Способ получения иммобилизованных ферментов

 

Использование: в пищевой, химической, микробиологической промышленности, а также в медицинской и лабораторной практике. Сущность изобретения: предлагаемый способ получения иммобилизованных ферментов состоит в том, что органический носитель - хемосорбционное волокно на основе сополимера акрилонитрила с 2,5-винилпиридином (марка ВИОН АН-1) обрабатывают водными растворами различных ферментов - щелочная фосфатаза, пероксидаза, папаин, α -химотрипсин. Количество фермента, адсорбируемого волокном ВИОН АН-1 в зависимости от природы фермента, концентрации его в растворе и времени адсорбции, составляет 1,2 - 17 мг/г. Активность иммобилизованных ферментов составляет 45 - 75% от нативной величины в зависимости от природы наносимого фермента и используемого субстрата. Время полуинактивации 14 сут. и более. Предлагаемый способ позволяет проводить иммобилизацию различных классов ферментов на волокне, выпускаемом промышленностью, что делает его легко доступным, носитель не требует предварительной активации, а иммобилизованные ферменты сохраняют высокую активность и устойчивость.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу получения иммобилизованных ферментов, и может быть использовано в пищевой, химической, микробиологической промышленности, а также в медицинской и лабораторной практике.

Известен способ получения иммобилизованного фермента холинэстеразы, состоящий в том, что полимерный носитель типа Акрилекс С, полученный в результате частичного гидролиза шарикового сополимера акриламида и N,N'-метилен-бисакриламида типа Акрилекс Р кислотой или основанием и содержащий 5,4-6,8 мэкв/г функциональных СООН-групп, суспендируют в растворе с рН 7,0 и в суспензию при 0^оС добавляют карбодиимид хлоргидрата, необходимый для связывания фермента с карбоксигруппами, после чего в реакционную смесь добавляют холинэстеразу, растворенную в буферном растворе при 4^оС. Смесь выдерживают при 0-4^оС в течение 48 ч. Гель выделяют фильтрацией, промывают, высушивают замораживанием [1] Недостатками этого способа являются необходимость предварительного активирования носителя, проведение процесса при низких температурах (0-4^оС), длительность процесса.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату к предлагаемому является способ получения иммобилизованной монофенол-монооксигеназы, состоящий в том, что аминосодержащее полиакрилнитрильное волокно с обменной емкостью 2-3 ммоль/г обрабатывают культуральным фильтратом базидиального гриба Coriolus hirsutus c активностью 1,48 ед/мг белка в течение 30 мин при 18^оС, продукт отмывают дистиллированной водой. Получают препарат с активностью 4,17 ед/г волокна (90% от исходной). Спад активности за 7 циклов на 30% [2] Известным способом проведена иммобилизация только одного фермента- монофенол- монооксигеназы. Нет указаний на происхождение волокна, имеет ли оно промышленную марку. Приведенная в прототипе величина активности (80-90%) иммобилизованной монофенол-монооксигеназы противоречит приведенной там же устойчивости и стабильности, высокая активность иммобилизованных ферментов свидетельствуют о малой прочности связи. В прототипе не указано, какие именно аминные группы волокна принимают участие в процессе.

Предлагаемый способ иммобилизации ферментов состоит в том, что водным раствором фермента обрабатывают органический носитель хемосорбционное волокно на основе сополимера акрилонитрила с 2,5-винилпиридином.

Предлагаемый способ отличается тем, что в качестве носителя используют хемосорбционное волокно на основе сополимера акрилонитрила с 2,5-винилпиридином, содержащее координационно-активные пиридиновые группы в структуре полимера.

Установлено, что предлагаемое волокно с обменной емкостью 2,5-3,5 ммоль/г имеет поверхность 150-180 м²/г и способно иммобилизовывать ферменты, принадлежащие к различным классам щелочную фосфатазу, пероксидазу, папаин, α-химотрипсин.

Количество фермента, адсорбируемого предлагаемым волокном в зависимости от природы фермента, концентрации его в растворе и времени адсорбции, составляет 1,2-17 мг/г. Активность иммобилизованных ферментов составляет 45-75% от нативной величины в зависимости от природы наносимого фермента и используемого субстрата. Время полуинактивации 14 сут и более, что вдвое превышает время полуинактивации фермента в растворе. Значительно повышается термостабильность иммобили- зованного фермента по сравнению с ферментом в растворе. Не отмечено снижения активности при многократном проведении процесса на иммобилизованных ферментах. Предлагаемое волокно имеет промышленную марку ВИОН АН-1. Это позволяет упростить технологию процесса, волокно легко доступно, механически прочное, устойчиво в агрессивных средах, имеет хорошие гидравлические характеристики, процесс протекает с высокой скоростью и не требует дополнительной активации. Значительные количества адсорбированных ферментов позволяют считать способ адсорбции на волокне ВИОН АН-1 перспективным для извлечения ферментов в промышленном производстве.

