Способ получения полимера -оксимасляной кислоты

 

Использование: микробиологическая промышленность. Сущность изобретения: способ предназначен для получения гомополимера b-оксимасляной кислоты, являющейся разрушаемым экологически чистым термопластичным полимерным материалом. Способ позволяет повысить содержание полиоксибутирата в клетках штамма - продуцента, сократить сроки ферментации и расширить сырьевую базу для данной биотехнологии. Культуру штамма - продуцента засевают в жидкую солевую среду; процесс ферментации осуществляют в одну или две стадии при непрерывном перемешивании и аэрации культуры при 30^oС и pH 7,0. В качестве основных ростовых субстратов используют водород и углекислоту или ацетат. В качестве штамма - продуцента используют бактерии Alcaligenes eutrophus SVB - 5786, что позволило повысить выход полимера, сократить время ферментации при использовании непищевых субстратов.

Изобретение относится к микробиологической промышленности и предназначено для получения гомополимера β-оксимасляной кислоты (полиоксибутирата).

Полиоксибутират является термопластичным биодеградируемым полимерным материалом, имеющим широкие перспективы применения в качестве рассасываемого шовного материала, хирургических элементов для остеосинтеза, пролонгатора лекарственных веществ, нетоксичного обволакивателя семян, фруктов, удобрений, а также экологически чистого разрушаемого упаковочного материала и различной тары. Полиоксибутират способен синтезировать с различными выходами (от 5-10% до 60-80% к весу сухого вещества) многие прокариотические микроорганизмы, однако перспективными для применения считают три вида: Alcaligenes, Azotobacter, Methylobacterium (1-2).

Известен способ получения полиоксибутирата на основе одно- и двуступенчатой культуры Methylobacterium organophilum, штаммы NN 11482-11488, на метаноле. Ферментация реализуется при лимите азота в среде с затратами метанола 3,5-4,0 т/т полимера, содержание полиоксибутирата в клетках 30-50% (3).

Недостаток способа низкие выходы полиоксибутирата, большой расход высокотоксичного субстрата.

Известен способ получения полиоксибутирата на основе мутантного штамма Azotobacter 83 на средах с сахарами. Время ферментации составляет 96-129 ч, конечная концентрация полимера в клетках до 80% при затратах 2,8-2,7 т сахаров/т полимера (2). Недостаток способа длительная ферментация с высокими затратами пищевого сырья.

Известен способ получения полиоксибутирата на основе мутантных штаммов Alcaligenes latus, DSM NN 1122-1124 на средах с сахарозой и сульфатом аммония. Процесс реализуется при лимите азота в среде и рН-статировании; конечная концентрация полимера в клетках до 69-79% при затратах 2,3-3,3 т сахарозы/т полимера (4-5). Недостаток способа высокие затраты дефицитного пищевого сырья.

Известен способ получения полиоксибутирата на основе бактерий Alcaligenes eutrophus, штаммы Н-16 и АТСС, а также их мутантов, с использованием в качестве основного ростового субстрата сахарозы, фруктозы, глюкозы или сахарных сиропов (6-7). Время ферментации в периодическом режиме до 100 ч, в проточном при скорости протока среды 0,1 ч^-1 две недели; затраты сахаров до 3 т/т полимера, конечная концентрация полиоксибутирата в клетках от 50-60 до 70-80% Недостаток способа высокие затраты пищевых субстратов, длительная ферментация.

Известен способ получения полиоксибутирата, реализованный в промышленности и считающийся одним из лучших на основе мутантного штамма Alcaligenes eutrophus NClD 11599 при использовании в качестве основного ростового субстрата глюкозы. Ферментация проходит в два этапа: на первом при лимите фосфатов в среде в течение 60 ч осуществляют наращивание биомассы, на втором, не менее 48 ч в режиме с подпиткой глюкозой происходит максимизация накопления полимера в клетках. Общее время ферментации 110-120 ч конечная концентрация полимера в клетках 75% при затратах 3 т глюкозы/т полимера (8). Данный способ является прототипом изобретения.

