Способ получения вакцины против колибактериоза сельскохозяйственных животных

 

Использование: биотехнология, вакцина против колебактериоза молодняка сельскохозяйственных животных. Сущность изобретения: в вакцину вводят адгезивные антигены К99, К88_ав, К88_ас, К88_ад, Г41,Атт25, 987Р, а также конъюгат термолабильного и термостабильного энтеротоксинов эшерихий. Предложенная вакцина найдет применение в хозяйствах, неблагополучных по колибактериозу, и позволит снизить заболеваемость новорожденных животных. 4 табл.

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, в частности к способам получения вакцин против колибактериоза молодняка с/х животных, и может найти широкое применение на предприятиях биологической промышленности при производстве вакцинных препаратов для профилактики колибактериоза.

Колибактериоз широко распространенное во всем мире инфекционное заболевание молодняка сельскохозяйственных животных, проявляющееся в виде диареи, сепсиса, сопровождающееся высокой заболеваемостью, смертностью и снижением привесов у переболевших животных.

Известен способ получения вакцины против колибактериоза поросят, включающий получение очищенных антигенов К99, К88, 987Р, F41 с последующим их объединением и добавлением адъюванта.

Имеется способ получения иммуногена для защиты от диареи, вызываемой энтеротоксигенными Е.coli, основанный на соединении термолабильного и термостабильного энтеротоксинов в присутствии конъюгационного агента.

Наиболее близким по технической сущности, выбранным в качестве прототипа, является способ получения вакцины против колибактериоза телят и поросят, включающий получение адгезивных антигенов К99 и К88, также термолабильного энтеротоксина с последующим добавлением адъюванта.

Цель повышение иммуногенных свойств вакцины, расширение профилактического спектра действия на различные разновидности возбудителей колибактериоза молодняка сельскохозяйственных животных: телят, поросят и ягнят.

Цель достигают тем, что дополнительно вводят штамм-продуценты адгезивных антигенов Атт25, 987Р, F41, вместо адгезина К88 используют три его сероварианта К88ав, К88ас, К88ад, а также штамм-продуцент термостабильного энтеротоксина, которые культивируют на бульоне Хоттингера, получают биомассу с концентрацией 50˙10⁹-100˙10⁹ бакт. тел/мл, из которой выделяют адгезивные антигены, инактивируют их 0,4% формалина и объединяют с конъюгированным энтеротоксином, полученным из штаммов-продуцентов термостабильного и термолабильного энтероток- синов в соотношении 1:2-1:1-2:1.

Вакцину готовят следующим образом.

Берут штаммы-продуценты адгезивных антигенов К99, F41, Атт25, 987Р, К88ав, К88ас, К88ад (референтные или полевые культуры Е.coli, реагирующие в реакции агглютинации со стандартными моноспецифическими антиадгезивными сыворотками в титрах 1: 320-1: 1280 и выше) и обладающие иммуногенными свойствами, засевают в бульон Хоттингера (или любую другую среду, способствующую экспрессии адгезивных антигенов). Культивирование проводят при 37-38^оС в течение 6-8 ч. Полученную бульонную культуру центрифугируют при 3000-5000 об/мин в течение 30-40 мин при 4-10^оС. Надосадочную жидкость удаляют, а осадок ресуспендируют в 1,5-2 М растворе фосфатно-мочевинного буфера до концентрации 50˙10⁹-100˙10⁹ микробных тел/мл. Полученную суспензию прогревают в водяной бане при 60-64^оС в течение 20-25 мин при периодическом встряхивании, после чего охлаждают и центрифугируют при 10000-15000 об/мин в течение 10-20 мин.

Надосадочную жидкость сливают в стерильную посуду, инактивируют путем добавления 0,3-0,4% формалина и выдерживают при 37-38^оС в течение суток.

Для получения комплексного препарата приготовленные указанным способом компоненты адгезинов К99, F41, Атт25, 987Р, К88ав, К88ас, К88ад смешивают в стерильной посуде в равных соотношениях.

