход на 20% и удельную активность с 1 ˙ 10⁸ до 1,6 ˙ 10⁸ ед/мг белка.

Сущность и преимущества способа иллюстрируются следующими примерами, в которых использовались штамм Е.coli С 600, содержащий рекомбинантную плазмиду pFR-TGATG-IL-I β, и промышленные ионообменники, разработанные в ГосНИИ особо чистых препаратов.

П р и м е р 1. 600 + 20 г биомассы суспендировали в 600 + 20 мл 0,050 + 0,002 М трисацетатного буфера pH 8,0 + 0,1, содержащего 0,0020 + 0,0002 М PMSF и 0,0050 0,0005 М ЭДТА (лизисный буфер). Полученную суспензию подщелачивали при перемешивании 45 + 1% раствором гидроокиси натрия до pH 12,5 + 0,1 и инкубировали 20 + 2 мин. После этого суспензию подкисляли 1,0 + 0,1 М раствором соляной кислоты до pH 3,7 + 0,1 и отделяли нерастворимые продукты центрифугированием в течение 20 2 мин со скоростью 10000 + 100 g и температуре 4 + 2^оС.

Супернатант разводили в 1,5 раза дистиллированной водой до значения проводимости < 20 МСи/см и наносили на сорбент Солоза КГ 20 ˙ 30 объемом 150 + 10 мл, предварительно уравновешенный 0,050 0,002 М трисацетатным буфером pH 4,10 0,05. После промывки катионита тем же буфером ИЛ-1 β элюировали 0,050 + 0,002 М раствором триса.

Элюат подкисляли 50 + 1% раствором уксусной кислоты до pH 8,1, разводили дистиллированной водой в 2,5 раза до значения проводимости < 0,4 МСи/см и наносили на анионит Q целлюлоза объемом 150 + 10 мл, уравновешенный 0,010 + 0,002 М трисацетатным буфером pH 8,10 + 0,05. После промывки сорбента тем же буфером ИЛ-1β элюировали 0,050 + 0,002 М трисацетатным буфером pH 8,10 + 0,05.

К элюату добавляли сульфат аммония до концентрации 2,2 + 0,1 М и наносили на катионит Солоза КГ 20 ˙ 30 объемом 50 + 5 мл, предварительно уравновешенный 0,050 + 0,002 М трисацетатным буфером pH 4,10 + 0,05. После промывки сорбента 0,050 + 0,002 М трисацетатным буфером, содержащим 2,2 + 0,1 М сульфата аммония, ИЛ-1β элюировали 0,050 + 0,002 М трисацетатным буфером pH 7,90 + 0,05, содержащим 2,2 + 0,1 М сульфата аммония.

Элюат подкисляли до pH 4,10 + 0,05 50 1% раствором уксусной кислоты и с целью обессоливания наносили на катионит Солоза КГ 20 ˙ 30 объемом 50 + 5 мл, уравновешенный 0,050 + 0,002 М трисацетатным буфером pH 4,1 + 0,05. После промывки сорбента 0,050 + 0,002 М раствором однозамещенного фосфата натрия pH 4,10 + 0,05 ИЛ-1 β элюировали 0,050 + 0,002 М раствором двузамещенного фосфата натрия, содержащего 0,15 + 0,01 М хлористого натрия.

Активность полученного таким образом ИЛ-1 β составляла 1,6 ˙ 10⁸ единиц на мг белка (табл.1).

Для оценки биологической активности интерлейкина-1 β использован метод костимуляции пpолиферации тимоцитов мышей. В качестве стандарта для определения единиц биологической активности интерлейкина-1β использован международный стандартный образец интерлейкина-1β 86/680 (National Institute for Biological Standards and Control, England).

П р и м е р 2. В условиях примера I проводились эксперименты по проведению щелочной обработки при различных pH. Полученные результаты приведены в табл.2.

П р и м е р 3. 600 + 20 г биомассы суспензировали в 600 + 20 мл лизисного буфера. Полученную суспензию подщелачивали при перемешивании 45 + 1% раствором гидроокиси натрия до pH 12,5 + 0,1 и инкубировали 20 + 2 мин. Затем суспензию подкисляли 1,0 + 0,1 М раствором соляной кислоты до pH 3,7 + 0,1 и центрифугировали в течение 20 + 2 мин с ускорением 10000 + 100 g при 4 + 2^о.

Супернатант разбавляли в 1,5 раза дистиллированной водой до значения проводимости < 20 МСи/см и наносили на сорбент Солоза КГ 20 ˙ 30 объемом 150 + 10 мл, предварительно уравновешенный 0,05 + 0,002 М трисацетатным буфером pH 4,01 + 0,05. После промывки сорбента тем же буфером ИЛ-1 β элюировали 0,050+ 0,002 М раствором триса.