Недостатками прототипа являются: высокие затраты пищевого сырья, длительная ферментация, не очень высокие выходы полимера.

Цель изобретения замена пищевого сырья и расширение сырьевой базы, сокращение длительности ферментации, повышение выхода полиоксибутирата.

Цель достигается в результате использования в качестве штамма продуцента бактерий Alcaligenes eutrophus ВКПМ В-5786, способного давать высокие выходы полиоксибутирата и использовать различные непищевые субстраты.

Существо способа заключается в культивировании штамма-продуцента при непрерывной аэрации и перемешивании на жидкой солевой среде при лимите азота в одну или две стадии в периодическом режиме при рН 7,0 и 30^оС с использованием в качестве основного ростового субстрата смеси водорода с двуокисью углерода или солей уксусной кислоты, или глицерина.

П р и м е р 1. Основная солевая среда содержит, г/л: Na₂HPO₄ ˙9 H₂O 9,5 KH₂PO₄ 1,5 MgSO₄ 0,2, а также 5 мл раствора железа лимоннокислого (5 г/л) и 3 мл стандартного раствора микроэлементов, содержащего, г/л: H₃BO₃ 0,228 CoCl₂ ˙6 H₂O 0,030 CuSO₄ ˙5 H₂O 0,008 MnCl₂ ˙4 H₂O 0,008 ZnSO₄ ˙7 H₂O 0,176
NaMoO₄ ˙2 H₂O 0,008
NiCl₂ 0,008
В качестве источника азота принята мочевина, которая готовится отдельно и с помощью перистальтического насоса-дозатора подается в ферментер в составе подпитывающего раствора. В качестве основного ростового субстрата используют газы: водород источник энергии, двуокись углерода источник углерода. Газовую смесь, содержащую (об.) водорода 70,0; кислорода 20,0 и двуокиси углерода 10,0 готовят в 50-литровом газгольдере.

В ферментер объемом 50 л, заполненный основной питательной средой (8-10 л) вносят инокулят штамма-продуцента и начинают ферментацию при непрерывном перемешивании, рН, равным 7,0 и 30^оС. Газовую смесь с помощью компрессора со скоростью 6 л/мин на 1 л непрерывно прокачивают через культуру. Культивирование проводят в периодическом режиме в две стадии. На первой стадии в течение 45 ч осуществляют режим с подпиткой субстратом. Подпитывающий раствор содержит мочевину в концентрации 8 г/л и сульфат магния 2 г/л. С помощью насоса-дозатора раствор непрерывно подается в ферментер. Скорость подачи компонентов составляет для мочевины и сульфата магния 400 и 100 мг/ч соответственно. На этой стадии происходит наращивание биомассы, концентрация полиоксибутирата в клетках не превышает 50% Вторая стадия продолжается в течение 30 ч при тех же параметрах ферментации, что и на первой стадии, но без подпитки. Конечная концентрация полиоксибутирата в клетках составляет 86% общее время ферментации 75 ч, затраты водорода и двуокиси углерода, соответственно, 1,0 и 1,8 г/г полимера.

П р и м е р 2. Культивирование штамма-продуцента проводят в ферментере объемом 50 л, состав газовой смеси, солевой среды и параметры процесса аналогичны примера 1. Объем культуры составляет 10 л, процесс реализуют в одну стадию в периодическом режиме с подпиткой субстратом. Подпитывающий раствор содержит (г/л) 4 мочевины и 1 сульфата магния; скорость поступления составляет 50,0 и 10,0 мг/ч для мочевины и сульфата магния соответственно. Время ферментации составляет 80 ч, конечная концентрация полимера 82% затраты водорода и двуокиси углерода, соответственно, 1,0 и 1,8 г/г.