П р и м е р 1. 100 мг волокна ВИОН АН-1 обрабатывают раствором щелочной фосфатазы из кишечника цыплят с удельной активностью 8-9 ф.ед./мг. Связывание с носителем осуществляют адсорбцией из 0,05 М раствора трис-HCl буфера рН 7,2. Количество иммобилизованного фермента определяют по уменьшению концентрации контактного раствора. Время контакта от 35 мин до 7 сут. После адсорбции носитель с иммобилизованным ферментом промывают буферным раствором до полного исчезновения фосфатазной активности в промывных водах. Процент адсорбции 40-65% емкость 9,0 мг фермента/г волокна при концентрации щелочной фосфатазы 2,5 мг/мл. Активность иммобилизованной щелочной фосфатазы в реакции гидролиза динатриевой соли п-нитрофенилфосфата 42,1 ед/г волокна или 58,5% от нативной величины. Время полуинактивации 14 сут.

П р и м е р 2. 100 мг волокна ВИОН АН-1 обрабатывают 10 мл раствора пероксидазы из хрена с концентрацией 0,02 мг/мл в 0,1 М ацетатном буфере рН 4,6 и выдерживают 35 мин при температуре 20^оС. После окончания адсорбции волокно промывают буферным раствором до исчезновения активности в промывных водах. Адсорбируется 1,26 мг пероксидазы на 1 г волокна или 63,4% от концентрации в растворе. Активность иммобилизованной пероксидазы определяют в реакции окисления иодид-ионов перекисью водорода. Активность иммобилизованного фермента составляет 72% от нативной величины.

П р и м е р 3. 72,2 мг волокна ВИОН АН-1 обрабатывают 1 мл раствора папаина с концентрацией 0,833 мг/мл, выдерживают 30 мин при 20^оС. Процент адсорбции 100% Количество адсорбированного папаина 11,54 мг/г волокна. Для определения активности к 1,8 мл 0,1 М фосфатного буфера рН 6,85, содержащего 0,3 мМ ДТТ и 0,1 мМ ЭДТА добавляют 50 мкл раствора коммерческого субстрата Gly The Ala pNa с концентрацией 10 мг/мл, термостатируют 5 мин при 35^оС, после чего вносят иммобилизованный фермент. Активность иммобилизованного фермента папаина 45,7% от нативной величины. Время полуинактивации 16 сут.

П р и м е р 4. Адсорбцию папаина на волокне ВИОН АН-1 проводят, как в примере 3. Концентрация папаина в растворе 2,5 мг/мл. Величина адсорбции 17 мг/г волокна. Десорбция иммобилизованного папаина в жестких условиях (раствор 2 М хлорида натрия с 20% изопропанола) не превышает 8-10% что указывает на высокую устойчивость иммобилизованного фермента.

П р и м е р 5. К 0,1103 г волокна ВИОН АН-1 приливают раствор α-химотрипсина с концентрацией 1 мг/мл и трис-HCl буфер рН 8,0. Спустя 1 ч адсорбируется 3,35 мг/г волокна или 37% спустя 5 сут. 5,7 мг/г или 63% Активность иммобилизованного α-химотрипсина, измеренная по превращению коммерческого препарата Pyr, Phe, pNA, составляет 35-42% от нативной величины.

П р и м е р 6. Иммобилизацию α-химотрипсина проводят также, как в примере 5, предварительно выдерживая волокно в растворе трис-HCl буфера рН 8,0 7 сут. Адсорбция 81% или 7,32 мг/г волокна. При 55^оС константа скорости дезактивации на порядок ниже, чем для фермента в растворе.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет провести иммобилизацию различных классов ферментов на волокне, выпускаемом промышленностью, что делает его легко доступным, носитель не требует предварительной активации, а иммобилизованные ферменты сохраняют высокую активность и устойчивость.

Формула изобретения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ ФЕРМЕНТОВ путем обработки органического носителя водным раствором фермента, отличающийся тем, что в качестве носителя используют хемосорбционное волокно на основе сополимера акрилонитрила с 2,5-винилпиридином.