В элюате подводили pH до значения 8,10 + 0,05 50 +1% раствором уксусной кислоты, разбавляли в 2,5 раза дистиллированной водой до получения значения проводимости < 0,4 МСи/см и наносили на анионит Q-целлюлоза объемом 150 + 5 мл, уравновешенный 0,010 + 0,002 М трисацетатным буфером pH 8,10-0,05. После промывки сорбента 0,020 + 0,002 М трис- ацетатным буфером pH 8,10 + 0,05 ИЛ-1β элюировали 0,050 + 0,002 М трисацетатным буфером pH 8,10 + 0,05. В элюате растворяли сульфат аммония до концентрации 2,2 + + 0,01 М, подкисляли 50 + 1% раствором уксусной кислоты до pH 4,10 + 0,05 и наносили на сорбент Солоза КГ 20 ˙ 30 объемом 50 + 2 мл, уравновешенный 0,050 + 0,002 М трисацетатным буфером pH 4,10 + 0,05, содержащим 2,2 + 0,1 М сульфата аммония. После отмывки катионита 0,050 + 0,002 М раствором однозамещенного фосфата натрия pH 4,10 + 0,05 ИЛ-1 β элюировали 0,10 0,01 М раствором двузамещенного фосфата натрия.

Активность полученного препарата ИЛ-1 β соответствовала 1,3 ˙ 10⁸ единиц на мг белка.

П р и м е р 4. 600 + 20 г биомассы суспендировали в 600 + 20 мл лизисного буфера. Полученную суспензию подщелачивали 45 + 1% раствором гидроокиси натрия при перемешивании до pH 12,5 + 0,1 и инкубировали 20 + 2 мин. Затем суспензию подкисляли 1,0 + 0,1 М раствором соляной кислоты до pH 3,7 + 0,1 и центрифугировали в течение 20 + 2 мин с ускорением 10000 + +100 g при 4 + 2^оС.

В супернатанте растворяли сульфат аммония до концентрации 2,2 + 0,1 М и наносили на сорбент Солоза КГ 20 ˙ 30 объемом 150 + 10 мл, предварительно уравновешенный 0,050 + 0,002 М трисацетатным буфером pH 4,10 + 0,05. После промывки сорбента 0,050 + 0,002 м трисацетатным буфером pH 4,10 + 0,05, содержащим 2,2 + 0,1 М сульфата аммония, ИЛ-1 β элюировали 0,050 + 0,002 М трисацетатным буфером pH 7,90 + 0,05.

В элюате подводили pH значения 4,10 + 0,05 50 + 1% раствором уксусной кислоты и наносили на сорбент Солоза КГ 20 ˙ 30 объемом 50 + 5 мл, предварительно уравновешенную 0,050 + 0,002 М трисацетатным буфером pH 4,10 + 0,05. После промывки сорбента этим же буфером ИЛ-1β элюировали 0,050 + 0,002 М раствором триса, добиваясь таким образом и обессоливания препарата.

В элюате проверяли значение проводимости, которое не должно превышать 0,15 МСи/см, при необходимости подводили значение pH элюата до 9,50 + 0,05 и наносили на сорбент Q целлюлоза объемом 150 + + 10 мл, предварительно уравновешенный 0,050 + 0,002 М трисацетатным буфером pH 9,50 + 0,05. После промывки сорбента этим же буфером ИЛ-1 β элюировали 0,050 + 0,002 М трисацетатным буфером pH 8,00 + 0,05.

Элюат подкисляли до pH 4,10 + 0,05 50 1% раствором уксусной кислоты и наносили с целью обессоливания на сорбент Солоза КГ 20 ˙ 30 объемом 50 + 5 мл, уравновешенный 0,050 + 0,002 М трисацетатным буфером pH 4,10 + 0,05. После промывки сорбента 0,050 + 0,002 М раствором однозамещенного фосфата натрия pH 4,10 + 0,05 ИЛ-1 β элюировали 0,050 + 0,002 М раствором двузамещенного фосфата натрия, содержащего 0,15 + 0,01 М хлористого натрия.

Активность полученного таким образом ИЛ-1 β составляла 1,6 единиц на мг белка (табл.4).

Как показали приведенные эксперименты предложенная технология является оптимальной и позволяет получить целевой продукт, а именно высокоочищенный человеческий рекомбинантный интерлейкин с активностью 1,6 ˙ 10⁸ единиц на мг белка в препаративных масштабах в 7 стадий вместо 13.