В качестве продуцента термостабильного энтеротоксина используют эталонные или полевые штаммы Е.coli, дающие в тесте на новорожденных мышатах-сосунках коэффициент дилатации кишечника 0,1-0,2. В качестве продуцентов термолабильного энтеротоксина используют эталонные или полевые штаммы E.coli, дающие в пробе отека лап белых мышей коэффициент 70-90 мг.

Культивирование штаммов-продуцентов термостабильного и термолабильного энтеротоксинов осуществляют раздельно в бульоне Хоттингера при 37-38^оС в течение 18-24 ч. После этого бактериальную массу удаляют центрифугированием при 8000-10000 об/мин в течение 30-45 мин при 4^о-10^оС.

Из полученной надосадочной жидкости энтеротоксины осаждают сульфатом аммония при 60-65% насыщения для термостабильного и 85-90% насыщения для термолабильного энтеротоксина. После добавления сульфата аммония супернатант выдерживают при температуре 2-4^оС в течение 18-20 ч при шоттелировании, после чего подвергают его центрифугированию при 6000-8000 об/мин в течение 30-40 мин при 2-4^оС. Осадок термостабильного энтеротоксина ресуспендируют в 0,05 М трис-НСl буфере, а термолабильного в дистиллированной воде из расчета 1: 50 от начального объема с последующим диализом против дистиллированной воды в течение 24-48 ч. Далее смешивают термолабильный и термостабильный энтеротоксины в соотношении 100:1-99:2 в фосфатно-солевым буфере рН 7,0-7,2. К полученной смеси добавляют 25%-ный обычный стерильный раствор глутарового альдегида до конечной концентрации 2 г/л и выдерживают 1-2 ч при 20-25^оС. Конъюгационную смесь диализируют против фосфатно-солевого буфера при рН 7,0-7,2 в течение 18-20 ч 2-4^оС. Повторно диализ проводят против 0,05 М трис-НСl буфера в течение 18-24 ч и температуре 2-4^оС. После диализа в конъюгат добавляют раствор трис-НСl буфера, содержащий 1% бычьего сывороточного альбумина.

Для получения вакцины комплексный препарат адгезивных антигенов и конъюгат энтеротоксинов смешивают в равных соотношениях 1:1-1,1:0,9 и добавляют к смеси адъювант 6%-ный обычный раствор гидроокиси алюминия в количестве 30±1% от объема смеси.

Проверку на стерильность и безвредность проводят общепринятыми методами.

П р и м е р 1. Способ получения вакцины осуществляется как описано выше, но для получения отделенных от бактерий адгезивных антигенов используют биомассу с концентрацией 100˙10⁹ микробных тел/мл.

Полученный препарат при однократном введении белым мышам стимулирует выработку антител к адгезинам в титрах 1:160-1:640 (в РА) и антитоксинов 1: 4-1:8 (в РДП).

П р и м е р 2. Способ получения вакцины осуществляется как описано выше, но для получения отделенных адгезивных антигенов используют биомассу с концентрацией 75˙10⁹ микробных тел в мл.

Такой препарат при однократном введении белым мышам стимулирует выработку антител к адгезинам в титрах 1:640-1:1280 (в РА) и антитоксинов 1:4-1: 8 (в РДП).

П р и м е р 3. Способ получения вакцины осуществляется как описано выше, но для получения отделенных от бактерий адгезивных антигенов используют биомассу с концентрацией 50˙10⁹ микробных тел/мл.

Полученный препарат при однократной иммунизации белых мышей стимулирует выработку антител к адгезинам в титрах 1:320-1:1280 (в РА) и антитоксинов 1: 4-1:8 (в РДП).

Вакцина была испытана на лабораторных животных, а также на крупном рогатом скоте, овцах и свиньях. С целью получения колострального иммунитета у новорожденных животных беременных коров, овцематок и свиноматок за 1-1,5 месяца до родов иммунизировали вакциной двукратно, внутримышечно с интервалом 14-16 дней.

