Способ получения рекомбинантного тимозина 1 человека

 

Использование: биотехнология. Сущность изобретения: получение гибридного белка не менее 99% чистоты путем трансформации штамма E. coli SG 20050 плазмидной pThy 315, кодирующей гибридный белок α -фактор некроза опухолей- тимозин a₁ Культивирование трансформантов проводят в жидкой питательной среде, выделение, расщепление гибридного белка бромцианом - в среде муравьиной и трифторуксусной кислот. Полученные после выделения тельца включения отмывают растворами 1 - 3 М мочевины и водой, отделение тимозина от белковых компонентов гидролиза осуществляют изменением pH среды до 5 - 6 и удалением формирующегося осадка. Тимозин очищают последовательно ситовой, ионообменной и обращенной фазовой хроматографией, причем для ситовой хроматографии используется носитель типа "сефадекс G-25", для ионообменной - носитель типа DE, DEA или DEAE при pH 6,8 в натрий-фосфорном буфете, содержащем 10% ацетонитрила, а для обращенно-фазовой - носитель типа 08-С18 с элюцией продукта градиентом ацетонитрила в присутствии 0,1% трифторуксусной кислоты.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности, к способу микробиологического синтеза в клетках Escherichia coli рекомбинантного пептида со свойствами тимозина α ₁ человека.

Известен способ получения тимозина α₁ путем крупномасштабной экстракции пептидов из тимуса теленка с последующим хроматографическим выделением целевого пептида [1] Недостатком этого способа является необходимость забоя большого количества новорожденных телят, так как наибольшее содержание тимозина α₁ в тимусе приходится на возраст телят до 6 месяцев и составляет около 10 мг/кг железы. С увеличением возраста животных содержание тимозина а резко снижается, достигая менее 1 мг/кг. Кроме того для получения достаточно чистого пептида необходимо многократное использование хроматографических методов, что значительно усложняет технологию.

Известен способ получения рекомбинантного тимозина α₁ из гибридного белка с β -галактозидазой, кодируемого плазмидой pThα₁ β gal с промотором LacUY5 в штамме 294 Е.сoli. Гибридный белок расщепляли бромцианом в 88%-ной муравьиной кислоте, и выделяли тимозин α₁ последовательными хроматографиями на DE-52, гельфильтрацией и на С-18 сорбенте. Выход тимозина α₁ составлял 1 мг/л культуральной среды или 400 мкг/г клеток [2] Известен наиболее близкий к предлагаемому способ получения тимозина α₁ с использованием рекомбинантной плазмиды pThy314, кодирующий синтез гибридного белка ФНО-тимозин- α₁, от которого тимозин может быть отщеплен бромциановым гидролизом, и штамма E.coli SG20050 (pTh314), обеспечивающего уровень экспрессии гибридного белка, эквивалентный 8-10 мкг тимозина на 1 мл клеточной сусепензии при плотности 10⁹ клеток/мл [3] Недостатками способа, описанного в прототипе, являются: наличие в цитоплазматичеких тельцах включения клеток наряду с гибридным белком ФНО-тимозин в равном по массе количестве белка хлорамфениколацетилтрансферазы, что существенно затрудняет процесс очистки гибридного белка; кроем того плазмида pThy 314 нестабильна при хранении штамма SG20050 (pThy314) на плотных питательных средах, что приводит к низкому уровню синтеза гибридного белка; гибридный белок в 80% муравьиной кислоте и 0,1%-ном бромциане расщепляется на 50-60% что снижает выход тимозина α₁ Задачей изобретения является создание более продуктивного и простого способа получения рекомбинантного тимозина α₁.