П р и м е р 3. Культивирование штамма-продуцента осуществляют в два этапа: в проточном режиме и в периодическом с подпиткой субстратом. Состав газовой смеси, рН и температура среды, скорость подачи газов и перемешивание так как в примере 1. В основную солевую среду, аналогичную по содержанию фосфатов, сульфата магния и микроэлементов примеру 1, на первом этапе дополнительно вносят мочевину в концентрации 3, г/л и осуществляют проточно плотностатное культивирование при скорости протока среды 0,42 ч^-1 в течение 10 ч. На втором этапе проток среды прекращают и продолжают ферментацию в периодическом режиме с подпиткой, скорость поступления в ферментер мочевины и сульфата магния аналогична примеру 2. Время ферментации составляет 32 ч, конечная концентрация полиоксибутирата в клетках 80%
П р и м е р 4. Процесс ферментации штамма-продуцента осуществляют в 10-литровом ферментере на солевой основной среде, состав которой аналогичен примеру 1. В качестве основного ростового субстрата принят ацетат натрия, который дополнительно вносят в основную солевую среду в концентрации 3 г/л. В ферментер, содержащий 2 л среды, вносят инокулят штамма-продуцента. Культивирование проводят в периодическом режиме при непрерывном перемешивании, рН 7,0; 30^оС и непрерывной аэрации культуры воздухом с помощью компрессора со скоростью 6 л/мин на 1 л. В ферментер подается подпитывающий раствор, содержащий (в г/л) ацетат натрия 25, мочевину 5 и сульфат магния 1. Процесс проводится с использованием системы рН-статирования (для коррекции рН используют 0,7 М раствор уксусной кислоты) в течение 40 ч. Скорость поступления компонентов составляет для ацетата натрия, мочевины и сульфата магния, соответственно, 500, 100 и 20 мг/ч. Затем из подпитывающего раствора исключают мочевину и сульфат магния; процесс продолжают при сохранении параметров среды на прежнем уровне еще 35 ч. Общее время ферментации составляет 75 ч, концентрация полимера в клетках 78% затраты ацетата 3,0 г/г полимера.

П р и м е р 5. Ферментацию штамма-продуцента осуществляют в 10-литровом ферментере, заполненном 2 л среды, в две стадии. Исходная солевая среда аналогична примеру 1, но дополнительно в качестве основного ростового субстрата содержит глицерин в концентрации 2,0 г/л. Ферментацию проводят при 30^оС, рН 7,0, и аэрации воздухом (скорость прокачки через культуру составляет 6 л/мин л) в периодическом режиме в две стадии. На первой стадии подпитывающий раствор, содержащий глицерин, мочевину и сульфат магния в концентрации, равной 10,0, 5,0 и 1,0 г/л непрерывно подают в ферментер со скоростью, соответственно, для компонентов, 200,0, 100,0 и 20,0 мг/ч в течение 35 ч. На второй стадии подпитывающий раствор содержит только глицерин, его концентрация и скорость подачи аналогично первой стадии. Процесс продолжают 35 ч. Общее время ферментации составляет 70 ч, содержание полиоксибутирата в клетках 90% затраты глицерина 2,1 г/г полимера.

Предложенный способ позволяет при использовании различного непищевого сырья сократить время ферментации до 70-80 ч и получить высокие выходы полиоксибутирата (до 80-90%).

Формула изобретения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИМЕРА β -ОКСИМАСЛЯНОЙ КИСЛОТЫ, заключающийся в культивировании штамма-продуцента в условиях аэрации и перемешивания на жидкой солевой среде, содержащей ростовой субстрат, при лимите биогенного элемента, отличающийся тем, что в качестве штамма-продуцента используют штамм Alcoligenes eutrophus ВКПМ В-5786, ростового субстрата - водород и двуокись углерода, или соли уксусной кислоты, или глицерин, в качестве лимитирующего биогенного элемента - азот.