Способ получения бактериальных липополисахаридов

 

Использование: медицина, биотехнология, получение бакпрепаратов, конструирование диагностических тест-систем, химических вакцин и иммуномодуляторов. Сущность изобретения: способ включает получение микробной массы, горячую водно-фенольную экстракцию и дальнейшую очистку липополисахаридов (ЛПС) методом фазового распределения с использованием неионного детергента Тритона Х-114. Благодаря использованию Тритона Х-114 сокращается время очистки препарата от примесей нуклеиновых кислот, устраняется неблагоприятное воздействие повторных процедур лиофильной сушки, снижается себестоимость полученного ЛПС. Преимущества изобретения: повышение качества целевого продукта, упрощение способа и сокращение сроков очистки ЛПС.

Изобретение относится к медицине, а именно к получению бакпрепаратов, и может быть использовано для конструирования диагностических тест-систем, химических вакцин и иммуномодуляторов.

Известны способы получения разной степени очистки липополисахаридов (ЛПС): экстракцией клеток трихлоруксусной кислотой, водно-бутанольной, водно-эфирной смесями с последующей очисткой ЛПС от примесей нуклеиновых кислот и белков ультрацентрифугированием, обработкой протеазами и нуклеазами [1,2,3] Недостатком указанных способов являются невысокая степень очистки ЛПС, использование в ряде случаев летучих, ядовитых для человека веществ, продолжительность и многоэтапность процедуры очистки, использование дорогостоящего оборудования и химреактивов.

Наибольшее распространение имеет водно-фенольный способ получения ЛПС [4] Способ включает выделение микробной массы, обработку ее водно-фенольной смесью при 68^оС в течение 15 мин, отделение посредством центрифугирования и сбора водной фазы. Полученную водную фазу, содержащую ЛПС и нуклеиновые кислоты, лиофилизируют. Отделение ЛПС от нуклеиновых кислот проводят с помощью многократного ультрацентрифугирования (105000xg в течение 4 ч). Сформировавшийся в результате ультрацентрифугирования осадок растворяют в воде и подвергают повторному ультрацентрифугированию. Осадок растворяют в воде и лиофилизируют.

Окончательную очистку ЛПС от нуклеиновых кислот проводят, осаждая последние катионным детергентом бромистым цетилтриметиламмонием (цетавлон), ЛПС, очищенный с помощью ультрацентрифугирования, растворяют в воде и к перемешиваемому раствору прибавляют определенное количество 2%-ного водного раствора цетавлона. Помутневший раствор центрифугируют, осадок отбрасывают, а супернатант лиофилизируют. Сухой препарат растворяют в воде и освобождают от примесей цетавлона, осаждая ЛПС подкисленным этанолом или ацетоном. Осадок ЛПС отделяют центрифугированием, тщательно промывают 96%-ным спиртом или ацетоном, растворяют в воде и раствор лиофилизируют. Очищенный таким способом ЛПС не содержит нуклеиновых кислот.

Недостатками способа является сложность и продолжительность процесса очистки экстрагированного ЛПС от примесей нуклеиновых кислот (6 сут.), использование дорогостоящего оборудования (ультрацентрифуга), потери ЛПС на этапах ультрацентрифугирования и обработки цетавлоном, наличие нескольких процедур лиофилизации, что может значительно нарушать нативные свойства ЛПС (в первую очередь ухудшается растворимость целевого продукта).

Целью изобретения является упрощение и сокращение сроков получения ЛПС, избежание потерь и улучшения качества ЛПС.

Цель достигается тем, что при проведении способа получения ЛПС путем культивирования бактериальных клеток на твердой питательной среде с последующим отделением микробной массы, экстракцией из нее ЛПС горячей водно-фенольной смесью, очистку ЛПС от примесей нуклеиновых кислот осуществляют обработкой водной фазы неионным детергентом Тритон Х-114 в ледяной бане. Полученный раствор прогревают при 37^оС и центрифугируют для образования двух фаз: водной и детергентной. Такая обработка позволяет отделить ЛПС от примесей нуклеиновых кислот: ЛПС концентpиpуется в нижней детергентной фазе, а примеси нуклеиновых кислот остаются в водной. ЛПС выделяют из детергентной фазы осаждением холодным ацетоном. Образовавшийся осадок ЛПС собирают центрифугированием, промывают ацетоном для полного удаления примесей детергента, растворяют в воде и лиофилизируют.