Поставленная задача решается тем, что предложен способ получения рекомбинантного тимозина α₁ человека, включающий трансформацию штамма Escherichia coli SG20050 плазмидой, кодирующей гибридный белок α -фактор некроза опухолей-тимозин-α₁ культивирование трансформанта в жидкой питательной среде, выделение и расщепление гибридного белка бромцианом в среде муравьиной кислоты, отделение тимозина α₁ от белковых компонентов гидролиза и его хроматографическую очистку, причем для трансформации используют плазмиду рThy315, полученные после выделения тельца включения отмывают 1-3 М растворами мочевины и водой, а расщепление гибридного белка проводят в присутствии 0,1 М трифторуксусной кислоты, отделение тимозина от белковых компонентов гидролизата осуществляют изменением рН среды до 5-6 и удалением формирующегося осадка, хроматографическую очистку целевого продукта осуществляют последовательно на Сефадексе G-25, на ионообменном сорбенте типа ДЕА при рН 6,8, в натрий-фосфатном буфере, содержащем 10% ацетонитрила, и обращеннофазовой хроматографией на сорбенте типа С₈-С₁₈ с элюцией тимозина α₁ градиентом ацетонитрила в пределах 16-25% в присутствии 0,1% трифторуксусной кислоты.

При этом достигаются следующие технические результаты: в клетках Е. соli синтезируется единственный мажорный гибридный белок, что облегчает процесс очистки; гибридный белок воспроизводимо получают в виде нерастворимого осадка около 70% чистоты; использование смеси муравьиной и трифторуксусной кислот позволяет растворить гибридный белок и увеличить эффективность его бромоцианового гидролиза до 90% что не достигается использованием указанных кислот раздельно; хроматография гидролизата на геле типа Сефадекс G-25 приводит к эффективному отделению от тимозина значительной доли примесей, что позволяет, в свою очередь, сконцентрировать фракции тимозина простым упариванием раствора под вакуумом, уменьшить объем хроматографических колонок на последующих стадиях, и следовательно, ускорить и удешевить разделение на них; применяемая на последней стадии хроматографическая система содержит летучие компоненты, удаляемые простым упариванием под вакуумом и не требующие дополнительных стадий переведения продукта в форму свободной кислоты.

Предложенный способ очистки позволяет получить дезацетилмозин α₁ не менее 99% чистоты по данным электрофореза и ВЭЖХ. Выход тимозина в расчете на 1 г слитого белка не уступает описанному в прототипе. Общая экономия времени на один цикл выделения составляет не менее 12-14 ч; в целом, предложенный способ является более продуктивным, быстрым и технологичным.

П р и м е р. Получение тимозина α₁ микробиологическим синтезом в клетках Е.соli.

Плазмидную ДНК рТУ315 трансформируют в компетентные клетки штамма Е.соli SG20050. Трансформированные клетки засевают в бульон, содержащий 50 мкг/мл ампициллина и культивируют при 37^оС в течение 18-20 ч. Выращенные клетки анализируют на наличие гибридного белка в 15% ПААГ-ДСН. Клетки штамма SG20050 с плазмидой рТhy315 осаждают центрифугированием при 3000 g в течение 10 мин. Бульон сливают, клетки суспендируют в лизирующем буфере, содержащем 20 мМ трис-НСl, рН 7,5 мМ Na₂ ЭДТ и 1 мМ фенилметилсульфонилфторида, из расчета на 1 г клеток 10 мл буфера. Клетки разрушают каким-либо способом (например: замораживанием-оттаиванием или ультразвуком, импульсами по 40 с три раза, или продавливанием в замороженном состоянии через фильеру в French-прессе или Х-прессе). Лизат центрифугируют 10 мин при 4^оС, 5000g. Надосадочную жидкость сливают, к остатку добавляют раствор 1 М мочевины из расчета 10 мл на 1 г клеток, интенсивно перемешивают. Повторяют центрифугирование. Супернатант сливают, осадок суспендируют в растворе 2 М мочевины того же объема. Повторяют ценрифугирование. Супернатант сливают. Осадок влажного белка промывают таким же способом водой.

