Способ получения дифтерийного токсина

 

Использование: биотехнология, вакцины, токсин, дифтерия. Сущность изобретения: для получения токсина используют штамм коринебактерий PN-8 или его варианты. Культивирование проводят в жидкой питательной среде с добавлением мальтозы или глюкозы. Культивирование осуществляют в условиях интенсивной аэрации, что обеспечивается подачей воздуха со скоростью 0,6 - 3 л/мин на 1 л среды. Скорость подачи воздуха постоянна в течение всего процесса культивирования. Парциальное давление растворенного в среде кислорода при этом составляет не менее 50% от полного насыщения. Дополнительно способ предусматривает внесение в культуральную среду в конце фазы экспоненциального роста бактерий глюкозы возрастающей дозой до получения конечной концентрации глюкозы в среде 0,3 - 0,8 %. Способ позволяет повысить выход целевого продукта за счет повышения интенсивности токсинообразования и получить стандартный препарат. Антигенная активность получаемого токсина не менее 180 - 200 ЛФ/мл. 1 з. п. ф-лы.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности, к технологии глубинного культивирования дифтерийного микроба и может быть использовано при изготовлении лечебно-профилактических и диагностических препаратов на основе дифтерийного токсина.

Известен способ получения дифтерийного токсина путем трехциклического комбинированного процесса культивирования дифтерийных коринебактерий, заключающийся в засеве каждого следующего цикла двенадцати часовой реакторной культурой предыдущего цикла с одновременным доращиванием каждого цикла. Препараты дифтерийного анатоксина, приготовленные из токсина, полученного данным методом культивирования, обладали высокой удельной активностью и выраженной иммуногенностью [1] Недостатком известного способа является большая трудоемкость, что делает невозможным использование его в промышленных условиях.

Известен также способ получения дифтерийного токсина, предусматривающий выращивание дифтерийных коринебактерий в жидкой питательной среде с добавлением углеводов (0,6) мальтозы или глюкозы, в условиях аэрации и перемешивания и регуляцией значений рН. В случае повышения рН свыше 8,2 после 20 24 ч роста добавляют 150 200 мл 40%-ного раствора стерильной глюкозы. После завершения процесса культивирования токсин отделяют от микробной массы [2] Этот способ является наиболее близким техническим решением к заявленному.

Однако известный способ не позволяет получить стандартный препарат со стабильными тиграми. Кроме того, выход токсина не достаточно высокий и составляет менее 150 ЛФ/мл.

Целью изобретения является разработка технологичного, оптимального в условиях производства, режима культивирования дифтерийных коринебактерий, позволяющего стабилизировать процесс токсинообразования и повысить выход целевого продукта.

Технический эффект изобретения заключается в повышении выхода целевого продукта за счет повышения интенсивности токсинообразования и получении стандартного препарата за счет стабилизации титров продуцируемого токсина. При этом способ легко реализуется в производстве, не требует переоборудования и смены персонала.

Сущность изобретения заключается в следующем: Для получения токсина используют штамм коринебактерий PW-8 или его варианты, например, Массачусетс. Культивирование проводят в жидкой питательной среде, к которой добавляют 0,6% мальтозы или глюкозы. Среда не должна содержать ингредиентов, которые могут оказаться и в готовом препарате и в отношении которых известно, что они токсичны или вызывают аллергические реакции у человека. Этому требованию удовлетворяет, например, бульон Лингуда.

Культивирование проводят, в отличие от известных способов, в условиях интенсивной аэрации, что обеспечивается подачей воздуха со скоростью 0,6 3 л/мин на 1 л среды. Скорость подачи воздуха постоянна в течение всего процесса культивирования. Парциальное давление растворенного в среде кислорода при этом составляет не менее 50% от полного насыщения.

При таком уровне аэрации наблюдается наибольшая токсигенная активность культуры. Титр токсина в культуральной жидкости составляет не менее 200 ЛФ/мл, что не было достигнуто ранее в известных способах.

Дополнительно к этому заявленный способ предусматривает внесение в культуральную среду в процессе культивирования, а именно, в конце фазы экспоненциального роста бактерий раствор глюкозы возрастающей дозой до конечной концентрации глюкозы в среде 0,3 0,8 Дополнительная подача глюкозы согласно изобретению также усиливает токсинообразование к приводит к стабилизации титров продуцируемого токсина.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

П р и м е р 1. В стандартный 70 л алюминиевый ферментер последовательно заливают 40 л бульона Лингуда, 600 мл 40%-го раствора мальтозы и 1-2 маточной шуттелированной культуры коринебактерий штамм PW-8.

Культивирование проводят при 35 37^оС и скорости подачи стерильного воздуха 0,6 л/мин, на 1 л среды, что создает давление кислорода на уровне 50% от полного насыщения.

Скорость подачи воздуха не изменяют в течение всего процесса культивирования.

Через 16 ч от начала культивирования, что соответствует концу фазы экспоненциального роста культуры, берут пробу из ферментера, определяют рН, количество микробных клеток в мл, количество флокулирующих единиц в мл (ФЛ/мл), готовят и просматривают микропрепараты дифтерийной культуры.

При отсутствии посторонней микрофлоры, микробном стандарте свыше 20 млрд микробных кл/мл и рН выше 7,5 добавляют 200 мл 40%-ного раствора глюкозы.

Через 20, 24, 28, 32 ч от начала культивирования взятие проб повторяют и снова проводят контроль процесса токсинообразования по указанным выше параметрам. Затем добавляют соответственно 300, 400, 500 и 600 мл 40%-ного раствора глюкозы.

Культивирование заканчивают через 36 ч от начала культивирования и переходят к отделению микробной массы от токсина.

Антигенная активность полученного токсина не менее 180 ЛФ/мл.

П р и м е р 2. В стандартный 70 л алюминиевый ферментер последовательно заливают 40 л бульона Лингуда, 200 мл 40%-ного раствора глюкозы и 1-2 л шуттелированной культуры коринебактерий штамм PW-8 вариант Массачусетс.

Культивирование ведут при 35 37^оС и скорости подачи стерильного воздуха 3 л/мин/л под контролем токсинообразования.

В конце фазы экспоненциального роста, через 16 ч от начала культивирования добавляют 300 мл 40% -ного раствора глюкозы. Далее глюкозу добавляют через каждые 4 ч в количестве 300, 400, 500 и 500 мл соответственно.

Культивирование продолжают в течение 36 ч.

Антигенная активность полученного токсина не менее 200 ЛФ/мл.

Формула изобретения

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИФТЕРИЙНОГО ТОКСИНА, включающий выращивание дифтерийных коринебактерий в жидкой питательной среде с добавкой мальтозы или глюкозы в условиях аэрации и перемешивания под контролем токсинообразования, внесение глюкозы в процессе выращивания с последующим отделением целевого продукта, отличающийся тем, что аэрацию обеспечивают подачей воздуха со скоростью 0,6 - 3 л/мин на 1 л среды для создания парциального давления растворенного кислорода не менее 50% от насыщения.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что глюкозу вносят в конце фазы экспоненциального роста возрастающими дозами до конечной концентрации в среде 0,3 - 0,8%.