Заявляемое техническое решение отличается от прототипа тем, что на этапе очистки используется неионный детергент Тритон Х-114.

Способ осуществляется следующим образом.

В качестве исходного продукта для получения ЛПС холерного вибриона используют взвесь микробных клеток возбудителя холеры штамма Vibrio cholerae 569 В. Культуру выращивают на казеиновом агаре рН 7,6 в течение 18 ч при 37^оС, смывают стерильным 0,9%-ным раствором хлорида натрия рН 7,2. В полученную взвесь добавляют свежеперегнанный фенол до конечной концентрации 1% и выдерживают 18 ч при 37^оС. Полученную микробную массу проверяют на стерильность и при отсутствии специфического роста микробные клетки отделяют центрифугированием, трижды отмывают стерильным 0,9%-ным раствором хлорида натрия рН 7,2, затем дистиллированной водой и лиофилизируют.

Далее микробную массу суспендируют в равных объемах воды и фенола при 68^оС в течение 15 мин, центрифугируют эмульсию 30 мин при 3000 об/мин после охлаждения до 10^оС. Водный слой собирают, а фенольный слой и нерастворимый остаток обрабатывают вторично с новой порцией воды, как описано выше. Объединяют водные экстракты, диализуют против воды для удаления фенола. Диализат, при необходимости, освобождают от нерастворимых веществ низкоскоростным центрифугированием и добавляют в него при 0-4^оС и постоянном перемешивании детергент Тритон Х-114 до конечной концентрации 6% Полученный раствор нагревают до 37^оС на водяной бане для разделения фаз и центрифугируют в течение 5 мин при 6000-8000 об/мин и температуре выше 25^оС. Фаза детергента образует маслянистый слой на дне пробирки и после удаления водной фазы детергентный слой смешивают с 1%-ным водным раствором Тритона Х-114 при 0-4^оС в соотношении 1:3 и повторяют процедуру для полного удаления примеси нуклеиновых кислот. ЛПС из детергентной фазы осаждают шестью объемами подкисленного ацетона, полученный осадок собирают центрифугированием, промывают ацетоном, растворяют в воде и лиофилизируют. Выход препарата составляет 18-25% от неочищенного водного экстракта (2-3% сухого веса бактерий). Полученный препарат является липополисахаридом не содержит примесей нуклеиновых кислот, в его состав входит 29% эквивалентов глюкозы (реакция с фенолом и концентрированной серной кислотой). Препарат вызывает сдвиг максимума поглощения карбоцианового красителя "Stainsall" ("Serva", ФРГ) в коротковолновую часть спектра, что характерно для ЛПС грамотрицательных бактерий. Препарат иммунохимически идентичен ЛПС, выделенному по способу-прототипу.

Преимущества предлагаемого способа: улучшение качества препарата (повышается растворимость в воде) за счет сокращения нескольких процедур лиофилизации; сокращается время очистки препарата от примесей нуклеиновых кислот с 6 дней до 1-го дня; снижается себестоимость полученного препарата.

Формула изобретения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЛИПОПОЛИСАХАРИДОВ, включающий культивирование микробной массы, отделение бактериальных клеток, обработку их водно-фенольной смесью, сбор водной фазы центрифугированием и очистку целевого продукта от примесей нуклеиновых кислот, отличающийся тем, что водную фазу при 0-4^oС обрабатывают детергентом Тритон Х-114 в конечной концентрации 6%, разделяют водную и детергентную фазы при 37^oС, собирают детергентную фазу, осаждают целевой продукт ацетоном, определяют осадок центрифугированием, промывают его ацетоном, растворяют в дистиллированной воде и лиофилизируют.