Осадок растворяют в 70% муравьиной кислоте, добавляют 10% по объему 1,1 М трифторуксусной кислоты и бромциан из расчета 20 мл раствора муравьиной кислоты и 0,1 г бромциана на 1 г влажного осадка. Расщепление проводят при комнатной температуре в течение суток. После этого гидролизную смесь разводят пятью объемами воды и упаривают на роторном испарителе при 40^оС, повторяя разведение и упаривание 2-3 раза. Раствор нейтрализуют с помощью 1М едкого натра или 30% раствора аммиака до достижения рН 5-6. Выпавший осадок отделяют центрифугированием, а супернатант упаривают на роторном испарителе при 40^оС и наносят на колонку с 150 мл сефадекса G-25. После элюции водой со скоростью 2 мл/мин вещество первого пика собирают, упаривают на ротором испарителе под вакуумом при 40^оС до объема 1-2 мл и наносят на высокоэффективную анионообменную колонку "Силасорб ДЕА" 8 ч 250 мм (производство СП "Биохиммак", г. Москва), уравновешенную 100 мМ натрий-фосфатным буфером, рН 6,8, содержащим 10% ацетонитрила. Элюируют колонку этим буфером со скоростью 2 мл/мин с детекцией при 225 нм. Тимозину на хроматограмме соответствует основной пик, вещество которого собирают, концентрируют упариванием под вакуумом при 40^оС до начала кристаллизации содержимого и обессоливают на колонке с сефадексом G-25. Фракции тимозина собирают, концентрируют упариванием, как описано выше, до объема 0,5-1 мл и хромотографируют на высокоэффективной колонке "Диасорб С-16" 4х25 мм (производство СП "Биохиммак", г. Москва) в системе с обращенной фазой в градиенте 16-25% в присутствии 0,1% трифторуксусной кислоты со скоростью элюции 1 мл/мин. Фракции основного пика, составляющие болмее 80% от общей оптической плотности нанесенного вещества, концентрируют упариванием под вакуумом при 40^оС и лиофилизируют. Получают хромотографически и электрофоретически (при анализе в СДС-ПА-АГ) гомогенный препарат. Наличие на N-конце олигопептидной цепи осадка серина, а также соответствие аминокислотного состава ожидаемому подтверждают аминокислотным анализом выделенного рекомбинантного тимозина. Результаты определения аминокислотного состава продукта после гидролиза 6 н НСl с добавкой 0,2% фенола при 110оС в течение 24 ч на анализаторе "Alpha Plus" (LKB) следующие: Asp 4,64 (4); Thr 2,86 (3); Ser 2,86 (3); Glu 6,78 (6); Ala 3,0 (3); Val 3,03 (3); Cys 4,30 (4); Leu 2,3 (2).

Формула изобретения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ТИМОЗИНА α₁ ЧЕЛОВЕКА, включающий трансформацию штамма Escherichia coli SG 20050 плазмидой, кодирующей гибридный белок α- фактор некроза опухолей - тимозин α₁ , культивирование трансформанта в жидкой питательной среде, выделение и расщепление гибридного белка бромцианом в среде муравьиной кислоты, отделение тимозина α₁ от белковых компонентов гидролизата и его хроматографическую очистку, отличающийся тем, что для трансформации используют плазмиду pThy 315, полученные после выделения тельца включения отмывают 1 - 3 М растворами мочевины и водой, а расщепление гибридного белка проводят в присутствии 0,1 М трифторуксусной кислоты, отделение тимозина от белковых компонентов гидролизата осуществляют изменением pH среды до 5 - 6 и удалением формирующегося осадка, хроматографическую очистку целевого продукта осуществляют последовательно на Сефадексе G-25, на ионообменном сорбенте типа ДЕА при pH 6,8 в натрийфосфатном буфере, содержащем 10% ацетонитрила, и обращеннофазовой хроматографией на сорбенте типа С₈ - С₁₈ с элюцией тимозина α₁, градиентом ацетонитрила в пределах 16 - 25% в присутствии 0,1%-ной трифторуксусной кислоты.

MM4A - Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 30.07.2008

Извещение опубликовано: 20.07.2010        БИ: 20/2010

---