Формула изобретения

1. СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ИНТЕРЛЕЙКИНА-1 β ИЗ БИОМАССЫ МИКРООРГАНИЗМОВ, включающий разрушение клеток штамма E.coli, продуцирующего рекомбинантный белок, отделение клеточных стенок и очистку целевого продукта многостадийной хроматографией с использованием на первой стадии катионита Солоза КГ 20 х 30, отличающийся тем, что разрушение клеток осуществляют щелочным агентом при рН 12 - 13, хроматографическую очистку проводят в три стадии, из которых одну осуществляют с использованием анионита Q - целлюлозы, а две - с применением катионита Солоза КГ 20 х 30, причем одну из двух стадий очистки на катионите проводят в присутствии сульфата аммония, а конечный продукт обессоливают.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве щелочного агента используют раствор гидроокиси натрия.

3. Способ по пп.1 и 2, отличающийся тем, что Q-целлюлозу используют на второй стадии хроматографической очистки, причем сорбцию интерлейкине-1 b ведут из (0,01 ± 0,002) М трисацетатного буфера при рН 8,1 ± 0,05, сорбент промывают тем же буфером, а белок элюируют повышением ионной силы буферного раствора до (0,05 ± 0,002) М при этом же значении рН.

4. Способ по пп. 1 - 3, отличающийся тем, что на первой стадии хроматографической очистки используют катионит Солозу КГ 20 х 30, причем сорбцию ведут из (0,05 ± 0,02) М трисацетатного буфера с рН 4,1 ± 0,05, сорбент промывают тем же раствором, а целевой продукт элюируют (0,05 ± 0,002) М раствором триса.

5. Способ по пп.1 - 4, отличающийся тем, что третью стадию хроматографической очистки осуществляют на катионите Солоза КГ 20 х 30, уравновешенном (0,05 ± 0,002) М трисацетатным буфером с рН 4,1 ± 0,05, сорбцию ведут из раствора интерлейкина - 1 b, содержащего (2,2 ± 0,1) М сульфата аммония, катионит промывают (0,05 ±0,002) М трисацетатным буфером, содержащим (2,2 ± 0,1) М сульфата аммония, при том же рН, а белок элюируют повышением рН раствора до 7,9 ± 0,05.

6. Способ по пп.1 и 2, отличающийся тем, что в неочищенный препарат интерлейкина-1 β вводят сульфат аммония до концентрации (2,2 ± 0,1) М, доводят рН до значения 4,1 ± 0,05 и наносят на сорбент Солоза КГ 20 х 30, уравновешенный (0,05 ± 0,002) М трисацетатным буфером с рН 4,1 ± 0,05, а после промывки сорбента (0,05 ± 0,002) М трисацетным буфером, содержащим (2,2 ± 0,1) М сульфата аммония, белок элюируют (0,05 ± 0,0002) М трисацетатным буфером с рН 7,9 ± 0,05, содержащим (2,2 ± 0,1) М сульфата аммония.

7. Способ по пп.1 и 2, отличающийся тем, что вторую стадию хроматографической очистки осуществляют на катионите Солоза КГ 20 х 30, уравновешенном (0,05 ± 0,002) М трисацетатным буфером с рН 4,1 ± 0,05, элюат, полученный на первой стадии, перед нанесением на сорбент подкисляют до рН 4,1 ± 0,05, сорбент промывают (0,05 ± 0,002) М трисацетатным буфером с рН 4,1 ± 0,05, а белок элюируют (0,05 ± 0,002) М раствором триса.

8. Способ по пп.1 и 2, отличающийся тем, что на третьей стадии хроматографической очистки используют Q-целлюлозу, уравновешенную (0,05 ± 0,002) М трисацетатным буфером с рН 9,5 ± 0,05, на которую наносят элюат, полученный на второй стадии, сорбент промывают (0,05 ± 0,002) М трисацетатным буфером с рН 9,5 ± 0,05, а интерлейкин элюируют (0,05 ± 0,002) М трисацетатным буфером с рН 8,0 ± 0,05.

9. Способ по п.1, отличающийся тем, что обессоливание проводят на катионите Солоза КГ 20 х 30, уравновешенном (0,05 ± 0,002) М трисацетатным буфером с рН 4,1 ± 0,05, на который наносят элюат, полученный на третьей стадии хроматографической очистки и подкисленный до рН 4,1 ± 0,05, сорбент промывают (0,05 ± 0,002) М раствором однозамещенного фосфата натрия с рН 4,1 ± 0,05, а белок элюируют (0,05 ± 0,002) М раствором двузамещенного фосфата натрия, содержащим (0,15 ± 0,01) М хлористого натрия.

РИСУНКИ

Рисунок 1