Вакцину вводят коровам в дозе 10-15 мл, свиньям в дозе 3-8 мл, овцам в дозе 2-5 мл. У двукратно иммунизированных животных брали пробы крови через 21 день после второй иммунизации, у коров и овец брали пробы молозива после отела и окота, у телят и ягнят пробы крови после рождения. В полученных сыворотках крови и молозива определяли титры антител к адгезивным антигенам и энтеротоксинам. Результаты приведены в табл. 1, 3, 4. Кроме того, для оценки колострального иммунитета проведены опыты по пероральному заражению новорожденных безмолозивных телят и ягнят вирулентными штаммами E.coli. С этой целью новорожденные ягнята сразу после рождения отделялись от овцематки и получали перорально суспензию суточной агаровой культуры вирулентного штамма E.coli 078:К80 или E.coli 09:K15:ЛТ⁺ в дозе 2˙10⁹ микроб.тел/мл. Через 5-6 ч ягнят подсаживали к матке для получения иммунного молозива. Аналогичный эксперимент был проведен с контрольными ягнятами от неиммунизированных овцематок.

Новорожденные телята после двух выпоек молозива получали перорально 30˙10⁹ бактериальных клеток штамма 09:К15:ЛТ⁺. Результаты приведены в табл. 2.

Результаты апробации свидетельствуют о том, что вакцина против колибактериоза новорожденных животных обладает высокими иммуногенными свойствами, обеспечивает создание напряженного колострального иммунитета и обладает протективными свойствами.

Сравнительный анализ заявляемого способа получения вакцины и прототипа показывает, что предлагаемая вакцина отличается тем, что в ее состав дополнительно вводятся новые адгезивные антигены Г41, Атт25, 987Р, а вместо одного адгезина К88 введены три его иммунологических варианта К88ав, К88ас, К88ад, а также конъюгированный энтеротоксин на базе термостабильного и термолабильного энтеротоксинов.

В предлагаемом способе получения вакцины против колибактериоза молодняка сельскохозяйственных животных используются наиболее важные факторы патогенности возбудителя (адгезивные антигены и энтеротоксины), которые регистрируются у эшерихий, вызывающих заболевание у телят, ягнят и поросят. Кроме того, конъюгация энтеротоксинов позволяет придать иммуногенность термостабильному энтеротоксину (гаптену по своей природе), который является ведущим фактором в патогенезе колидиарей телят и ягнят.

Вакцина, приготовленная по предлагаемому способу, позволяет профилактировать колибактериоз телят, ягнят и поросят, путем использования одного биологического препарата с высокими иммуногенными свойствами, что подчеркивает его перспективность и экономическую эффективность.

Предложенная вакцина найдет применение в неблагополучных по колибактериозу хозяйствах и позволит снизить заболеваемость новорожденных животных колибактериозом.

Формула изобретения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ КОЛИБАКТЕРИОЗА СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ, включающий отбор штаммов - продуцентов адгезивных антигенов К88, К99, 987Р и F41, культивирование их в жидкой питательной среде, отделение биомассы, выделение адгезивных антигенов, их объединение с последующим добавлением адъюванта, отличающийся тем, что дополнительно отбирают штамм - продуцент адгезивного антигена Атт 25, а из продуцентов антигенов К88 - продуценты антигенов К88ав, К88ас и К88ад, при этом отбирают все штаммы с титром антител в РА 1 : 320 - 1 : 1280, одновременно проводят отбор штаммов - продуцентов термостабильного и термолабильного энтеротоксинов с коэффициентом дилатации кишечника мышат-сосунков 0,1 - 0,2 и с коэффициентом в пробе отека лап 70 - 90 мг соответственно, после культивирования выделяют термолабильный и термостабильный энтеротоксины, конъюгируют их в соотношении 90 - 100 : 1 - 2 и полученный конъюгат объединяют с адгезивными антигенами в равных объемных соотношениях.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5